Name: electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon
Uploaded: 2019-09-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon at JoVE.com

Særlig tak til James Copti for redigering af manuskriptet. Vi anerkender også taknemmeligt finansiering til JN fra den tyske Research Foundation (DFG) af SFB 870 og SPP "Integrative analyse af Olfaction" og SPP 1738 "nye roller af ikke-kodning RNAs i nervesystemet udvikling, plasticitet & sygdom", SPP1757 " Glial heterogenitet "og ekspertise strategi inden for rammerne af München-klyngen for system Neurology (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).

Alle dyr, der anvendes i denne protokol, er holdt under normale opdrætsforhold, og forsøgene er udført i henhold til retningslinjerne og reglerne for EU og regeringen i øvre Bayern (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. fremstilling af plasmid blanding til elektroporation
<ol><li>Fortynde plasmid af interesse i sterilt vand og tilsæt hurtig grøn plet stamopløsning [1 mg/mL]. Sørg for, at den endelige koncentration af plasmid er ∼ 1 μg/μL. Tilsæt pletten i en koncentration på højst 3%, d...

<ol>
	<li>Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain.">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).</li><li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon:+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis.">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60 (3), 343-357 (2012).</li><li>Barbosa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain.">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 346 (6236), 789-793 (2015).</li><li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury.">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).</li><li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li><li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li><li>Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon.">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> Journal of Neurotrauma. , (2010).</li><li>Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+brain+injury+in+adult+zebrafish+stimulates+neurogenesis+and+long-distance+neuronal+integration.">Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration.</a> Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).</li><li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult.">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Development. 8 (3), (2013).</li><li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates.">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li><li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).</li><li>Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glia+and+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+central+nervous+system.">Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system.</a> Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).</li><li>Lyons, D. A., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+development+and+function+in+zebrafish.">Glial cell development and function in zebrafish.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).</li><li>Obermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Surface+Proteome+of+Adult+Neural+Stem+Cells+in+Zebrafish+Unveils+Long-Range+Cell-Cell+Connections+and+Age-Related+Changes+in+Responsiveness+to+IGF.">The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Kusumanto, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+in+vivo+transfer+of+plasmid+DNA+in+muscle:+comparison+of+electroporation+versus+ultrasound.">Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound.</a> Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).</li><li>Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gene+transfer+into+the+adult+zebrafish+brain+by+herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+electroporation:+methods+and+optogenetic+applications.">Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).</li><li>Van Tendeloo, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells:+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells.">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98 (1), 49-56 (2001).</li><li>Mars, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotransfection+and+lipofection+show+comparable+efficiency+for+in+vitro+gene+delivery+of+primary+human+myoblasts.">Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts.</a> The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).</li><li>Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+in+vivo+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+the+zebrafish+telencephalon.">Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon.</a> Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).</li><li>Di Giaimo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aryl+Hydrocarbon+Receptor+Pathway+Defines+the+Time+Frame+for+Restorative+Neurogenesis.">The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis.</a> Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).</li><li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+generation+of+customizable+gRNA+vectors+for+multiplex+CRISPR+approaches+through+string+assembly+gRNA+cloning+(STAgR).">One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR).</a> PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).</li><li>Barbosa, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , (2014).</li><li>Kelsh, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+pigmentation+mutations+and+the+processes+of+neural+crest+development.">Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development.</a> Development. 123, 369-389 (1996).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry.">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).</li><li>Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+formation+with+plasmid+DNA+increases+the+cytotoxicity+of+cationic+liposomes.">Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).</li><li>Chapouton, P., Godinho, L., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. 100, (2010).</li><li>Zhu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System.">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).</li></ol>

Denne elektroporations protokol er en pålidelig in vivo-metode til mærkning af individuelle ependymogliale celler. Protokollen kan have brug for en yderligere tilpasning for at mærke andre celletyper såsom neuroner eller oligodendrocytter. For at opnå en vellykket mærkning kan der anvendes plasmider med forskellige initiativtagere. Chicken-beta actin Promoter, eF1alpha, CMV og ubiquitin Promoter er tidligere blevet brugt til at drive ekspression af forskellige transgener i ependymoglia og deres afkom<sup class="xre...

Zebrafish er fremragende dyremodeller til at undersøge hjernens regenerering efter en stab sår skade. Sammenlignet med pattedyr, på den evolutionære stigen, mindre udviklede arter som Zebra generelt viser højere satser for konstitutiv neurogenese og bredere områder af voksne neurale stamceller bopæl, hvilket fører til konstant generering af nye neuroner i hele de fleste hjerneområder i voksenlivet. Denne funktion synes at korrelere med betydeligt højere regenerativ kapacitet af Zebra i forhold til pattedyr1, som zebra har bemærkelsesværdigt potentiale til effektivt at generere nye neuroner i de fleste hjerneskade modeller studerede2, 3,4,5,6,7,8. Her er Zebra telencephalon undersøgt, da det er et hjerne område med fremtrædende neurogenese i voksenalderen. Disse zoner af voksne neurogenese er homologe til neurogene zoner i den voksne pattedyr hjernen9,10,11.
Rigelige neurogene områder i Zebra telencephalon er til stede på grund af eksistensen af radial glia som celler eller ependymoglia celler. Ependymoglial celler fungerer som residente voksne neurale stamceller og er ansvarlige for generering af nye neuroner i både intakt og regenererende hjerne3,5. Lineage Tracing eksperimenter har vist, at ventrikulære ependymoglia reagerer på skade, derefter formere sig og generere nye Neuro Blaster, der migrerer til læsionsstedet5. På grund af den krænget natur af Zebra telencephalon, line ependymoglial celler den ventrikel overflade og bygge den ventrale ventrikel væg. Den dorsale ventrikel væg dannes af et dorsale ependymalt cellelag (figur 1a). Vigtigere, zebra ependymoglia legemliggøre egenskaberne af både pattedyrs radiale glia og ependymale celler. Lange radiale processer er et typisk træk ved radial glia-celler, hvorimod cellulære forlængelser og stramme kryds (samt deres ventrikulære positioner) er typiske egenskaber ved ependymale celler12,13,14. Derfor kaldes disse celler for ependymoglial celler.
For at følge in vivo opførsel af enkelt ependymoglial celler under regenerering, skal de være pålideligt mærket. Forskellige metoder til in vivo celle mærkning for fluorescerende mikroskopi er tidligere beskrevet, såsom endogene journalister eller lipofile farvestoffer15. Disse metoder, i modsætning til elektro poration, kan kræve længere perioder og ofte ikke giver mulighed for enkelt celle mærkning eller permanent langsigtet sporing. Elektro poration, men (udover enkelt celle mærkning), giver mulighed for at indføre nye DNA i værtscellen. Desuden, sammenlignet med andre metoder til DNA-overførsel i cellerne, elektro poration har vist sig at være en af de mest effektive metoder16,17,18,19.
Præsenteret her er en elektroporation protokol, der er blevet raffineret med henblik på mærkning enkelt ependymoglial celler i den voksne Zebra telencephalon. Denne protokol giver mulighed for mærkning af enkelt ependymogliale celler for at følge dem over en langsigtet periode20 eller for at manipulere bestemte veje i en celle-autonom måde21,22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>For coloring plasmid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>SignaGel, Parker laboratories INC.</td>
			<td>15-60</td>
			<td>Electrode Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>TetraTec APS 50, 10l-60l</td>
			<td></td>
			<td>Can be bought in the pet shops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX Tweezertrodes Electrodes</td>
			<td>Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0486</td>
			<td>1mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation device</td>
			<td>BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection device</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Wall Borosillicate Glass Capillary</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0766</td>
			<td>Model No: G100-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10056-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Joystick micromanipulator</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>MN - 151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Needle holder comes together with the injection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle pulling device</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>Model No: PC-10</td>
			<td>The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One International</td>
			<td>633161</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon

Elektro poration er en transfektering metode, hvor et elektrisk felt påføres celler til at skabe midlertidige porer i en celle membran og øge dens permeabilitet, hvorved forskellige molekyler, der skal indføres til cellen. I dette papir bruges elektroporation til at introducere plasmider til ependymogliale celler, som linje den ventrikulære zone af den voksne Zebra telencephalon. En brøkdel af disse celler viser stamcelle egenskaber og genererer nye neuroner i Zebra hjernen; Derfor, studere deres adfærd er afgørende for at bestemme deres roller i neurogenese og regenerering. Indførelsen af plasmider via elektroporation muliggør langsigtet mærkning og sporing af en enkelt ependymoglial celle. Desuden kan plasmider som CRE rekombinase eller Cas9 leveres til enkelt ependymogliale celler, som muliggør genkombinering eller genredigering og giver en enestående mulighed for at vurdere cellens autonome genfunktion i et kontrolleret, naturligt Miljø. Endelig er denne detaljerede, trin-for-trin elektro poration protokol anvendes til at opnå en vellykket introduktion af plasmider i et stort antal enkelt ependymoglial celler.

Den beskrevne elektroporationsmetode giver mulighed for levering af plasmid-DNA til ependymoglialceller, som er placeret overfladisk i Zebra telencephalon og lige under det rygmarske cellelag (figur 1a).
Hvis resultatet af elektro portering er positivt, kan etiketten enkelt ependymoglial celler (røde celler i figur 2a, b) observeres blandt andre ependymogliale celler (hvid i <stron...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon at JoVE.com

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Præsenteret her er en elektroporation metode til plasmid DNA levering og ependymoglial celle mærkning i den voksne Zebra telencephalon. Denne protokol er en hurtig og effektiv metode til at visualisere og spore individuelle ependymogliale celler og åbner nye muligheder for at anvende elektro poration til en bred vifte af genetiske manipulationer.

Elektro porationsmetode til in vivo-levering af plasmid-DNA i den voksne Zebrafish telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

Denne protokol gør det muligt mærkning af individuelle ependymogliale celler i zebrafisk telencephalon at gøre det muligt for deres langsigtede overvågning, samt manipulation af specifikke veje i en celle-autonom måde. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver mulighed for enkelt celle mærkning i hurtig og effektiv måde, samt genredigering og signalering vej manipulation i celle-autonome måde. Denne metode gør det muligt at undersøge grundlæggende cellebiologi spørgsmål, for eksempel om celleaflamination, vedligeholdelse af epitel homøostase, og symmetrien i celledeling.Begynd med at bruge et nåle-trækker apparat til at forberede glas kapillærer. Brug microloader tips til at fylde en forberedt glas kapillær med ti mikroliter af plasmid opløsning. Tryk derefter på menuskift kapillær"på injektionsanordningen for at lade nålen blive læsset ind i nåleholderen.Skift derefter injektionsenheden fra skift kapillær til injiceringstilstand. Derefter, ved hjælp af et stereomikroskop med en fire gange forstørrelse, og Finden saftævle, skæres kun spidsen af kapillær. Tryk derefter på fodpedalen for at bekræfte, at plasmidopløsningerne nemt løber ud af nålen uden hindringer.Når nålen er klar, overføres en zebrafisk fra brugtetanken til en beholder med bedøvelsesmiddelopløsning. Og vent et par minutter, indtil bevægelsen af gællerne aftager. Tryk den sederede fisk dorsale side op på en pre-wetted svamp under stereomikroskop, og bruge en rustfri stål dissekere mikroknife med en 40 millimeter skærkant og en 0,5 millimeter tykkelse til omhyggeligt at skabe et lille hul i fisk kraniet på den bageste side af telencephalon, lige ved siden af grænsen til den optiske tectum.Vip fisken efter behov, og ret spidsen af glaskapillaryen mod kraniet i den korrekte vinkel for at lette indtrængningen af kapillærspidsen gennem hullet. Derefter, meget omhyggeligt indsætte spidsen af kapillær i hullet gennem dorsale ependymal celle lag, indtil den når telencephalic ventricle, og tryk på fodpedalen i ca 10 sekunder til at levere ca 1 mikroliter af plasmid opløsning. Leveringens succes kan bekræftes ved at observere spredningen af den grønne væske i hele hjertekammer.Dæk fisken telencephalon med en lille mængde ultralyd gel. For elektroporation af plasmid injiceret dyr, fjerne svampen fra injektion set-up og nedsænke indersiden af elektrospidser i ultralyd gel. Placer fiskehovedet mellem elektroderne med den positive elektrode på hovedets ventrale side og den negative elektrode på dorsalsiden.Mens du stadig holder fiskens krop i svampen, skal du trykke elektroderne forsigtigt og præcist mod telencephalon og administrere strømmen med fodpedalen, holde elektroderne på plads, indtil alle fem impulser er færdige. Hvis elektroporationen lykkes, plasmid mærket enkelt ependymoglial celler kan observeres blandt de ikke-plasmid mærket ependymoglial celler. Afhængigt af effektiviteten af elektroporationsprocessen, et højere eller lavere antal ependymogliale celler kan mærkes.Ikke desto mindre giver den demonstrerede protokol et større antal mærkede celler end tidligere offentliggjorte protokoller. Bemærk, at den højeste tæthed af mærkede celler har tendens til at dukke op for det meste på den indre ventrikulære side af begge halvkugler på grund af den måde, hvorpå den injicerede plasmid væske fordeler mellem halvkuglerne. I denne video, en halvkugle af zebrafisk telencephalon præsenteres i 3D, hvor ependymoglial celler med radio-processer, er i magenta når observeret fra siden.Gennem co-elektroporation med en anden plasmid, der etiketter kerner, celledeling af ependymoglial celler kan observeres. Mislykket elektroporation resulterer i meget lavt antal eller ingen mærkede ependymoglial celler. Dorsal ependymal celler, dog, er de mest tilbøjelige til at blive mærket.Deres soma er større i kasseformet, og de har ikke radio-aflange processer som tydeligt fra en side opfattelse af ependymoglial celle lag. tdTomato-mem mærkede celler er sandsynligvis ependymal celler, som er placeret over laget af ependymoglia. I modsætning hertil resulterer indførelsen af en tdTomato-mem, der udtrykker plasmid til individuelle ependmyoglial celler i tdTomato-mem udtryk ud over den oprindelige celle mærkning.De vigtigste ting at huske er at skære kun spidsen af kapillær og at trænge ind i ependymal lag, mens injektion, således at væsken breder sig i hele hjertekammer. Denne teknik muliggør langsigtet overvågning af enkelte ependymogliale celler gennem in vivo imaging, og derfor etablere deres rolle i hjernen regenerering samt deres store in vivo genetiske link.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Nyre Regeneration i Adult Zebrafisk af Gentamicin induceret skade

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer til kylling Auditory Organ med<em&gt; I Ovo</em&gt; Micro-elektroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging af transgene genekspression i Individuel Retinal progenitorer i kimære zebrafisk embryoner til Studieinformationen Cell Nonautonomous påvirkninger

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

I Ovo Electroporation i Kylling Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Anvendelse af RNAi og Heat-shock-induceret transskription faktor udtryk til at omprogrammere kønsceller til neuroner i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Nanopartikler-medieret siRNA genhæmning i voksen zebrafisk hjerte

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Voksen zebrafisk skade modeller at studere virkningerne af Prednisolon i regenererende knoglevæv

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...