Name: purification of human s100a12 and its ion-induced oligomers for immune cell stimulation
Uploaded: 2019-09-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation at JoVE.com

Este estudo foi apoiado por subvenções do programa de pesquisa médica inovadora intramural da faculdade de medicina da Universidade de Muenster (KE121201 a CK) e da Fundação alemã de pesquisa (DFG, Fo354/3-1 para D.F.).

Nota: Por favor, consulte a tabela complementar 1 para preparação de buffers e soluções de estoque.
1. expressão protéica em E. coli
<ol><li>
Clonagem
	<ol>
<li>Clone tag-free Human S100A12 (seqüência de referência NCBI: NP_ 005612.1) em vetor de expressão bacteriana pET11b. Para expressar a proteína, transforme a construção em E. coli BL21 (de3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultura
	<ol>
<li>Prepa...

<ol>
	<li>Liston, A., Masters, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostasis-altering+molecular+processes+as+mechanisms+of+inflammasome+activation.">Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).</li><li>Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocyte-derived+S100+proteins+in+autoinflammation:+putative+role+in+pathogenesis+and+usefulness+as+biomarkers.">Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers.</a> Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).</li><li>Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+circular+dichroism+studies+of+iron(ii)+binding+to+human+calprotectin.">Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin.</a> Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).</li><li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein.">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).</li><li>Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nickel+Sequestration+by+the+Host-Defense+Protein+Human+Calprotectin.">Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).</li><li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12.">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex:+implications+for+host-parasite+defence.">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li><li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc:+new+insights+into+S100A12+oligomerisation.">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).</li><li>Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+human+(S100A8/S100A9)2+heterotetramer,+calprotectin,+illustrates+how+conformational+changes+of+interacting+alpha-helices+can+determine+specific+association+of+two+EF-hand+proteins.">The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+Ca2++and+Zn2++are+essential+for+S100A12+protein+oligomerization+and+function.">Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function.</a> BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).</li><li>Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ions+binding+to+S100+proteins.+I.+Calcium-+and+zinc-binding+properties+of+bovine+brain+S100+alpha+alpha,+S100a+(alpha+beta),+and+S100b+(beta+beta)+protein:+Zn2++regulates+Ca2++binding+on+S100b+protein.">Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).</li><li>Dell&#8217;Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+binding+properties+of+calgranulin+C,+a+novel+S100-like+calcium-binding+protein+from+pig+granulocytes.">Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).</li><li>Vogl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A12+is+expressed+exclusively+by+granulocytes+and+acts+independently+from+MRP8+and+MRP14.">S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).</li><li>Hofmann, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+mediates+a+novel+proinflammatory+axis:+a+central+cell+surface+receptor+for+S100/calgranulin+polypeptides.">RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides.</a> Cell. 97 (7), 889-901 (1999).</li><li>Foell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+S100A12+Can+Activate+Human+Monocytes+via+Toll-like+Receptor+4.">Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).</li><li>Kessel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+zinc+tune+autoinflammatory+Toll-like+receptor+4+signaling+by+S100A12.">Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).</li><li>Armaroli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-Derived+Interleukin-1beta+As+the+Driver+of+S100A12-Induced+Sterile+Inflammatory+Activation+of+Human+Coronary+Artery+Endothelial+Cells:+Implications+for+the+Pathogenesis+of+Kawasaki+Disease.">Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).</li><li>GE Healthcare. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Strategies for Protein Purification. 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O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+endotoxin+removal+from+biological+preparations:+a+review.">Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review.</a> Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).</li><li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+removal+from+protein+solutions.">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li><li>Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+partial+characterization+of+canine+S100A12.">Purification and partial characterization of canine S100A12.</a> Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).</li><li>Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+human+Ca2+-bound+S100A12.">Solution structure of human Ca2+-bound S100A12.</a> Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).</li><li>Endotoxin Removal. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).</li><li>Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymyxin-B+Stimulates+Production+of+Complement+Components+and+Cytokines+in+Human+Monocytes.">Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).</li><li>Valentinis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+effects+of+polymyxin+B+on+human+dendritic+cells+maturation+-+The+role+of+I+kappa+B-alpha/NF-kappa+B+and+ERK1/2+pathways+and+adhesion.">Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).</li><li>Teuber, M., Miller, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Binding+of+Polymyxin-B+to+Negatively+Charged+Lipid+Monolayers.">Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).</li></ol>

Neste protocolo, nós descrevemos a expressão bacteriana tag-livre do S100A12 humano e de sua purificação assim como a separação em oligômeros íon-induzidos diferentes para a estimulação imune da pilha. Comparado à literatura publicada na purificação da proteína S100A128,23,24, o uso de CAcl elevado2 (25 milímetros) na cromatografia hydrofóbica-interação é a nosso conhecimento original. Vários proto...

S100A12 é uma proteína de ligação de cálcio que é predominantemente produzida por granulócitos humanos. A proteína é superexpressa durante a inflamação (sistêmica) e seus níveis séricos, particularmente em (auto) doenças inflamatórias como a artrite idiopática juvenil sistêmica (Aijs), a febre familiar do Mediterrâneo (FMF) ou a doença de Kawasaki (KD) pode informar sobre atividade da doença e resposta à terapêutica. Dependendo dos receptores de reconhecimento de padrão (PRRs), como os receptores Toll-like (TLRs), o sistema imunológico inato pode ser ativado por padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), como lipopolissacarídeos (LPS) ou danos associados a padrões moleculares (DAMPs; também denominado ' alarmins '). Os DAMPs são moléculas endógenas, como proteínas celulares, lipídios ou ácidos nucleicos1. As funções húmidas são bem descritas para os membros da família de proteínas calgranulina, S100A8/A9 e S100A122, quetambém são relatados para operar como peptídeos antimicrobianos de quelaçãode íonsmetálicos divalentes3,4, 5,6. Dependendo da força disponível do íon S100A12 lata, como outros membros da família S100, arranja em homomultimers diferentes e até recentemente o impacto de S100A12-oligomerisation no PRR-interação, particular TLR4, era desconhecido.
A forma monomérica da proteína (92 aminoácidos, 10,2 kDa) consiste em duas estruturas de hélice-loop-hélice da EF-mão conectadas por um vinculador flexível. O C-Terminal EF-Hand contem o clássico CA2 +-o motivo obrigatório visto que o N-Terminal EF-Hand exibe uma estrutura prolongada proteína-específica do laço S100 (' pseudo-EF-mão ') e revela a afinidade reduzida de CA2 +-. CA2 +-a ligação por S100A12 pode induzir uma mudança conformacional principal no C-Terminus das proteínas, que conduz à exposição de um remendo hydrofóbico em cada monómero e dá forma à relação do dimerização. Assim, condições fisiológicas, a menor estrutura quaternária formada por S100A12 é um dímero não covalente (aproximadamente 21 kDa), no qual os monómeros individuais estão em orientação antiparalela. Quando arranjado como dímero, S100A12 é relatado para seqüestro Zn2 + , bem como outros íons metálicos divalentes, por exemplo,2 + com alta afinidade7. Estes íons são coordenados na interface de dímero S100A12 por aminoácidos h15 e D25 de uma subunidade e H85, bem como H89 da antiparalelante outra subunidade8,9,10. Enquanto estudos anteriores propõem que Zn2 +-carregado S100A12 pode induzir a organização da proteína em Homo-tetramers (44 kDa) e para resultar em aumento CA2 +-afinidade11,12, recente titulação de metal estudos6 sugerem CA2 +-ligação por S100A12 para aumentar a afinidade da proteína para Zn2 +. Uma vez que os S100A12 EF-hands são ocupados inteiramente por CA2 +, o CA adicional2 + é pensado para ligar entre dímeros, provocando a formação do hexamer (aproximadamente 63 kDa). A arquitetura da estrutura quarternary forma é claramente diferente daquela do tetramer. Propõe-se que a interface do tetrâmero é interrompida para dar origem a novas interfaces dímero-dímero que beneficia a formação de hexamer10. S100A12 é quase exclusivamente expresso por granulócitos humanos, onde constitui cerca de 5% de toda a proteína citosólica13. Em sua função úmida S100A12 foi historicamente descrita como agonista do receptor multiligante para produtos finais de glicação avançada (RAGE), então denominado proteína de ligação à raiva recém-identificada extracelular (EN-RAGE)14. Embora nós relatado mais cedo S100A12-ligação bioquímica a Rage e a TLR415, Nós demonstramos recentemente monócitos humanos para responder à estimulação S100A12 em uma maneira TLR4-dependente16. Isto exige o arranjo de S100A12 em seu ca2 +/Zn2 +-estrutura quarternary forma induzida16.
Aqui nós descrevemos um procedimento da purificação para o S100A12 humano de recombinação e seus oligômeros íon-induzidos para estimulações imunes da pilha16,17. Isso se baseia em uma estratégia de cromatografia em duas etapas, que inicialmente inclui uma coluna de troca de ânions para isolar e concentrar a proteína e remover contaminações em massa (por exemplo, endotoxinas/lipopolissacarídeos)18. Resinas de cromatografia de troca iónica separam proteínas com base em diferentes encargos de superfície líquida. Para proteínas ácidas como S100A12 (ponto isoelétrico de 5,81), um sistema tampão com um pH de 8,5 e uma resina de troca aniónica forte leva a uma boa separação. As proteínas ligadas foram eluidas com um gradiente de tampão de alto sal. Com um aumento de íons negativos de força iônica no tampão de eluição competir com proteínas para cargas na superfície da resina. Proteínas individualmente eluir dependendo de sua carga líquida e em conseqüência disso, os bufferes descritos nisto permitem isolar e concentrar a proteína S100A12 overexpressada. Devido a grupos carregados negativamente em lipopolissacarídeos, essas moléculas também se ligam a resinas de troca de ânions. Entretanto, sua carga líquida mais elevada conduz à eluição mais atrasada no inclinação elevado-sal aplicado. A segunda etapa do procedimento de purificação foi introduzida para fins de polimento. Isto faz uso da capacidade de ligação de cálcio de S100A12 e remove as impurezas remanescentes em uma coluna de interação hidrofóbica. O emperramento do cálcio de S100A12 conduz a uma mudança conformacional e a uma exposição de remendos hydrofóbicos na superfície da proteína. Nessa condição, S100A12 interage com a superfície hidrofóbica da resina. Em cima do cálcio-quelante pelo EDTA, esta interação é invertida. Na presença de íons, especialmente cálcio e zinco, S100A12 organiza em oligomers condição. Para estudar relações estrutura-função dos oligomers diferentes, nós estabilizamos o dimeric, tetramérica e o S100A12 de recombinação forma com um chapéu cabeado químico e separamos os complexos em uma coluna da cromatografia do tamanho-exclusão. Finalmente, para analisar a funcionalidade e a atividade biológica da proteína purificada e seus oligomers íon-induzidos, a liberação do citocinas de S100A12 e de LPs estimulou o monocyte pode ser comparada.
Os vários métodos para purificante S100A12 foram descritos até agora. Jackson et al.19, por exemplo, publicaram um protocolo com purificação por meio de uma coluna de troca de ânions e uma posterior cromatografia de exclusão de tamanho. O polimento de purificação em uma coluna de exclusão de tamanho leva a bons resultados, mas ― devido a, por exemplo, volumes de carregamento limitados ― é menos flexível na escalabilidade. Uma abordagem diferente, publicada por Kiss et al.20, descreve a purificação da proteína etiquetada via coluna Ni2 + Affinity como a primeira etapa de purificação, seguida de clivagem enzimática para remover a tag e outras etapas de purificação. Em contraste com os estudos aforecited19,20, aproteína produzida como descrito neste protocolo é determinada para experiências em pilhas imunes. Conseqüentemente, a contaminação remanescente da endotoxina da cultura bacteriana é um desafio. Embora diferentes abordagens para a remoção da endotoxina tenham sido descritas até o momento, não há um método uniforme que funcione igualmente bem para qualquer solução protéica21,22.
Em resumo, nosso protocolo combina as vantagens de uma expressão tag-free em um sistema bacteriano com remoção eficiente da endotoxina e elevado rendimento da proteína pura.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pET11b vector</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x Non-essential amino acids</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K 0293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% HCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X897.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8722;20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciumchlorid Dihydrat</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5239.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human Monocyte Enrichment Kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19059</td>
			<td>Magnetic negative cell isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoLISA</td>
			<td>Hyglos</td>
			<td>609033</td>
			<td>Endotoxin detection assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin-Free Ultra Pure Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TMS-011-A</td>
			<td>Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoTrap red</td>
			<td>Hyglos</td>
			<td>321063</td>
			<td>Endotoxin removal resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (heat-inactivated)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (high quality, endotoxin testet)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hTNF-alpha - OptEia ELISA Set</td>
			<td>BD</td>
			<td>555212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (isopropyl-&#223;-D-thiogalactopyranosid)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN08.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K 0282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Medium</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L6529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll, human</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-60500</td>
			<td>Separation solution (density gradient centrifugation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A 2212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl Sepharose High Performance</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1082-01</td>
			<td>Resin for hydrophobic interaction chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-pmb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Resin for anion-exchange chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSep buffer</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>20104</td>
			<td>Cell separation buffer (section 5.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F 1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P031.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SLHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL roundbottom tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Erlenmyer flask</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>LY98.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well suspension plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 L measuring beaker</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CKN3.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL high-speed centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3,01,22,178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (100 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Closures</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep magnet &#39;The Big Easy`</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector tubes 5 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>115101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox film, 25 &#181;m, 305 mm x 40 m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94,60,77,316</td>
			<td>Film for monocyte culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa)</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop filter unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Incubator (with shaking)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA purifier UPC 10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Frac-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (with rotor A-4-81)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F-34-6-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean Tetra Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPhotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>P330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Brandelin</td>
			<td>UW2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>infinite M200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td>765</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of human s100a12 and its ion-induced oligomers for immune cell stimulation

Neste protocolo, nós descrevemos um método para purificar a proteína cálcio-obrigatória humana S100A12 e seus oligômeros íon-induzidos da cultura de Escherichia coli para estimulações imunes da pilha. Este protocolo baseia-se em uma estratégia de cromatografia em duas etapas, que compreende a pré-purificação de proteínas em uma coluna de cromatografia de troca de ânions e uma etapa de polimento subsequente em uma coluna de interação hidrofóbica. Esta estratégia produz S100A12 proteína de alta pureza e rendimento a custos gerenciáveis. Para ensaios funcionais em células imunes eventual contaminação de endotoxina remanescente requer monitoramento cuidadoso e mais etapas de limpeza para obter proteína livre de endotoxina. A maioria das contaminações da endotoxina pode ser excluída por cromatografia de troca de ânions. Para esgotar contaminações residuais, este protocolo descreve uma etapa da remoção com filtros centrífugos. Dependendo do íon-força disponível S100A12 pode arranjar em homomultimers diferentes. Para investigar o relacionamento entre a estrutura e a função, este protocolo descreve mais mais o íon-tratamento da proteína S100A12 seguida pelo reticulação químico para estabilizar S100A12 oligômeros e sua separação subseqüente pelo tamanho-exclusão Cromatografia. Finalmente, nós descrevemos um ensaio Cell-Based que confirme a atividade biológica da proteína purified e confirme a preparação LPS-livre.

Após a pré-purificação na coluna AIEX (Figura 1a-C) e subsequente HIC dependente de cálcio (Figura 2a, B), obteve-se proteína altamente pura (Figura 2C). Além, as medidas do endotoxina revelaram a remoção bem sucedida dos LPS. O teor de LPS após AIEX foi medido numa diluição de 1:10 acima do limite de detecção do ensaio, ou seja, acima de 500 EU/mL. Após a primeira filtração atravé...

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Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

Este protocolo descreve um método da purificação para a proteína obrigatória tag-livre de recombinação do cálcio S100A12 e seus oligômeros íon-induzidos para ensaios humanos da estimulação do monocyte.

Purificação do S100A12 humano e seus Oligomers íon-induzidos para a estimulação imune da pilha

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

Este protocolo descreve um procedimento completo de purificação para a proteína de ligação de cálcio humano, S100A12, e em particular, pois são diferentes oligômeros induzidos por íons para implicações de pesquisa a jusante. Com esta técnica, somos capazes de manter o alto rendimento de proteína muito pura e livre de endotoxinas. Ligação e separação química na coluna de cromatografia de exclusão de tamanho é um método convincente para gerar proteínas homo-oligomericas para outros ensaios funcionais.Nossa técnica nos permite aspectos mecanicistas do S100A12 como ligante receptor de reconhecimento de padrões e informações de arte para desenvolver idealmente novas intervenções direcionadas e melhorar os ensaios diagnósticos. Além de assistir a este vídeo, recomendamos uma leitura cuidadosa do protocolo, pois descrevemos um procedimento complexo e multi-passos. Para começar, corte uma tubulação de diálise em um comprimento apropriado, em torno de 30 centímetros, com espaço adicional para o ar.Mergulhe a membrana em água deionizada por 15 a 30 minutos para remover glicerol. Para reduzir a viscosidade da solução de proteínas desmatadas, diluir a solução com 25 mililitros de tampão AIEX A.Conecte o primeiro fechamento na tubulação. Carregue a amostra na membrana e conecte o segundo fechamento a pelo menos um centímetro da extremidade superior da tubulação.Em uma sala resfriada a quatro graus Celsius, coloque o recipiente com tampão AIEX A em uma placa de mexida, adicione uma barra de meximento e a membrana cheia de solução proteica. Ajuste a velocidade para girar a amostra para que não haja interferência na barra de agitação rotativa. Dialise por 12 a 24 horas a quatro graus Celsius, em seguida, substitua o buffer dialisado por buffer pré-resfriado gratuito A e continue por pelo menos quatro horas adicionais.Transfira a solução de proteína dialisada da tubulação para um tubo de 50 mililitros através de uma unidade de filtro de 0,45 míclica. Inicie o FPLC com manutenção geral. Conecte os buffers de coluna AIEX A e AIEX B às válvulas tampão e a resina de troca de ânion contendo coluna para as portas da coluna do FPLC.Ajuste os parâmetros cromatográficos gerais em conformidade. Inicie o programa AIEX no software FPLC e escolha o volume de equilíbrio para buffer A.Posteriormente, carregue a amostra na coluna e elute as proteínas com um gradiente linear de tampão de sal de 0% a 100% de altura. Colete duas frações mililitros durante a eluição.Analise as frações elucidadas após o término da corrida. Para isso, carregue 10 microlitadores de cada fração em uma página de Coomassie manchada de 15% SDS e identifique frações contendo S100A12. Acumule estes S100A12 contendo frações para diálise em soro fisiológico com tampol atrofes.Para continuar a purificação da proteína, após a diálise proteica, adicione um cloreto de cálcio à amostra a uma concentração final de 25 mililitros, o que facilitará a ligação de S100A12 à resina na próxima etapa. Em seguida, filtre a amostra através de um filtro com um tamanho de derramamento de 0,45 mícrons. Equilibre os buffers e amostras de HIC a quatro graus Celsius.Em seguida, conecte os buffers de coluna HIC A e B e a coluna ao sistema e ajuste os parâmetros. Inicie o método para equilibrar a coluna com um a dois volumes de coluna de HIC A tampão e carregue a amostra e o bloco de amostra desvinculado da lavagem com um sinal UV atinge novamente o nível da linha de base. Em seguida, inicie a elução com um quedor de cálcio contendo EDTA tampão.Colete dois mililitros de frações de pico durante a eluição. Depois de analisar 10 microliters de cada fração em uma página de Coomassie manchada de 15% SDS identificar frações puras de S100A12. Acumule essas frações e diálise contra HBS.Primeiro, carregue 15 mililitros de amostra em uma unidade de filtro centrífugo de 50 kilodalton. Centrifugar a 3200 vezes g a 10 graus Celsius por aproximadamente 10 minutos. Transfira o fluxo filtrado para um novo vaso, no gelo.Agora, use um mililitro de HBS para enxaguar a membrana do filtro e para diluição da solução concentrada na ponta do filtro. Centrifugar novamente para recuperar o máximo de proteína possível no fluxo. Para filtrar a solução, repita o carregamento da amostra e a centrifugação quantas vezes for necessário.Em seguida, para concentrar o S100A12 contendo fluxo através, carregue-o em um filtro centrífugo de três quilodalton e centrífuga a 3200 vezes g, 10 graus Celsius por aproximadamente 30 minutos. Agora, o volume é reduzido para 1/5 até 1/10 do volume inicial de carregamento. Transfira a solução concentrada para um novo tubo.Repita o passo de concentração quantas vezes for necessário. Após a ligação química, de acordo com o manuscrito, realize cromatografia de exclusão de tamanho. Equilibre a coluna no HBS, carregue a amostra e colete frações de pico de um a dois mililitros durante a execução.Depois de analisar essas frações em uma página SDS de quatro a 20%, acumule frações com as principais bandas do complexo proteico desejado. Em seguida, concentre as soluções como feito anteriormente. Para isolar monócitos de casacos de buffy humanos por centrifugação gradiente de densidade, primeiro equilibre a solução de separação à temperatura ambiente.Transfira 20 mililitros em tubos de centrífugas de 15 mililitros, dois tubos por casaco de buffy. Diluir o sangue do casaco de buffy humano com HBSS para um volume total de 60 mililitros e camada 30 mililitros desta mistura cuidadosamente em cima do meio de separação. Centrifugar a 550 vezes g por 35 minutos em temperatura ambiente.Desligue o freio da centrífuga. Após a centrifugação, as células sanguíneas periféricas mononucleares estão localizadas diretamente em cima do meio de separação. Com uma pipeta, transfira essas células para um tubo de centrífuga fresco de 50 mililitros.Encha o tubo com HBSS a 50 mililitros e centrífuga a 170 vezes g por 10 minutos. Aspire o supernatante e resuspenque a pelota de célula em um pequeno volume de HBSS por pipetação. Em seguida, encha o tubo até 50 mililitros e centrífuga a 290 vezes g por 10 minutos.Aspire o supernasso novamente. Resuspengue as células em 50 mililitros de HBSS e centrífuga a 170 vezes g por 10 minutos. Aspire o supernasciente e resuspenque a pelota celular em um pequeno volume de um mililitro de tampão de separação, conte as células e adicione tampão a uma concentração de cinco vezes 10 às sete células por mililitro.Para o isolamento monócito das células sanguíneas periféricas mononucleares, use um kit de isolamento celular negativo magnético e siga o protocolo do fabricante. Use um contador celular automatizado para contar os monócitos e resuspend em meio monócito para uma concentração de duas vezes 10 às seis células por mililitro. Para cultivar monócitos, coloque um prato de cultura celular com um filme permeável de gás hidrofóbico adequado para células suspensas.Coloque as placas sob luz UV por aproximadamente 30 minutos para esterilização. Transfira de 15 a 25 mililitros da suspensão celular para essas placas de cultura e deixe-os descansar durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a pré-purificação na coluna AIEX e subsequente HIC dependente de cálcio, obteve-se proteína altamente pura.Como controle adicional, os monócitos humanos foram estimulados com LPS e produziram proteína silvestre. A exposição proteica a diferentes íons resulta em arranjo de diferentes oligômeros S100A12. O aumento das concentrações de zinco induz o arranjo de S100A12 em tetramers e hexamers após a separação na página SDS manchada de quatro a 20% Coomassie.Quando um excesso de íons foi aplicado antes da ligação cruzada, induziu uma mudança pronunciada do equilíbrio oligômero. O S100A12 foi cruzado na presença de 25 milimônios de cálcio ou 25 mililitros de cálcio e um mililitro de zinco. Após a ligação cruzada no tampão HBS com cloreto de cálcio de 25 milimilas e um cloreto de zinco milimila, hexamer e tetramer foram separados.Tetramer e dimer foram separados em tampão HBS com cloreto de cálcio de 25 milialares. Um exemplo de oligômeros agrupados e concentrados após a separação em uma página de SDS de quatro a 15% de gradiente mostra dimer, tetramer e hexamer. A estimulação monócito com hexameric S100A12 resultou em liberação alfa TNF pronunciada.Após a remoção da endotoxina, é importante não reintroduzir a contaminação nas amostras durante a posterior geração e purificação dos oligômeros. A análise a jusante de qualquer processo relacionado à oligomerização S100A12 é concebível. Da mesma forma, podem ser analisados aminoácidos e condições de íons que afetam o processo de oligomerização em si.Atualmente estamos usando oligômeros S100A12 separados de acordo com o protocolo descrito para desenvolver ligantes e anticorpos específicos para bloquear a sinalização da proteína através do TLF4 e para desenvolver e melhorar os ensaios diagnósticos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Purificação da população de células específicas de separação de células de fluorescência Ativado (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Imunologia e Infecção

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Avaliação quantitativa das células imunes no tecido medula lesionada por Citometria de Fluxo: um novo uso para um método de purificação celular

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolamento de células do sistema imunológico funcional cardíaca

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Imagem intravital da Thymus rato usando 2-Photon Microscopia

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Uma abordagem automatizada-Semi Preparando Antibody Cocktails para Análise imunofenotípica de Sangue Periférico Humano

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...