Name: purification of human s100a12 and its ion-induced oligomers for immune cell stimulation
Uploaded: 2019-09-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation at JoVE.com

Denne studien ble støttet av tilskudd fra intramural innovative medisinske forskningsprogram av Muenster University medisinsk fakultet (KE121201 til C.K.) og den tyske Research Foundation (DFG, Fo354/3-1 til D.F.).

Merk: Vennligst referer til supplerende tabell 1 for utarbeidelse av buffere og lager løsninger.
1. protein uttrykk i E. coli
<ol><li>
Kloning
	<ol>
<li>Klon tag-ledig Human S100A12 (NCBI henvisning orden: NP_ 005612.1) i bakteriell gjengivelsen vektor pET11b. For å uttrykke proteinet, forvandle konstruere til E. coli BL21 (DE3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kultur
	<ol>
<li>Forbered en for rett kultur ved å ...

<ol>
	<li>Liston, A., Masters, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostasis-altering+molecular+processes+as+mechanisms+of+inflammasome+activation.">Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).</li><li>Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocyte-derived+S100+proteins+in+autoinflammation:+putative+role+in+pathogenesis+and+usefulness+as+biomarkers.">Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers.</a> Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).</li><li>Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+circular+dichroism+studies+of+iron(ii)+binding+to+human+calprotectin.">Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin.</a> Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).</li><li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein.">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).</li><li>Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nickel+Sequestration+by+the+Host-Defense+Protein+Human+Calprotectin.">Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).</li><li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12.">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex:+implications+for+host-parasite+defence.">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li><li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc:+new+insights+into+S100A12+oligomerisation.">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).</li><li>Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+human+(S100A8/S100A9)2+heterotetramer,+calprotectin,+illustrates+how+conformational+changes+of+interacting+alpha-helices+can+determine+specific+association+of+two+EF-hand+proteins.">The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+Ca2++and+Zn2++are+essential+for+S100A12+protein+oligomerization+and+function.">Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function.</a> BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).</li><li>Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ions+binding+to+S100+proteins.+I.+Calcium-+and+zinc-binding+properties+of+bovine+brain+S100+alpha+alpha,+S100a+(alpha+beta),+and+S100b+(beta+beta)+protein:+Zn2++regulates+Ca2++binding+on+S100b+protein.">Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).</li><li>Dell&#8217;Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+binding+properties+of+calgranulin+C,+a+novel+S100-like+calcium-binding+protein+from+pig+granulocytes.">Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).</li><li>Vogl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A12+is+expressed+exclusively+by+granulocytes+and+acts+independently+from+MRP8+and+MRP14.">S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).</li><li>Hofmann, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+mediates+a+novel+proinflammatory+axis:+a+central+cell+surface+receptor+for+S100/calgranulin+polypeptides.">RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides.</a> Cell. 97 (7), 889-901 (1999).</li><li>Foell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+S100A12+Can+Activate+Human+Monocytes+via+Toll-like+Receptor+4.">Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).</li><li>Kessel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+zinc+tune+autoinflammatory+Toll-like+receptor+4+signaling+by+S100A12.">Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).</li><li>Armaroli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-Derived+Interleukin-1beta+As+the+Driver+of+S100A12-Induced+Sterile+Inflammatory+Activation+of+Human+Coronary+Artery+Endothelial+Cells:+Implications+for+the+Pathogenesis+of+Kawasaki+Disease.">Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).</li><li>GE Healthcare. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Strategies for Protein Purification. Handbook. , (2010).</li><li>Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+Purification,+and+Antimicrobial+Activity+of+S100A12.">Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).</li><li>Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+S100+Protein-Protein+Complexes.">Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).</li><li>Magalhaes, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+endotoxin+removal+from+biological+preparations:+a+review.">Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review.</a> Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).</li><li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+removal+from+protein+solutions.">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li><li>Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+partial+characterization+of+canine+S100A12.">Purification and partial characterization of canine S100A12.</a> Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).</li><li>Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+human+Ca2+-bound+S100A12.">Solution structure of human Ca2+-bound S100A12.</a> Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).</li><li>Endotoxin Removal. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).</li><li>Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymyxin-B+Stimulates+Production+of+Complement+Components+and+Cytokines+in+Human+Monocytes.">Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).</li><li>Valentinis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+effects+of+polymyxin+B+on+human+dendritic+cells+maturation+-+The+role+of+I+kappa+B-alpha/NF-kappa+B+and+ERK1/2+pathways+and+adhesion.">Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).</li><li>Teuber, M., Miller, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Binding+of+Polymyxin-B+to+Negatively+Charged+Lipid+Monolayers.">Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).</li></ol>

I denne protokollen, beskriver vi tag-Free bakteriell uttrykk for menneskelig S100A12 og dens rensing samt separasjon i ulike ion-indusert oligomers for immun celle stimulering. Sammenlignet med publisert litteratur om S100A12 protein rensing8,23,24, bruk av høy CaCl2 (25 mm) i hydrofobe-interaksjon kromatografi er vår kunnskap unike. Flere protokoller som bruker konsentrasjoner fra 1 til 5 mM gjøre produsere rent ...

S100A12 er en kalsium bindende protein som er overveiende produsert av humant granulocytter. Proteinet er overexpressed under (systemisk) betennelse og serum nivåer, spesielt i (Auto) inflammatoriske sykdommer som systemisk juvenil idiopatisk artritt (sJIA), Familiær middelhavsfeber (FMF) eller Kawasaki sykdom (KD) kan informere om sykdomsaktivitet og respons på behandlingen. Avhengig av mønster gjenkjennings reseptorer (PRRs) som bompenger-lignende reseptorer (TLRs), kan det medfødte immunsystemet aktiveres av patogen-assosierte molekylære mønstre (PAMPs) som lipopolysaccharides (LPS) eller skade forbundet molekylære mønstre (demper; også kalt ' alarmins '). Demper er endogene molekyler som cellulære proteiner, lipider eller nukleinsyre syrer1. Fuktig-funksjoner er godt beskrevet for medlemmer av calgranulin protein familien, S100A8/A9 og S100A122, som også rapporteres å operere som divalent metall ion-chelaterande antimikrobielle peptider3,4, 5,6. Avhengig av tilgjengelige ion styrke S100A12 kan, som andre medlemmer av S100 familien, arrangere i ulike homomultimers og inntil nylig virkningen av S100A12-oligomerisation på PRR-interaksjon, spesielt TLR4, var ukjent.
Proteinet ' s monomere form (92 aminosyrer, 10,2 kDa) består av to "EF-Hand Helix-loop-Helix"-strukturer koblet sammen med en fleksibel linker. C-terminalen EF-hånden inneholder det klassiske ca2 +-bindende motivet, mens N-Terminal EF-hånden har en S100 protein spesifikk utvidet SLØYFE struktur («pseudo-EF-Hand») og avslører redusert ca2 +-affinitet. Ca2 +-binding av S100A12 kan indusere en stor conformational endring i proteinene ' C-Terminus, som resulterer i eksponering av en hydrofobe patch på hver monomer og danner dimerization grensesnittet. Således, under fysiologiske forhold, er den minste kvartær strukturen dannet av S100A12 en ikke-kovalente dimer (ca. 21 kDa) der individuelle monomerer er i antiparallel orientering. Når arrangert som dimer, S100A12 rapporteres å beslaglegge Zn2 + samt andre divalent metall ioner, f. eks Cu2 + med høy affinitet7. Disse ioner koordineres ved S100A12 dimer Interface av aminosyrer H15 og D25 av en delenhet og H85 samt H89 av anti-parallelt andre delenhet8,9,10. Mens tidligere studier foreslår at Zn2 +-Loaded S100A12 kan indusere proteinet ' s organisasjon til homo-tetramers (44 KDA) og å resultere i økt ca2 +-affinitet11,12, siste metall titrering studier6 foreslår ca2 +-binding av S100A12 å øke protein affinitet til Zn2 +. Når S100A12 EF-hender er fullt okkupert av ca2 +, er det antatt at ytterligere ca2 + antas å binde mellom dimers, utløser heksamer formasjon (ca. 63 KDA). Arkitekturen i den hexameric quarternary strukturen er helt klart forskjellig fra tetramer. Det er foreslått at tetramer grensesnittet er forstyrret for å gi opphav til nye dimer-dimer grensesnitt som fordeler heksamer formasjon10. S100A12 er nesten utelukkende uttrykt av menneskelige granulocytter der det utgjør ca 5% av alle cytosolic protein13. I sin DAMP funksjon S100A12 ble historisk beskrevet som Agonistiske av multi-ligand reseptor for avanserte glycation sluttprodukter (RAGE), deretter betegnes ekstracellulære nylig identifiserte RAGE-binding protein (EN-RAGE)14. Riktignok vi tidligere rapportert biokjemiske S100A12-binding til både RAGE og TLR415, vi nylig demonstrerte menneskelige monocytter å svare på S100A12 stimulering i en TLR4-avhengig måte16. Dette krever arrangement av S100A12 i sin ca2 +/Zn2 +-indusert hexameric quarternary struktur16.
Her beskriver vi en rensing prosedyre for rekombinant humant S100A12 og Ion-indusert oligomers for immun celle stimuleringer16,17. Dette er basert på en to-trinns kromatografi strategi, som i utgangspunktet inkluderer en anion for å isolere og konsentrere proteinet og fjerne bulk forurensninger (f.eks. endotoksiner/lipopolysaccharides)18. Ion-Exchange kromatografi harpiks separate proteiner på grunnlag av ulike netto overflate kostnader. For sure proteiner som S100A12 (isoelectric punkt på 5,81), et buffer system med en pH på 8,5 og en sterk anion-utveksling harpiks fører til en god separasjon. Bound proteiner ble eluert med en høy-salt buffer gradient. Med en økning på ioniske styrke negative ioner i eluering buffer konkurrere med proteiner for kostnader på overflaten av harpiks. Proteiner individuelt eluere avhengig av deres netto ladning og i resultat av det, buffere beskrevet her tillater å isolere og konsentrere overexpressed S100A12 protein. På grunn av negativt ladet grupper i lipopolysaccharides, disse molekylene også binde til anion-utveksling harpiks. Men deres høyere netto kostnad resulterer i senere eluering i anvendt høy-salt gradient. Det andre trinnet i rensing prosedyren har blitt innført for polering formål. Dette gjør bruk av kalsium bindende evne til S100A12 og fjerner gjenværende urenheter på en hydrofobe-kolonne. Kalsium binding av S100A12 fører til en conformational endring og en eksponering av hydrofobe flekker på overflaten av proteinet. På denne betingelsen, S100A12 samhandler med hydrofobe overflaten av harpiks. Ved kalsium-chelaterande av EDTA, er denne interaksjonen reversert. I nærvær av ioner, spesielt kalsium og sink, S100A12 arrangerer inn homomeric oligomers. Å studere struktur-funksjon relasjoner av de ulike oligomers, stabilisert vi dimeric, tetramerisk og hexameric rekombinant S100A12 med en kjemisk tverrbinder og separert komplekser på en størrelse-eksklusjon kromatografi kolonne. Til slutt, for å analysere funksjonalitet og biologisk aktivitet av renset protein og Ion-indusert oligomers, den cytokin utgivelsen av S100A12 og LPS stimulert monocytt kan sammenlignes.
Ulike metoder for rensing S100A12 har blitt beskrevet så langt. Jackson et al.19, for eksempel, publiserte en protokoll med rensing via en anion-kolonne og en påfølgende størrelses ekskludering kromatografi. Rensing av polering på en kolonne med størrelses ekskludering fører til gode resultater, men – på grunn av for eksempel begrenset belastnings volum, er mindre fleksibel i skalerbarhet. En annen tilnærming, utgitt av Kiss et al.20, beskriver rensing av Tagged protein via ni2 + affinitet kolonnen som den første rensing trinn, etterfulgt av enzymatisk kløft å fjerne koden og ytterligere rensing trinn. I motsetning til de aforecited studiene19,20, den produserte protein som beskrevet i denne protokollen er bestemt for eksperimenter på immunceller. Derfor er rest endotoksin forurensning fra bakteriell kultur en utfordring. Selv om ulike tilnærminger for endotoksin fjerning har blitt beskrevet så langt, er det ingen ensartet metode som fungerer like godt for en gitt protein løsning21,22.
Oppsummert kombinerer vår protokoll fordelene med et kode fritt uttrykk i et bakteriell system med effektiv fjerning av endotoksin og høy utbytte av rent protein.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pET11b vector</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x Non-essential amino acids</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K 0293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% HCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X897.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8722;20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciumchlorid Dihydrat</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5239.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human Monocyte Enrichment Kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19059</td>
			<td>Magnetic negative cell isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoLISA</td>
			<td>Hyglos</td>
			<td>609033</td>
			<td>Endotoxin detection assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin-Free Ultra Pure Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TMS-011-A</td>
			<td>Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoTrap red</td>
			<td>Hyglos</td>
			<td>321063</td>
			<td>Endotoxin removal resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (heat-inactivated)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (high quality, endotoxin testet)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hTNF-alpha - OptEia ELISA Set</td>
			<td>BD</td>
			<td>555212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (isopropyl-&#223;-D-thiogalactopyranosid)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN08.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K 0282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Medium</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L6529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll, human</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-60500</td>
			<td>Separation solution (density gradient centrifugation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A 2212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl Sepharose High Performance</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1082-01</td>
			<td>Resin for hydrophobic interaction chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-pmb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Resin for anion-exchange chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSep buffer</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>20104</td>
			<td>Cell separation buffer (section 5.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F 1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P031.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SLHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL roundbottom tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Erlenmyer flask</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>LY98.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well suspension plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 L measuring beaker</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CKN3.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL high-speed centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3,01,22,178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (100 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Closures</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep magnet &#39;The Big Easy`</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector tubes 5 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>115101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox film, 25 &#181;m, 305 mm x 40 m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94,60,77,316</td>
			<td>Film for monocyte culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa)</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop filter unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Incubator (with shaking)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA purifier UPC 10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Frac-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (with rotor A-4-81)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F-34-6-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean Tetra Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPhotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>P330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Brandelin</td>
			<td>UW2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>infinite M200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td>765</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of human s100a12 and its ion-induced oligomers for immune cell stimulation

I denne protokollen, beskriver vi en metode for å rense humant kalsium-bindende protein S100A12 og Ion-indusert oligomers fra Escherichia coli kultur for immun celle stimuleringer. Denne protokollen er basert på en to-trinns kromatografi strategi, som består av protein pre-rensing på en anion kromatografi kolonne og en påfølgende polering trinn på en hydrofobe-kolonnen. Denne strategien produserer S100A12 protein av høy renhet og yield på håndterbare kostnader. For funksjonell analyser på immunceller eventuelt rest endotoksin forurensning krever nøye overvåking og ytterligere rengjøring trinn for å få endotoksin-fri protein. Flertallet av endotoksin forurensninger kan utelukkes ved anion-utveksling kromatografi. For å tømme gjenværende forurensninger, beskriver denne protokollen et fjernings trinn med sentrifugal filtre. Avhengig av tilgjengelige ion-styrke S100A12 kan arrangere i ulike homomultimers. For å undersøke sammenhengen mellom struktur og funksjon beskriver denne protokollen videre ion-behandling av S100A12 protein fulgt av kjemiske Cross Linking for å stabilisere S100A12 oligomers og deres påfølgende separasjon etter størrelses ekskludering kromatografi. Til slutt beskriver vi en celle-basert analyse som bekrefter biologisk aktivitet av renset protein og bekrefter LPS-fri forberedelse.

Etter pre-rensing på AIEX kolonnen (figur 1A-C) og påfølgende kalsium-avhengige hic (figur 2a, B), svært rent protein ble oppnådd (figur 2C). I tillegg, målinger av endotoksin avdekket vellykket LPS fjerning. LPS-innholdet etter AIEX ble målt i en 1:10 fortynning over analysen oppdagelsen grensen, det vil si, over 500 EU/mL. Etter den første filtreringen gjennom en 50 kDa Filterenhet, ble LP...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation at JoVE.com

Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

Denne protokollen beskriver en rensing metode for rekombinant tag-Free kalsium bindende protein S100A12 og Ion-indusert oligomers for menneskelig monocytt stimulering analyser.

Rensing av Human S100A12 og Its ion-indusert Oligomers for immun celle stimulering

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

Denne protokollen beskriver en fullstendig renseprosedyre for det humane kalsiumbindende proteinet, S100A12, og spesielt for det er forskjellige ion-induserte oligomerer for nedstrøms forskningsimplikasjoner. Med denne teknikken er vi i stand til å opprettholde høyt utbytte av veldig rent og endotoksinfritt protein. Kjemisk krysskobling og separasjon på størrelsesekskludering kromatografikolonnen er en overbevisende metode for å generere homo-oligomeriske proteiner for ytterligere funksjonelle analyser.Vår teknikk gjør det mulig for oss å mekanistiske aspekter av S100A12 som mønstergjenkjenningsreseptor ligand og kunstinformasjon for å ideelt utvikle nye målrettede intervensjoner og forbedre diagnostiske analyser. I tillegg til å se denne videoen, anbefaler vi en forsiktig lesing av protokollen, da vi beskriver en kompleks, flertrinns prosedyre. For å begynne, kutt en dialyserør i en passende lengde, rundt 30 centimeter, med ekstra plass til luft.Bløtlegg membranen i deionisert vann i 15 til 30 minutter for å fjerne glyserol. For å redusere viskositeten til den klarede proteinoppløsningen, fortynne oppløsningen med 25 milliliter AIEX-buffer A.Fest den første lukkingen på slangen. Last prøven inn i membranen og fest den andre lukkingen minst en centimeter fra den øverste enden av slangen.I et avkjølt rom ved fire grader Celsius plasserer du beholderen med AIEX-buffer A på en røreplate, legger til en rørestang og membranen fylt med proteinoppløsning. Juster hastigheten for å rotere prøven slik at det ikke er noen interferens med den roterende rørestangen. Dialyze i 12 til 24 timer ved fire grader Celsius deretter erstatte den dialyzed buffer med gratis forhåndskjølt buffer A og fortsette i minst fire ekstra timer.Overfør den dialyserte proteinoppløsningen fra slangen til et 50 milliliter rør gjennom en 0,45 mikron filterenhet. Start FPLC med generelt vedlikehold. Koble kolonnebuffere AIEX A og AIEX B til bufferventiler og anionutvekslingsharpiks som inneholder kolonne til kolonneportene til FPLC.Juster de generelle kromatografiske parametrene tilsvarende. Start AIEX-programmet i FPLC-programvaren og velg likevektsvolumet for buffer A.Deretter laster du prøven på kolonnen og elutrer proteinene med en lineær gradering fra 0% til 100% høy saltbuffer. Samle to milliliter fraksjoner under elution.Analyser de rømte brøkene etter endt kjøring. For dette laster du 10 mikroliter av hver brøk på en Coomassie-farget 15% SDS-side og identifiserer brøker som inneholder S100A12. Sett disse S100A12 som inneholder fraksjoner for dialyse i TRIS-bufret saltvann.For å fortsette proteinrensingen, etter proteindialyse, legg til et kalsiumklorid til prøven til en endelig konsentrasjon på 25 millimolar, noe som vil lette bindingen av S100A12 til harpiksen i neste trinn. Deretter filtrerer du prøven gjennom et filter med en hellstørrelse på 0,45 mikrometer. Likevekt HIC buffere og prøver til fire grader Celsius.Deretter kobler du kolonnebufferne HIC A og B og kolonnen til systemet og justerer parameterne. Start metoden for å likevekte kolonnen med ett til to kolonnevolumer av buffer HIC A og laste prøven og vasken ubundne prøveblokk med et UV-signal når baseline nivå igjen. Start deretter elution med en kalsiumchelator som inneholder buffer EDTA.Samle to milliliter av peak fraksjoner under elution. Etter å ha analysert 10 mikroliter av hver brøk på en Coomassie farget 15% SDS side identifisere ren S100A12 fraksjoner. Pool disse brøkene og dialyze mot HBS.Legg først 15 milliliter prøve på en 50 kilodalton sentrifugalfilterenhet. Sentrifuge ved 3200 ganger g ved 10 grader Celsius i ca. 10 minutter. Overfør den filterte strømmen til et nytt fartøy, på is.Bruk nå ett milliliter HBS til å skylle filtermembranen og for fortynning av konsentrert oppløsning i filterspissen. Sentrifuge igjen for å gjenopprette så mye protein som mulig i gjennomstrømningen. For å filtrere løsningen, gjenta prøven lasting og sentrifugering så ofte som nødvendig.Deretter, for å konsentrere S100A12 som inneholder gjennomstrømning, last den inn i et tre kilodalton sentrifugalfilter og sentrifuge ved 3200 ganger g, 10 grader Celsius i ca 30 minutter. Nå reduseres volumet til 1/5 til 1/10 av det opprinnelige lastevolumet. Overfør den konsentrerte løsningen til et nytt rør.Gjenta konsentrasjonstrinnet så ofte som nødvendig. Etter kjemisk krysskobling, ifølge manuskriptet, utføre størrelse utelukkelse kromatografi. Likevekt kolonnen i HBS, last prøven, og samle toppfraksjoner på en til to milliliter under løpet.Etter å ha analysert disse brøkene på en fire til 20% gradering SDS-side, pool fraksjoner med store band av ønsket protein kompleks. Konsentrer deretter løsningene som gjort tidligere. For å isolere monocytter fra menneskelige buffy strøk ved tetthet gradient sentrifugering, først likevekt separasjonsløsningen til romtemperatur.Overfør 20 milliliter til 15 milliliter sentrifugerør, to rør per buffy pels. Fortynn blodet fra den menneskelige buffy pelsen med HBSS til et totalt volum på 60 milliliter og lag 30 milliliter av denne blandingen forsiktig på toppen av separasjonsmediet. Sentrifuge ved 550 ganger g i 35 minutter ved romtemperatur.Slå av bremsen på sentrifugen. Etter sentrifugering er de mononukleære perifere blodcellene plassert rett på toppen av separasjonsmediet. Med en pipette, overfør disse cellene til et friskt, 50 milliliter sentrifugerør.Fyll røret med HBSS til 50 milliliter og sentrifuge ved 170 ganger g i 10 minutter. Aspirer den overnaturante og resuspend cellepellet i et lite volum hbss ved pipettering. Fyll deretter røret opp til 50 milliliter og sentrifuge ved 290 ganger g i 10 minutter.Aspirer den overnaturlige igjen. Resuspend cellene i 50 milliliter HBSS og sentrifuge ved 170 ganger g i 10 minutter. Aspirer den overnaturante og gjenoppusser cellepelleten i et lite volum på ett milliliter separasjonsbuffer, teller cellene og legger til buffer til en konsentrasjon på fem ganger 10 til de syv cellene per milliliter.For monocyttisolering fra mononukleære perifere blodlegemer, bruk et magnetisk negativt celleisolasjonssett og følg produsentens protokoll. Bruk en automatisert celleteller til å telle monocytter og gjenbruke i monocytt medium til en konsentrasjon på to ganger 10 til de seks cellene per milliliter. For å dyrke monocytter, legg ut en cellekulturrett med en hydrofob gassgjennomtrengelig film egnet for suspensjonsceller.Plasser platene under UV-lys i ca. 30 minutter for sterilisering. Overfør 15 til 25 milliliter av cellesuspensjonen til disse kulturplatene og la dem hvile over natten ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Etter forhåndsrensing på AIEX-kolonnen og påfølgende kalsiumavhengig HIC ble det oppnådd svært rent protein.Som en ekstra kontroll ble humane monocytter stimulert med LPS og produsert wild-type protein. Proteineksponering for ulike ioner resulterer i arrangement av forskjellige S100A12 oligomers. Økende sinkkonsentrasjoner induserer arrangement av S100A12 til tetramers og heksamerer ved separasjon på fire til 20% Coomassie farget SDS-side.Når et overskudd av ioner ble brukt før krysskobling, induserte det et uttalt skifte av oligomerlikevekten. S100A12 var krysskoblet i nærvær av enten 25 millimolar kalsium eller 25 millimolar kalsium og en millimolar sink. Etter krysskobling i HBS-buffer med 25 millimolar kalsiumklorid og en millimolar sinkklorid ble heksamer og tetramer separert.Tetramer og dimer ble separert i HBS-buffer med 25 millimolar kalsiumklorid. Et eksempel på samlede og konsentrerte oligomerer etter separasjon på en Coomassie farget fire til 15% gradient SDS-side viser dimer, tetramer og hexamer. Monocyttstimulering med heksamerisk S100A12 resulterte i uttalt TNF alfafrigjøring.Etter fjerning av endotoksin er det viktig å ikke gjeninnføre forurensning i prøvene under etterfølgende generasjon og rensing av oligomerene. Nedstrøms analyse av enhver prosess som er relatert til S100A12 oligomerization er tenkelig. På samme måte kan aminosyrer og iionforhold som påvirker selve oligomeriseringsprosessen analyseres.Vi bruker for tiden S100A12 oligomers separert i henhold til den beskrevne protokollen for å utvikle spesifikke peptid ligands og antistoffer for å blokkere proteinets signalering gjennom TLF4 og for å utvikle og forbedre diagnostiske analyser.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolering av Funksjonelle Cardiac immunceller

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging av Mouse Thymus med 2-Photon Mikroskopi

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Påvisning av Fluorescent Nanoparticle Interaksjoner med Primær immun celle subpopulasjoner av flowcytometri

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

En semi-automatisert tilnærming til Klar Antistoff Cocktails for Immunophenotypic analyse av perifert blod

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolasjon og flowcytometrisk analyse av immunceller fra iskemisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...