Name: purification of human s100a12 and its ion-induced oligomers for immune cell stimulation
Uploaded: 2019-09-29T12:30:00
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Este estudio fue apoyado por subvenciones del programa de investigación médica innovadora intramuros de la facultad de medicina de la Universidad de Muenster (KE121201 a C.K.) y la Fundación Alemana de Investigación (DFG, Fo354/3-1 a D.F.).

NOTA: Consulte la Tabla Suplementaria 1 para la preparación de tampones y soluciones de stock.
1. Expresión de proteínas en E. coli
<ol><li>
Clonación
	<ol>
<li>Clonar sin etiquetas s100A12 (secuencia de referencia NCBI: NP_005612.1) en vector de expresión bacteriana pET11b. Para expresar la proteína, transforme la construcción en E. coli BL21(DE3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultura
	<ol>
<li>Preparar ...

<ol>
	<li>Liston, A., Masters, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostasis-altering+molecular+processes+as+mechanisms+of+inflammasome+activation.">Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).</li><li>Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocyte-derived+S100+proteins+in+autoinflammation:+putative+role+in+pathogenesis+and+usefulness+as+biomarkers.">Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers.</a> Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).</li><li>Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+circular+dichroism+studies+of+iron(ii)+binding+to+human+calprotectin.">Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin.</a> Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).</li><li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein.">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).</li><li>Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nickel+Sequestration+by+the+Host-Defense+Protein+Human+Calprotectin.">Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).</li><li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12.">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex:+implications+for+host-parasite+defence.">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li><li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc:+new+insights+into+S100A12+oligomerisation.">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).</li><li>Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+human+(S100A8/S100A9)2+heterotetramer,+calprotectin,+illustrates+how+conformational+changes+of+interacting+alpha-helices+can+determine+specific+association+of+two+EF-hand+proteins.">The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+Ca2++and+Zn2++are+essential+for+S100A12+protein+oligomerization+and+function.">Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function.</a> BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).</li><li>Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ions+binding+to+S100+proteins.+I.+Calcium-+and+zinc-binding+properties+of+bovine+brain+S100+alpha+alpha,+S100a+(alpha+beta),+and+S100b+(beta+beta)+protein:+Zn2++regulates+Ca2++binding+on+S100b+protein.">Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).</li><li>Dell&#8217;Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+binding+properties+of+calgranulin+C,+a+novel+S100-like+calcium-binding+protein+from+pig+granulocytes.">Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).</li><li>Vogl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A12+is+expressed+exclusively+by+granulocytes+and+acts+independently+from+MRP8+and+MRP14.">S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).</li><li>Hofmann, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+mediates+a+novel+proinflammatory+axis:+a+central+cell+surface+receptor+for+S100/calgranulin+polypeptides.">RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides.</a> Cell. 97 (7), 889-901 (1999).</li><li>Foell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+S100A12+Can+Activate+Human+Monocytes+via+Toll-like+Receptor+4.">Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).</li><li>Kessel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+zinc+tune+autoinflammatory+Toll-like+receptor+4+signaling+by+S100A12.">Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).</li><li>Armaroli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-Derived+Interleukin-1beta+As+the+Driver+of+S100A12-Induced+Sterile+Inflammatory+Activation+of+Human+Coronary+Artery+Endothelial+Cells:+Implications+for+the+Pathogenesis+of+Kawasaki+Disease.">Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).</li><li>GE Healthcare. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Strategies for Protein Purification. Handbook. , (2010).</li><li>Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+Purification,+and+Antimicrobial+Activity+of+S100A12.">Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).</li><li>Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+S100+Protein-Protein+Complexes.">Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).</li><li>Magalhaes, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+endotoxin+removal+from+biological+preparations:+a+review.">Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review.</a> Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).</li><li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+removal+from+protein+solutions.">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li><li>Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+partial+characterization+of+canine+S100A12.">Purification and partial characterization of canine S100A12.</a> Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).</li><li>Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+human+Ca2+-bound+S100A12.">Solution structure of human Ca2+-bound S100A12.</a> Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).</li><li>Endotoxin Removal. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).</li><li>Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymyxin-B+Stimulates+Production+of+Complement+Components+and+Cytokines+in+Human+Monocytes.">Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).</li><li>Valentinis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+effects+of+polymyxin+B+on+human+dendritic+cells+maturation+-+The+role+of+I+kappa+B-alpha/NF-kappa+B+and+ERK1/2+pathways+and+adhesion.">Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).</li><li>Teuber, M., Miller, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Binding+of+Polymyxin-B+to+Negatively+Charged+Lipid+Monolayers.">Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).</li></ol>

En este protocolo, describimos la expresión bacteriana libre de etiquetas del S100A12 humano y su purificación, así como la separación en diferentes oligómeros inducidos por iones para la estimulación de células inmunitarias. En comparación con la literatura publicada sobre la purificación de proteínas S100A128,23,24, el uso de caCl2 alto (25 mM) en la cromatografía de interacción hidrofóbica es para nues...

S100A12 es una proteína de unión al calcio que es producida predominantemente por granulocitos humanos. La proteína se sobreexpresa durante la inflamación (sistémica) y sus niveles séricos, particularmente en enfermedades (auto)inflamatorias como la artritis idiopática juvenil sistémica (SJIA), la fiebre mediterránea familiar (FMF) o la enfermedad de Kawasaki (KD) pueden informar sobre actividad de la enfermedad y la respuesta a la terapia. Dependiendo de los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) tales como receptores similares a los peajes (TLR), el sistema inmunitario innato puede ser activado por patrones moleculares asociados a patógenos (PamP) como lipopolisacáridos (LPS) o patrones moleculares asociados al daño (DPP; también se denominan "alarmins"). Los DAPP son moléculas endógenas como proteínas celulares, lípidos o ácidos nucleicos1. Las funciones DAMP están bien descritas para los miembros de la familia de proteínas de calgranulina, S100A8/A9 y S100A122, que también se informa que funcionan como péptidos antimicrobianos de iones metálicos divalentes3,4, 5,6. Dependiendo de la resistencia iónica disponible S100A12 puede, al igual que otros miembros de la familia S100, organizarse en diferentes homomultimeros y hasta hace poco se desconocía el impacto del oligomerización S100A12 en la interacción PRR, particularmente TLR4.
La forma monomérica de la proteína (92 aminoácidos, 10,2 kDa) consiste en dos estructuras de hélice-bucle-hélice de mano EF conectadas por un vinculador flexible. El C-terminalEF-hand contiene el motivo clásico de unión Ca2+,mientras que el N-terminalEF-hand exhibe una estructura de bucle extendido específica de proteína S100 ('pseudo-EF-hand') y revela una reducción de Ca2+-afinidad. Ca2+-unión por S100A12 puede inducir un cambio de conformación importante en la proteína' C-terminus, que resulta en la exposición de un parche hidrófobo en cada monómero y forma la interfaz de dimerización. Así, en condiciones fisiológicas, la estructura cuaternaria más pequeña formada por S100A12 es un dímero no covalente (aproximadamente 21 kDa) en el que los monómeros individuales están en orientación antiparalela. Cuando se organiza como dimer, S100A12 se divulga para secuestrar Zn2+ así como otros iones de metal divalente, por ejemplo, Cu2+ con alta afinidad7. Estos iones están coordinados en la interfaz de dimer S100A12 por los aminoácidos H15 y D25 de una subunidad y H85, así como H89 de la subunidad antiparalela8,9,10. Mientras que estudios anteriores proponen que Zn2+-cargado S100A12 puede inducir la organización de la proteína en homo-tetrameros (44 kDa) y para dar lugar a un aumento de Ca2+-afinidad11,12, reciente valoración de metal estudios6 sugieren Ca2+-unión por S100A12 para aumentar la afinidad de la proteína a Zn2+. Una vez que las manos EF S100A12 están completamente ocupadas por Ca2+,se cree que Ca2+ adicional se une entre dimers, desencadenando la formación de hexamer (aproximadamente 63 kDa). La arquitectura de la estructura de los barrios hexamíricos es claramente diferente de la del tetrámero. Se propone que la interfaz de los tetrámeros se interrumpa para dar lugar a nuevas interfaces dimer-dimer que benefician la formación de hexamer10. S100A12 es expresado casi exclusivamente por granulocitos humanos donde constituye alrededor del 5% de toda la proteína citosólica13. En su función DAMP S100A12 fue históricamente descrito como agonista del receptor multi-ligand para productos finales de glicación avanzada (RAGE), luego denominado proteína de unión RAGE (EN-RAGE)14. Aunque anteriormente informamos bioquímico S100A12-unión a RAGE y TLR415, recientemente demostramos monocitos humanos para responder a la estimulación S100A12 de una manera dependiente de TLR416. Esto requiere la disposición de S100A12 en su Ca2+/Zn2+-inducida estructura de trimestral hexameric16.
Aquí describimos un procedimiento de purificación para el S100A12 humano recombinante y sus oligómeros inducidos por iones para estimulaciones celulares inmunes16,17. Esto se basa en una estrategia de cromatografía de dos pasos, que inicialmente incluye una columna de intercambio de aniones para aislar y concentrar la proteína y eliminar las contaminaciones a granel (por ejemplo, endotoxinas/lipopolisacáridos)18. Las resinas de cromatografía de intercambio iónico separan las proteínas sobre la base de diferentes cargas netas de superficie. Para proteínas ácidas como S100A12 (punto isoeléctrico de 5.81), un sistema tampón con un pH de 8.5 y una resina fuerte de intercambio de aniones conduce a una buena separación. Las proteínas enlazadas se eluyen con un gradiente de tampón de alta sal. Con un aumento de iones negativos de fuerza iónica en el tampón de elución competir con las proteínas para las cargas en la superficie de la resina. Las proteínas eluyen individualmente dependiendo de su carga neta y en consecuencia, los tampones descritos en este documento permiten aislar y concentrar la proteína S100A12 sobreexpresada. Debido a grupos cargados negativamente en lipopolisacáridos, estas moléculas también se unen a resinas de intercambio de aniones. Sin embargo, su mayor carga neta resulta en la elución posterior en el gradiente de alta sal aplicado. El segundo paso del procedimiento de purificación se ha introducido con fines de pulido. Esto hace uso de la capacidad de unión al calcio de S100A12 y elimina las impurezas restantes en una columna hidrofóbica-interacción. La unión al calcio de S100A12 conduce a un cambio de conformación y a una exposición de parches hidrófobos en la superficie de la proteína. En esa condición, S100A12 interactúa con la superficie hidrófoba de la resina. Al quelar el calcio por EDTA, esta interacción se invierte. En presencia de iones, especialmente calcio y zinc, S100A12 se organiza en oligómeros homoméricos. Para estudiar las relaciones estructura-función de los diferentes oligómeros, estabilizamos el recombinante dimerico, tetramírico y hexámero S100A12 con un retitulador químico y separamos los complejos en una columna de cromatografía de exclusión de tamaño. Por último, para analizar la funcionalidad y la actividad biológica de la proteína purificada y sus oligómeros inducidos por iones, se puede comparar la liberación de citoquinas de S100A12 y lpS estimulado monocitos.
Hasta el momento se han descrito varios métodos para purificar S100A12. 19, por ejemplo, publicaron un protocolo con purificación a través de una columna de intercambio de aniones y una posterior cromatografía de exclusión de tamaño. El pulido de purificación en una columna de exclusión de tamaño da como resultado buenos resultados, pero, por ejemplo, debido a volúmenes de carga limitados, es menos flexible en escalabilidad. Un enfoque diferente, publicado por Kiss et al.20, describe la purificación de la proteína etiquetada a través de la columna de afinidad Ni2+ como el primer paso de purificación, seguido de escisión enzimática para eliminar la etiqueta y otros pasos de purificación. A diferencia de los estudios citados19,20, la proteína producida como se describe en este protocolo se determina para experimentos en células inmunitarias. Por lo tanto, la contaminación por endotoxinas remanentes del cultivo bacteriano es un desafío. Aunque hasta ahora se han descrito diferentes enfoques para la eliminación de endotoxinas, no existe un método uniforme que funcione igual de bien para cualquier solución proteicadada 21,22.
En resumen, nuestro protocolo combina las ventajas de una expresión libre de etiquetas en un sistema bacteriano con eliminación eficiente de endotoxinas y alto rendimiento de proteína pura.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pET11b vector</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x Non-essential amino acids</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K 0293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% HCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X897.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8722;20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciumchlorid Dihydrat</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5239.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human Monocyte Enrichment Kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19059</td>
			<td>Magnetic negative cell isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoLISA</td>
			<td>Hyglos</td>
			<td>609033</td>
			<td>Endotoxin detection assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin-Free Ultra Pure Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TMS-011-A</td>
			<td>Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoTrap red</td>
			<td>Hyglos</td>
			<td>321063</td>
			<td>Endotoxin removal resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (heat-inactivated)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (high quality, endotoxin testet)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hTNF-alpha - OptEia ELISA Set</td>
			<td>BD</td>
			<td>555212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (isopropyl-&#223;-D-thiogalactopyranosid)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN08.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K 0282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Medium</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L6529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll, human</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-60500</td>
			<td>Separation solution (density gradient centrifugation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A 2212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl Sepharose High Performance</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1082-01</td>
			<td>Resin for hydrophobic interaction chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-pmb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Resin for anion-exchange chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSep buffer</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>20104</td>
			<td>Cell separation buffer (section 5.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F 1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P031.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SLHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL roundbottom tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Erlenmyer flask</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>LY98.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well suspension plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 L measuring beaker</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CKN3.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL high-speed centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3,01,22,178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (100 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Closures</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep magnet &#39;The Big Easy`</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector tubes 5 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>115101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox film, 25 &#181;m, 305 mm x 40 m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94,60,77,316</td>
			<td>Film for monocyte culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa)</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop filter unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Incubator (with shaking)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA purifier UPC 10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Frac-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (with rotor A-4-81)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F-34-6-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean Tetra Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPhotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>P330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Brandelin</td>
			<td>UW2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>infinite M200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td>765</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of human s100a12 and its ion-induced oligomers for immune cell stimulation

En este protocolo, describimos un método para purificar la proteína humana de unión al calcio S100A12 y sus oligómeros inducidos por iones del cultivo de Escherichia coli para estimulaciones de células inmunitarias. Este protocolo se basa en una estrategia de cromatografía de dos pasos, que comprende la pre-purificación de proteínas en una columna de cromatografía de intercambio de aniones y un paso de pulido posterior en una columna de interacción hidrofóbica. Esta estrategia produce proteína S100A12 de alta pureza y rendimiento a costos manejables. Para ensayos funcionales en células inmunitarias, la contaminación por endotoxinas remanentes requieren un control cuidadoso y más pasos de limpieza para obtener proteínalibre de endotoxinas. La mayoría de las contaminaciones por endotoxinas pueden excluirse mediante cromatografía de intercambio de aniones. Para agotar las contaminaciones residuales, este protocolo describe un paso de eliminación con filtros centrífugos. Dependiendo de la resistencia iónal disponible S100A12 puede organizarse en diferentes homomultimers. Para investigar la relación entre estructura y función, este protocolo describe además el tratamiento iónico de la proteína S100A12 seguido de la reticulación química para estabilizar los oligómeros S100A12 y su posterior separación por exclusión de tamaño Cromatografía. Por último, describimos un ensayo a base de células que confirma la actividad biológica de la proteína purificada y confirma la preparación libre de LPS.

Tras la pre-purificación en la columna AIEX(Figura 1A-C) y posterior HIC dependiente del calcio(Figura 2A,B),se obtuvo proteína altamente pura (Figura 2C). Además, las mediciones de endotoxina revelaron una eliminación exitosa de LPS. El contenido de LPS después de AIEX se midió en una dilución 1:10 por encima del límite de detección de ensayos, es decir, por encima de 500 EU/mL. Después d...

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Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

Este protocolo describe un método de purificación para la proteína de unión al calcio sin etiquetas recombinante S100A12 y sus oligómeros inducidos por iones para ensayos de estimulación de monocitos humanos.

Purificación del S100A12 humano y sus oligomeros inducidos por iones para la estimulación celular inmune

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

Este protocolo describe un procedimiento de purificación completo para la proteína de unión al calcio humano, S100A12, y en particular, para sus diferentes oligómeros inducidos por iones para implicaciones de investigación posteriores. Con esta técnica, somos capaces de mantener un alto rendimiento de proteínas muy puras y libres de endotoxinas. La reticulación química y la separación en la columna de cromatografía de exclusión de tamaño es un método convincente para generar proteínas homo-oligoméricas para otros ensayos funcionales.Nuestra técnica nos permite los aspectos mecanicistas de S100A12 como ligando del receptor de reconocimiento de patrones e información de arte para desarrollar idealmente nuevas intervenciones dirigidas y mejorar los ensayos diagnósticos. Además de ver este vídeo, recomendamos una lectura cuidadosa del protocolo, ya que describimos un procedimiento complejo de varios pasos. Para comenzar, corte un tubo de diálisis en una longitud adecuada, alrededor de 30 centímetros, con espacio adicional para el aire.Sumerja la membrana en agua desionizada durante 15 a 30 minutos para eliminar el glicerol. Para reducir la viscosidad de la solución proteica despejada, diluya la solución con 25 mililitros de Tampón A.Adjunte el primer cierre en el tubo. Cargue la muestra en la membrana y conecte el segundo cierre al menos un centímetro del extremo superior del tubo.En una habitación enfriada a cuatro grados centígrados, coloque el recipiente con Tampón A DEIEX en una placa de agitación, agregue una barra de agitación y la membrana llena de solución proteica. Ajuste la velocidad para girar la muestra de modo que no haya interferencias con la barra de agitación giratoria. Dialyze durante 12 a 24 horas a cuatro grados Centígrados luego reemplace el búfer dializado por el búfer A libre y continúe durante al menos cuatro horas adicionales.Transfiera la solución de proteína dializada del tubo a un tubo de 50 mililitros a través de una unidad de filtro de 0,45 micras. Inicie el FPLC con mantenimiento general. Conecte los búferes de columna AIEX A y AIEX B a las válvulas de almacenamiento intermedio y a la resina de intercambio de aniones que contiene la columna a los puertos de columna del FPLC.Ajuste los parámetros cromatográficos generales en consecuencia. Inicie el programa AIEX en el software FPLC y elija el volumen de equilibrio para el búfer A.Posteriormente, cargue la muestra en la columna y elula las proteínas con un gradiente lineal de 0%a 100% de alto tampón de sal. Recoger dos fracciones de mililitro durante la elución.Analice las fracciones eluidas después de finalizar la carrera. Para ello, cargue 10 microlitros de cada fracción en una página de Coomassie manchada 15%SDS e identifique fracciones que contengan S100A12. A la vez, a la venta de estas fracciones que contienen S100A12 para diálisis en solución salina con búfer TRIS.Para continuar la purificación de proteínas, después de la diálisis proteica, añadir un cloruro de calcio a la muestra a una concentración final de 25 milimolares, lo que facilitará la unión de S100A12 a la resina en el siguiente paso. A continuación, filtre la muestra a través de un filtro con un tamaño de vertido de 0,45 micras. Equilibrar los tampones HIC y las muestras a cuatro grados centígrados.A continuación, conecte los búferes de columna HIC A y B y la columna al sistema y ajuste los parámetros. Inicie el método para equilibrar la columna con volúmenes de una a dos columnas de búfer HIC A y cargue la muestra y el bloque de muestra sin enlazar de lavado con una señal UV alcance de nuevo el nivel de línea de base. A continuación, comience la elución con un quelante de calcio que contenga tampón EDTA.Recoger dos mililitros de fracciones pico durante la elución. Después de analizar 10 microlitros de cada fracción en una página de Coomassie manchada 15%SDS identificar fracciones S100A12 puras. Agrupa estas fracciones y dialyze contra HBS.En primer lugar, cargue 15 mililitros de muestra en una unidad de filtro centrífugo de 50 kilodalton. Centrifugar a 3200 veces g a 10 grados Celsius durante aproximadamente 10 minutos. Transfiera el flujo filtrado a través de un recipiente fresco, sobre hielo.Ahora, utilice un mililitro de HBS para enjuagar la membrana del filtro y para la dilución de la solución concentrada en la punta del filtro. Centrifugar de nuevo para recuperar tanta proteína como sea posible en el flujo a través. Para filtrar la solución, repita la carga y centrifugación de la muestra tantas veces como sea necesario.A continuación, para concentrar el S100A12 que contiene flujo a través, cárguelo en un filtro centrífugo de tres kilodalton y centrífuga a 3200 veces g, 10 grados Celsius durante aproximadamente 30 minutos. Ahora el volumen se reduce a 1/5 hasta 1/10 del volumen de carga inicial. Transfiera la solución concentrada a un tubo nuevo.Repita el paso de concentración tantas veces como sea necesario. Después de la reticulación química, según el manuscrito, realizar cromatografía de exclusión de tamaño. Equilibre la columna en HBS, cargue la muestra y recoja fracciones máximas de uno a dos mililitros durante la ejecución.Después de analizar estas fracciones en una página SDS de cuatro a 20%gradiente, las fracciones de grupo con bandas principales del complejo proteico deseado. A continuación, concentre las soluciones como se hizo anteriormente. Para aislar los monocitos de las capas de puly humana por centrifugación de gradiente de densidad, primero equilibre la solución de separación a temperatura ambiente.Transfiera 20 mililitros en tubos centrífugos de 15 mililitros, dos tubos por capa de buffy. Diluir la sangre de la capa de buffy humana con HBSS a un volumen total de 60 mililitros y capa 30 mililitros de esta mezcla cuidadosamente en la parte superior del medio de separación. Centrifugar a 550 veces g durante 35 minutos a temperatura ambiente.Apague el freno de la centrífuga. Después de la centrifugación, las células sanguíneas periféricas mononucleares se encuentran directamente en la parte superior del medio de separación. Con una pipeta, transfiera estas células a un tubo de centrífuga fresco de 50 mililitros.Llene el tubo con HBSS a 50 mililitros y centrifugar a 170 veces g durante 10 minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en un pequeño volumen de HBSS por pipeteo. A continuación, llene el tubo hasta 50 mililitros y centrifuga a 290 veces g durante 10 minutos.Aspirar el sobrenadante de nuevo. Resuspender las células en 50 mililitros de HBSS y centrífuga a 170 veces g durante 10 minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender el gránulo celular en un pequeño volumen de un mililitro de tampón de separación, contar las células y agregar buffer a una concentración de cinco veces 10 a las siete células por mililitro.Para el aislamiento de monocitos de las células sanguíneas periféricas mononucleares, utilice un kit de aislamiento magnético negativo de células y siga el protocolo del fabricante. Utilice un contador de células automatizado para contar los monocitos y resuspend en el medio de monocitos a una concentración de dos veces 10 a las seis células por mililitro. Para cultivar monocitos, establecer un plato de cultivo celular con una película permeable al gas hidrófobo adecuado para las células de suspensión.Coloque las placas debajo de la luz UV durante aproximadamente 30 minutos para la esterilización. Transfiera de 15 a 25 mililitros de la suspensión celular a estas placas de cultivo y déjelos reposar durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Tras la pre-purificación en la columna AIEX y el posterior HIC dependiente del calcio, se obtuvo proteína altamente pura.Como control adicional, los monocitos humanos fueron estimulados con LPS y produjeron proteínas de tipo silvestre. La exposición proteica a diferentes iones da como resultado la disposición de diferentes oligómeros S100A12. El aumento de las concentraciones de zinc induce la disposición de S100A12 en tetrámeros y hexámeros tras la separación en la página de SDS teñida de cuatro a 20%Coomassie.Cuando se aplicó un exceso de iones antes de la reticulación, indujo un cambio pronunciado del equilibrio del oligómero. S100A12 se retició en presencia de 25 mililitros de calcio o 25 milimolares de calcio y un zinc milimolar. Después de la reticulación en tampón HBS con cloruro de calcio 25 milimolar y un cloruro de zinc milimolar, se separaron hexámeros y tetrámeros.El tetrámero y el dimer se separaron en tampón HBS con cloruro de calcio de 25 milimolares. Un ejemplo de oligómeros agrupados y concentrados después de la separación en una página SDS de cuatro a 15% de gradiente de Coomassie muestra dimer, tetrámero y hexámero. La estimulación monocito con S100A12 hexamérico dio como resultado una liberación alfa TNF pronunciada.Después de la eliminación de la endotoxina, es importante no reintroducir la contaminación en las muestras durante la posterior generación y purificación de los oligómeros. El análisis descendente de cualquier proceso relacionado con la oligomerización S100A12 es concebible. Del mismo modo, se pueden analizar aminoácidos y condiciones iónicas que afectan al propio proceso de oligomerización.Actualmente estamos usando oligómeros S100A12 separados según el protocolo descrito para desarrollar ligandos de péptidos específicos y anticuerpos para bloquear la señalización de la proteína a través de TLF4 y para desarrollar y mejorar los ensayos de diagnóstico.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

La purificación de la población de células específicas de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Investigación

Inmunología e Infección

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Evaluación cuantitativa de las células inmunes en el tejido de la médula espinal lesionada por citometría de flujo: un nuevo uso de un método de purificación celular

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Análisis por citometría de flujo de células inmunes dentro de aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Aislamiento de células inmunes funcionales cardíacos

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Imagen intravital del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

Generación de nódulos linfáticos de grasa Pad quimeras para el Estudio del Ganglio Linfático estroma origen de célula

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Un enfoque semi-automatizado de preparación de cócteles de anticuerpos para el Análisis Inmunofenotípicos de la sangre periférica humana

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Aislamiento y análisis de citometría de flujo de células inmunes del cerebro isquémico Ratón

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...