Name: purification of human s100a12 and its ion-induced oligomers for immune cell stimulation
Uploaded: 2019-09-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation at JoVE.com

Denna studie stöddes av bidrag från interna innovativa medicinska forskningsprogram av Muenster University Medical fakultet (KE121201 till C.K.) och den tyska Research Foundation (DFG, Fo354/3-1 till D.F.).

Anmärkning: Se kompletterande tabell 1 för beredning av buffertar och lagerlösningar.
1. protein uttryck i E. coli
<ol><li>
Kloning
	<ol>
<li>Klon tag-fri mänsklig S100A12 (NCBI hänvisningen ordningsföljd: NP_ 005612.1) in i bakteriell uttryck vektor pET11b. För att uttrycka proteinet, omvandla konstruktionen till E. coli BL21 (de3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kultur
	<ol>
<li>Förbered en förrätt kul...

<ol>
	<li>Liston, A., Masters, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostasis-altering+molecular+processes+as+mechanisms+of+inflammasome+activation.">Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).</li><li>Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocyte-derived+S100+proteins+in+autoinflammation:+putative+role+in+pathogenesis+and+usefulness+as+biomarkers.">Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers.</a> Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).</li><li>Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+circular+dichroism+studies+of+iron(ii)+binding+to+human+calprotectin.">Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin.</a> Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).</li><li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein.">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).</li><li>Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nickel+Sequestration+by+the+Host-Defense+Protein+Human+Calprotectin.">Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).</li><li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12.">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex:+implications+for+host-parasite+defence.">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li><li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc:+new+insights+into+S100A12+oligomerisation.">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).</li><li>Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+the+human+(S100A8/S100A9)2+heterotetramer,+calprotectin,+illustrates+how+conformational+changes+of+interacting+alpha-helices+can+determine+specific+association+of+two+EF-hand+proteins.">The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+Ca2++and+Zn2++are+essential+for+S100A12+protein+oligomerization+and+function.">Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function.</a> BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).</li><li>Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ions+binding+to+S100+proteins.+I.+Calcium-+and+zinc-binding+properties+of+bovine+brain+S100+alpha+alpha,+S100a+(alpha+beta),+and+S100b+(beta+beta)+protein:+Zn2++regulates+Ca2++binding+on+S100b+protein.">Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).</li><li>Dell&#8217;Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+binding+properties+of+calgranulin+C,+a+novel+S100-like+calcium-binding+protein+from+pig+granulocytes.">Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).</li><li>Vogl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A12+is+expressed+exclusively+by+granulocytes+and+acts+independently+from+MRP8+and+MRP14.">S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).</li><li>Hofmann, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+mediates+a+novel+proinflammatory+axis:+a+central+cell+surface+receptor+for+S100/calgranulin+polypeptides.">RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides.</a> Cell. 97 (7), 889-901 (1999).</li><li>Foell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+S100A12+Can+Activate+Human+Monocytes+via+Toll-like+Receptor+4.">Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).</li><li>Kessel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+zinc+tune+autoinflammatory+Toll-like+receptor+4+signaling+by+S100A12.">Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).</li><li>Armaroli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-Derived+Interleukin-1beta+As+the+Driver+of+S100A12-Induced+Sterile+Inflammatory+Activation+of+Human+Coronary+Artery+Endothelial+Cells:+Implications+for+the+Pathogenesis+of+Kawasaki+Disease.">Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).</li><li>GE Healthcare. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Strategies for Protein Purification. Handbook. , (2010).</li><li>Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+Purification,+and+Antimicrobial+Activity+of+S100A12.">Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).</li><li>Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+S100+Protein-Protein+Complexes.">Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).</li><li>Magalhaes, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+endotoxin+removal+from+biological+preparations:+a+review.">Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review.</a> Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).</li><li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+removal+from+protein+solutions.">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li><li>Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+partial+characterization+of+canine+S100A12.">Purification and partial characterization of canine S100A12.</a> Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).</li><li>Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+human+Ca2+-bound+S100A12.">Solution structure of human Ca2+-bound S100A12.</a> Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).</li><li>Endotoxin Removal. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).</li><li>Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymyxin-B+Stimulates+Production+of+Complement+Components+and+Cytokines+in+Human+Monocytes.">Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).</li><li>Valentinis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+effects+of+polymyxin+B+on+human+dendritic+cells+maturation+-+The+role+of+I+kappa+B-alpha/NF-kappa+B+and+ERK1/2+pathways+and+adhesion.">Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).</li><li>Teuber, M., Miller, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Binding+of+Polymyxin-B+to+Negatively+Charged+Lipid+Monolayers.">Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).</li></ol>

I detta protokoll beskriver vi taggfria bakteriella uttryck för Human S100A12 och dess rening samt separation i olika Jon-inducerad oligomerer för immun cell stimulering. Jämfört med publicerad litteratur om S100A12 Proteinrening8,23,24, användning av hög CaCl2 (25 mm) i hydrofoba-interaktionskromatografi är att vår kunskap unik. Flera protokoll som tillämpar koncentrationer från 1 till 5 mM producerar rent ...

S100A12 är ett kalcium bindnings protein som huvudsakligen framställs av humana granulocyter. Proteinet är överuttryckt under (systemisk) inflammation och dess serumnivåer, särskilt i (Auto) inflammatoriska sjukdomar som systemisk juvenil idiopatisk artrit (sJIA), familjär medelhavs feber (FMF) eller Kawasakis sjukdom (KD) kan informera om sjukdomsaktivitet och behandlingssvar. Beroende på mönsterigenkänning receptorer (PRRs) såsom Toll-liknande receptorer (TLRs), det medfödda immunförsvaret kan aktiveras av patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) som lipopolysackarider (LPS) eller skada associerade molekylära mönster (DAMPs; kallas också "alarmins"). DAMPs är endogena molekyler såsom cellulära proteiner, lipider eller nukleinsyror1. Fukt-funktioner är väl beskrivna för medlemmarna i calgranulin protein familjen, S100A8/A9 och S100A122, som också rapporteras att fungera som tvåvärda metall Ion-kelering antimikrobiella peptider3,4, 5,6. Beroende på tillgänglig jonstyrka kan S100A12, liksom andra medlemmar av S100 familjen, arrangera i olika homomultimers och tills nyligen effekterna av S100A12-oligomerisation på PRR-interaktion, särskilt TLR4, var okänd.
Proteinernas monomerform (92 aminosyror, 10,2 kDa) består av två EF-hand Helix-loop-Helix strukturer som förbinds med en flexibel länkare. C-terminalen EF-hand innehåller det klassiska ca2 +-bindande motivet medan N-terminalen EF-hand uppvisar en S100 proteinspecifik utökad loop struktur ("pseudo-EF-hand") och avslöjar reducerad ca2 +-affinitet. Ca2 +-bindning av S100A12 kan inducera en större konformationsförändring i proteinerna C-Terminus, vilket resulterar i exponering av ett hydrofoba plåster på varje monomer och bildar Dimerization gränssnittet. Sålunda, under fysiologiska förhållanden, den minsta kvartärgeologi struktur som bildas av S100A12 är en icke-kovalent dimer (ca 21 kDa) där enskilda monomerer är i antiparallell orientering. När arrangeras som dimer, S100A12 rapporteras till binda Zn2 + samt andra tvåvärda metalljoner, e.g., Cu2 + med hög affinitet7. Dessa joner koordineras på S100A12 dimer att samverka vid amino syror H15 och D25 av en subenhet och H85 as well as H89 av anti-parallellingen annan subenhet8,9,10. Medan tidigare studier föreslår att Zn2 +-Loaded S100A12 kan inducera proteiners organisation till Homo-tetramers (44 kDa) och att resultera i ökad ca2 +-affinitet11,12, senaste metalltitrering studier6 föreslå ca2 +-bindande av S100A12 att öka proteinens affinitet till Zn2 +. När S100A12 EF-händerna är fullt upptagna av ca2 +, är ytterligare ca2 + tänkt att binda mellan dimers, utlöser hexamer formation (ca 63 kDa). Arkitekturen av den hexameric kvartenär strukturerar är klart olik från det av tetrameren. Det föreslås att tetramer gränssnittet störs för att ge upphov till nya dimer-dimer gränssnitt som gynnar hexamer formation10. S100A12 är nästan uteslutande uttrycks av humana granulocyter där det utgör cirka 5% av alla cytosoliska protein13. I dess fuktigt fungera S100A12 beskrevs historically som agonist av mång--ligand receptor för avancerade glycation slut-produkter (ursinne), därefter kallat extracellulära nyidentifierat RAGE-binding protein (EN-RAGE)14. Även om vi tidigare rapporterat biokemiska S100A12-bindande för både RAGE och TLR415, vi visade nyligen mänskliga monocyter att reagera på S100A12 stimulering på ett TLR4-beroende sätt16. Detta kräver arrangemang av S100A12 i sin ca2 +/Zn2 +-inducerad hexameric kvartenär struktur16.
Här beskriver vi en renings procedur för rekombinant human S100A12 och dess Jon-inducerad oligomerer för immun cells stimuleringar16,17. Detta är baserat på en tvåstegs kromatografistrategi, som inledningsvis innehåller en anjonbyteskolumn för att isolera och koncentrera proteinet och ta bort bulkföroreningar (t. ex. endotoxiner/lipopolysackarider)18. Jonbyteskromatografi hartser separerar proteiner på grundval av olika netto ytladdningar. För sura proteiner som S100A12 (isoelektrisk punkt 5,81), ett buffertsystem med ett pH på 8,5 och en stark anjonbytarharts leder till en bra separation. Bundna proteiner var eluerade med en hög salt buffert gradient. Med en ökning av jonisk styrka negativa joner i elutionsbufferten konkurrera med proteiner för laddningar på ytan av hartset. Proteiner individuellt eluera beroende på deras netto avgift och i följd av detta, buffertarna beskrivs häri gör det möjligt att isolera och koncentrera överuttryckt S100A12 protein. På grund av negativt laddade grupper i lipopolysackarider, dessa molekyler binder också till anjonbytarhartser. Emellertid resulterar deras högre netto laddning i mer sistnämnd eluering i den applicerade High-salt lutningen. Det andra steget i renings förfarandet har införts för polering ändamål. Detta utnyttjar kalcium bindnings förmågan hos S100A12 och avlägsnar kvarvarande orenheter på en hydrofoba-interaktionskolonn. Kalcium bindning av S100A12 leder till en konformationsförändring och en exponering av hydrofoba fläckar på ytan av proteinet. På detta villkor, S100A12 interagerar med hydrofoba ytan av hartset. Vid kalcium-kelering av EDTA, denna interaktion är omvänd. I närvaro av joner, särskilt kalcium och zink, S100A12 arrangerar i homomeriska oligomerer. För att studera struktur-funktion relationer av de olika oligomererna, stabiliserades vi dimeric, tetrameriska och hexameric rekombinant S100A12 med en kemisk crosslinker och separerade komplexen på en storlek-uteslutning kromatografi kolonn. Slutligen, för att analysera funktionalitet och biologisk aktivitet av det renade proteinet och dess Jon-inducerad oligomerer, cytokin frisättning av S100A12 och LPS stimuleras monocyt kan jämföras.
Olika metoder för rening av S100A12 har hittills beskrivits. Jackson et al.19publicerade till exempel ett protokoll med rening via en anjonbyteskolumn och en efterföljande kromatografi med storleks uteslutning. Rening polering på en storlek-uteslutning kolumn leder till goda resultat, men ― på grund av till exempel begränsad lastning volymer ― är mindre flexibel i skalbarhet. En annan metod, publicerad av Kiss et al.20, beskriver rening av märkta protein via ni2 + affinitetskolonn som första reningssteg, följt av enzymatisk klyvning för att ta bort taggen och ytterligare reningssteg. I motsats till de aforecited studierna19,20, det producerade proteinet som beskrivs i detta protokoll bestäms för experiment på immunceller. Därför är rester av endotoxin från bakteriekulturen en utmaning. Även om olika metoder för avlägsnande av endotoxin har beskrivits hittills finns det ingen enhetlig metod som fungerar lika bra för en given proteinlösning21,22.
Sammanfattnings, vårt protokoll kombinerar fördelarna med en tagg-fritt uttryck i ett bakterie system med effektiv endotoxin avlägsnande och hög avkastning av rent protein.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pET11b vector</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x Non-essential amino acids</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K 0293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% HCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X897.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8722;20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciumchlorid Dihydrat</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5239.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human Monocyte Enrichment Kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19059</td>
			<td>Magnetic negative cell isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoLISA</td>
			<td>Hyglos</td>
			<td>609033</td>
			<td>Endotoxin detection assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin-Free Ultra Pure Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TMS-011-A</td>
			<td>Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoTrap red</td>
			<td>Hyglos</td>
			<td>321063</td>
			<td>Endotoxin removal resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (heat-inactivated)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (high quality, endotoxin testet)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hTNF-alpha - OptEia ELISA Set</td>
			<td>BD</td>
			<td>555212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (isopropyl-&#223;-D-thiogalactopyranosid)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN08.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>K 0282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Medium</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L6529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll, human</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-60500</td>
			<td>Separation solution (density gradient centrifugation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A 2212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenyl Sepharose High Performance</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1082-01</td>
			<td>Resin for hydrophobic interaction chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-pmb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Resin for anion-exchange chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSep buffer</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>20104</td>
			<td>Cell separation buffer (section 5.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F 1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P031.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SLHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL roundbottom tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Erlenmyer flask</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>LY98.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well suspension plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 L measuring beaker</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CKN3.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL high-speed centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3,01,22,178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (100 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Closures</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep magnet &#39;The Big Easy`</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector tubes 5 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>115101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox film, 25 &#181;m, 305 mm x 40 m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94,60,77,316</td>
			<td>Film for monocyte culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa)</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop filter unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Incubator (with shaking)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA purifier UPC 10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Frac-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (with rotor A-4-81)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed angle rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F-34-6-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean Tetra Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPhotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>P330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Brandelin</td>
			<td>UW2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>infinite M200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td>765</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of human s100a12 and its ion-induced oligomers for immune cell stimulation

I detta protokoll beskriver vi en metod för att rena humant kalcium-bindande protein S100A12 och dess Jon-inducerad oligomerer från Escherichia coli kultur för immun cell stimulationer. Detta protokoll är baserat på en tvåstegs kromatografistrategi, som omfattar protein för rening på en anjonbyteskromatografi och ett efterföljande polersteg på en hydrofoba-interaktionskolonn. Denna strategi producerar S100A12 protein med hög renhet och avkastning till hanterbara kostnader. För funktionella analyser på immunceller krävs en noggrann övervakning och ytterligare rengöringsåtgärder för att erhålla endotoxin-fritt protein. Merparten av endotoxinet kontamineringar kan uteslutas genom anjonbyteskromatografi. För att tömma rester av föroreningar, beskriver detta protokoll ett avlägsnande steg med centrifugalfilter. Beroende på den tillgängliga Jon-styrka S100A12 kan ordna i olika homomultimers. För att undersöka sambandet mellan struktur och funktion, beskriver detta protokoll ytterligare jonbehandling av S100A12 protein följt av kemisk tvärbindning för att stabilisera S100A12 oligomerer och deras efterföljande separation efter storleks uteslutning Kromatografi. Slutligen beskriver vi en cellbaserad analys som bekräftar den biologiska aktiviteten hos det renade proteinet och bekräftar LPS-fri beredning.

Efter för rening på AIEX-kolonnen (figur 1a-C) och påföljande kalciumberoende HIC (figur 2a, B) erhölls mycket rent protein (figur 2C). Dessutom visade mätningar av endotoxin lyckad LPS-borttagning. LPS-halten efter AIEX mättes i en 1:10-utspädning över detektionsgränsen för analysen, det vill säga över 500 EU/mL. Efter den första filtreringen genom en 50 kDa-filterenhet reducerades LP...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation at JoVE.com

Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

Detta protokoll beskriver en reningsmetod för rekombinant taggfritt kalcium bindnings protein S100A12 och dess Jon-inducerad oligomerer för humana monocytstimuleringstester.

Rening av Human S100A12 och dess Jon-inducerad oligomerer för immun cells stimulering

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

Detta protokoll beskriver en komplett rening förfarande för mänskliga kalcium bindande protein, S100A12, och i synnerhet, för det är olika jon-inducerad oligomerer för nedströms forskning konsekvenser. Med denna teknik kan vi behålla hög avkastning av mycket rent och endotoxinfritt protein. Kemisk tvärbindning och separation på storlek uteslutning kromatografi kolumn är en övertygande metod för att generera homo-oligomeric proteiner för ytterligare funktionella analyser.Vår teknik gör det möjligt för oss att mekanistiska aspekter av S100A12 som mönsterigenkänning receptor ligand och konst information för att helst utveckla nya riktade insatser och förbättra diagnostiska analyser. Förutom att titta på den här videon rekommenderar vi en noggrann läsning av protokollet, som vi beskriver en komplex, flera steg förfarande. Till att börja, skär en dialysrör i en lämplig längd, cirka 30 centimeter, med ytterligare utrymme för luft.Blötlägg membranet i avjoniserat vatten i 15 till 30 minuter för att avlägsna glycerol. För att minska viskositeten i den rensade proteinlösningen, späd lösningen med 25 milliliter AIEX buffert A.Fäst den första förslutningen på slangen. Fyll provet i membranet och fäst den andra tillsluten minst en centimeter från den övre änden av slangen.I ett kylt rum vid fyra grader Celsius, placera behållaren med AIEX buffert A på en omrörning tallrik, tillsätt en rör bar, och membranet fylld med proteinlösning. Justera hastigheten för att rotera provet så att det inte blir någon störning med det roterande omrörningsfältet. Dialyze i 12 till 24 timmar vid fyra grader Celsius sedan ersätta dialyzed buffert med gratis färdigkyld buffert A och fortsätta i minst fyra ytterligare timmar.Överför den dialyserade proteinlösningen från slangen till ett 50 milliliterrör genom en 0,45 mikronfilterenhet. Starta FPLC:n med allmänt underhåll. Anslut kolumnbuffertar AIEX A och AIEX B till buffertventiler och anjonbytarharts som innehåller kolumn till kolumnportarna i FPLC.Justera de allmänna kromatografiska parametrarna därefter. Starta AIEX-programmet i FPLC-programvaran och välj jämviktsvolymen för buffert A.Därefter, ladda provet på kolonnen och elera proteinerna med en linjär gradient från 0%till 100% hög saltbuffert. Samla ihop två milliliterfraktioner under elueringen.Analysera de eluterade fraktionerna efter avslutad körning. För detta, ladda 10 mikroliter av varje fraktion på en Coomassie färgas 15% SDS sida och identifiera fraktioner som innehåller S100A12. Poola dessa S100A12 innehållande fraktioner för dialys till TRIS-buffrad koksaltlösning.För att fortsätta proteinreningen, efter proteindialysen, tillsätt en kalciumklorid till provet till en slutkoncentration på 25 millimol, vilket kommer att underlätta bindningen av S100A12 till hartset i nästa steg. Filtrera sedan provet genom ett filter med en hällstorlek på 0,45 mikrometer. JämviktS-HIC-buffertar och prover till fyra grader Celsius.Därefter ansluter kolumnbuffertar HIC A och B och kolumnen till systemet och justerar parametrarna. Starta metoden för att ekviliera kolonnen med en till två kolonnvolymer av buffert HIC A och ladda provet och tvätten obundet provblock med en UV-signal når baslinjenivån igen. Börja sedan eluering med en kalciumkelator som innehåller buffert EDTA.Samla ihop två milliliter toppfraktioner under eluering. Efter att ha analyserat 10 mikroliter av varje fraktion på en Coomassie färgas 15% SDS sida identifiera ren S100A12 fraktioner. Poola dessa fraktioner och dialys mot HBS.Först, lasta 15 milliliter prov på en 50 kilodalton centrifugalfilterenhet. Centrifugera vid 3200 gånger g vid 10 grader Celsius i cirka 10 minuter. Överför det smutsiga genomflödet till ett färskt kärl, på is.Använd nu en milliliter HBS för att skölja filtermembranet och för utspädning av den koncentrerade lösningen i filterspetsen. Centrifugera igen för att återvinna så mycket protein som möjligt i genomflödet. För att filtrera lösningen, upprepa provlastningen och centrifugeringen så ofta det behövs.Nästa, för att koncentrera S100A12 som innehåller genomströmning, ladda den i en tre kilodalton centrifugalfilter och centrifug på 3200 gånger g, 10 grader Celsius i cirka 30 minuter. Nu reduceras volymen till 1/5 upp till 1/10 av den initiala lastningsvolymen. Överför den koncentrerade lösningen till ett nytt rör.Upprepa koncentrationssteget så ofta det behövs. Efter kemisk tvärbindning, enligt manuskriptet, utföra storlek uteslutning kromatografi. Jämviktskolonnen i HBS, ladda provet och samla toppfraktioner på en till två milliliter under körningen.Efter att ha analyserat dessa fraktioner på en fyra till 20%toning SDS sida, pool fraktioner med stora band av det önskade proteinet komplex. Koncentrera sedan lösningarna som gjort tidigare. För att isolera monocyter från humana buffy rockar genom densitet gradient centrifugation, först jämvikt separationslösningen till rumstemperatur.Överför 20 milliliter i 15 milliliter centrifugrör, två rör per buffy coat. Späd ut blodet från den humana buffy coat med HBSS till en total volym av 60 milliliter och skikt 30 milliliter av denna blandning försiktigt ovanpå separationsmediet. Centrifug vid 550 gånger g i 35 minuter vid rumstemperatur.Stäng av bromsen på centrifugen. Efter centrifugeringen ligger de mononukleära perifera blodkropparna direkt ovanpå separationsmediet. Med en pipett, överför dessa celler till en färsk, 50 milliliter centrifugrör.Fyll röret med HBSS till 50 milliliter och centrifug vid 170 gånger g i 10 minuter. Aspirera supernatanten och resuspend cell pelleten i en liten volym av HBSS genom pipettering. Fyll sedan röret upp till 50 milliliter och centrifug vid 290 gånger g i 10 minuter.Aspirera supernatanten igen. Resuspend cellerna i 50 milliliter av HBSS och centrifug vid 170 gånger g i 10 minuter. Aspirera supernatanten och resuspend cellpelletsen i en liten volym av en milliliter av avskiljandebuffert, räkna cellerna och tillfoga buffert till en koncentration av fem tider 10 till de sju cellerna per milliliter.För monocytisolering från mononukleära perifera blodkroppar, använd en magnetisk negativ cellisoleringssats och följ tillverkarens protokoll. Använd en automatiserad cellräknare för att räkna monocyterna och resuspend i monocyte medium till en koncentration av två gånger 10 till de sex cellerna per milliliter. Till kultur monocyter, lägg ut en cellkultur skålen med en hydrofoba gas genomsläpplig film som lämpar sig för suspension celler.Placera plattorna i UV-belysning i cirka 30 minuter för sterilisering. Överför 15 till 25 milliliter av cellupphängningen till dessa odlingsplattor och låt dem vila över natten vid 37 grader Celsius och 5%-koldioxid. Efter pre-rening på AIEX kolumnen och efterföljande kalcium beroende HIC erhölls mycket rent protein.Som en ytterligare kontroll, humana monocyter stimulerades med LPS och producerade vild-typ protein. Proteinexponering för olika joner resulterar i arrangemang av olika S100A12-oligomerer. Ökande zink koncentrationer inducera arrangemang av S100A12 i tetramers och hexamers vid separation på fyra till 20%Coomassie färgade SDS sida.När ett överskott av joner tillämpades före tvärbindning, inducerade det en uttalad förskjutning av oligomer jämvikt. S100A12 var tvärbunden i närvaro av antingen 25 millimolar kalcium eller 25 millimolar kalcium och en millimolar zink. Efter tvärbindning i HBS-buffert med 25 millimolar kalciumklorid och en millimolär zinkklorid, var hexamer och tetramer åtskilda.Tetramer och dimer separerades i HBS-buffert med 25 millimolar kalciumklorid. Ett exempel på poolade och koncentrerade oligomerer efter separation på en Coomassie färgas fyra till 15%gradient SDS sida visar dimer, tetramer, och hexamer. Monocyte stimulering med hexameric S100A12 resulterade i uttalad TNF alfa release.Efter avlägsnande av endotoxin är det viktigt att inte återinföra kontaminering i proverna under efterföljande generering och rening av oligomererna. Nedströms analys av någon process som relaterar till S100A12 oligomerization är tänkbart. På samma sätt kan aminosyror och jonförhållanden som påverkar själva oligomeriseringsprocessen analyseras.Vi använder för närvarande S100A12 oligomerer separerade enligt det beskrivna protokollet för att utveckla specifika peptid ligander och antikroppar för att blockera proteinets signalering genom TLF4 och för att utveckla och förbättra diagnostiska analyser.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Rening av specifik cell Befolkningen efter Fluorescens Aktivt cellsortering (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Kvantitativ bedömning av immunceller i den skadade ryggmärg med flödescytometri: en ny användning för en cell reningsmetod

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Flödescytometrisk analys av immunceller Inom Murine artärer

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolering av Funktionell Cardiac immunceller

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Mänskliga In Vitro Suppression som screeningmetod för erkännande av en tidig staten Immune obalans

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging av Mouse Thymus med 2-Photon Mikroskopi

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Upptäckt av fluorescerande nanopartiklar Interaktion med Primär Immun cellsubpopulationer med flödescytometri

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

En halvautomatisk metoden att förbereda antikropp Cocktails för Immunophenotypic Analys av humant perifert blod

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolering och flödescytometrisk analys av immunceller från ischemisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...