Name: electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon
Uploaded: 2019-09-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon at JoVE.com

Speciale dank aan James Copti voor het bewerken van het manuscript. We erkennen ook dankbaar financiering aan JN van de Duitse Research Foundation (DFG) door de SFB 870 en SPP "integratieve analyse van olfaction" en SPP 1738 "opkomende rollen van niet-coderende Rna's in de ontwikkeling van het zenuwstelsel, plasticiteit & ziekte", SPP1757 " Glial heterogeniteit "en Excellence strategie in het kader van de Munich cluster for Systems Neurology (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).

Alle dieren die in dit protocol worden gebruikt, zijn onder standaardomstandigheden gehouden en experimenten zijn uitgevoerd volgens de richtlijnen en voorschriften van de EU en de regering van Opper-Beieren (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. bereiding van het plasmide mengsel voor Elektroporation
<ol><li>Verdun de interesse van de plas smid in steriel water en voeg een snelle groene vlek voorraadoplossing [1 mg/mL] toe. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van het plasmide ∼ 1 μg/μL ...

<ol>
	<li>Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain.">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).</li><li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon:+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis.">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60 (3), 343-357 (2012).</li><li>Barbosa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain.">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 346 (6236), 789-793 (2015).</li><li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury.">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).</li><li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li><li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li><li>Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon.">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> Journal of Neurotrauma. , (2010).</li><li>Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+brain+injury+in+adult+zebrafish+stimulates+neurogenesis+and+long-distance+neuronal+integration.">Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration.</a> Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).</li><li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult.">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Development. 8 (3), (2013).</li><li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates.">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li><li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).</li><li>Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glia+and+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+central+nervous+system.">Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system.</a> Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).</li><li>Lyons, D. A., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+development+and+function+in+zebrafish.">Glial cell development and function in zebrafish.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).</li><li>Obermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Surface+Proteome+of+Adult+Neural+Stem+Cells+in+Zebrafish+Unveils+Long-Range+Cell-Cell+Connections+and+Age-Related+Changes+in+Responsiveness+to+IGF.">The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Kusumanto, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+in+vivo+transfer+of+plasmid+DNA+in+muscle:+comparison+of+electroporation+versus+ultrasound.">Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound.</a> Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).</li><li>Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gene+transfer+into+the+adult+zebrafish+brain+by+herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+electroporation:+methods+and+optogenetic+applications.">Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).</li><li>Van Tendeloo, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells:+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells.">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98 (1), 49-56 (2001).</li><li>Mars, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotransfection+and+lipofection+show+comparable+efficiency+for+in+vitro+gene+delivery+of+primary+human+myoblasts.">Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts.</a> The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).</li><li>Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+in+vivo+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+the+zebrafish+telencephalon.">Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon.</a> Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).</li><li>Di Giaimo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aryl+Hydrocarbon+Receptor+Pathway+Defines+the+Time+Frame+for+Restorative+Neurogenesis.">The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis.</a> Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).</li><li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+generation+of+customizable+gRNA+vectors+for+multiplex+CRISPR+approaches+through+string+assembly+gRNA+cloning+(STAgR).">One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR).</a> PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).</li><li>Barbosa, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , (2014).</li><li>Kelsh, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+pigmentation+mutations+and+the+processes+of+neural+crest+development.">Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development.</a> Development. 123, 369-389 (1996).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry.">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).</li><li>Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+formation+with+plasmid+DNA+increases+the+cytotoxicity+of+cationic+liposomes.">Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).</li><li>Chapouton, P., Godinho, L., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. 100, (2010).</li><li>Zhu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System.">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).</li></ol>

Dit electroporatie protocol is een betrouwbare in vivo methode voor het labelen van individuele ependymoglial cellen. Het protocol moet mogelijk een verdere aanpassing voor het labelen van andere celtypen zoals neuronen of oligodendrocyten. Om tot een succesvolle etikettering te komen, kunnen plasmiden met verschillende promotors worden gebruikt. De promotor van Chicken-Beta actine, eF1alpha, CMV en ubiquitine zijn eerder gebruikt om de expressie van verschillende transgenen in ependymoglia en hun nakomelingen<sup class=...

Zebravis zijn uitstekende diermodellen om hersen regeneratie na een steekwond letsel te onderzoeken. In vergelijking met zoogdieren, op de evolutionaire ladder, minder geëvolueerde soorten zoals zebravis in het algemeen vertonen hogere tarieven van constitutieve neurogenese en bredere gebieden van volwassen neurale stamcellen residentie, wat leidt tot constante generatie van nieuwe neuronen in de hele de meeste hersengebieden in het volwassen leven. Deze functie lijkt te correleren met significant hogere regeneratieve capaciteit van zebravis in vergelijking met zoogdieren1, als zebravis hebben opmerkelijk potentieel om efficiënt te genereren nieuwe neuronen in de meeste hersenen letsel modellen bestudeerd2, 3,4,5,6,7,8. Hier wordt de zebravis telencephalon bestudeerd, omdat het een hersengebied is met prominente neurogenese in volwassenheid. Deze zones van volwassen neurogenese zijn homologe aan neurogene zones in de volwassen zoogdieren hersenen9,10,11.
Overvloedige neurogene gebieden in de zebravis telencephalon zijn aanwezig vanwege het bestaan van radiale glia zoals cellen of ependymoglia-cellen. Ependymoglial cellen fungeren als Resident volwassen neurale stamcellen en zijn verantwoordelijk voor het genereren van nieuwe neuronen in zowel de intact en regenereert hersenen3,5. Lineage tracing experimenten hebben aangetoond dat ventriculaire ependymoglia reageren op letsel, dan prolifereren en genereren van nieuwe neuroblasten die migreren naar de laesie site5. Door de gemuteerde aard van zebravis telencephalon lijnen de ependymogliale cellen het ventriculaire oppervlak en bouwen de ventrale ventriculaire wand. De dorsale ventriculaire wand wordt gevormd door een dorsale Ependymale cellaag (Figuur 1a). Belangrijker is dat zebravis ependymoglia de kenmerken van zowel de zoogdier radiaal glia als de Ependymale cellen belichaam. Lange radiale processen zijn een typisch kenmerk van radiale glia-cellen, terwijl cellulaire extensies en nauwe kruisingen (evenals hun ventriculaire posities) typische kenmerken zijn van Ependymale cellen12,13,14. Daarom worden deze cellen ependymoglial cellen genoemd.
Om in vivo gedrag van enkelvoudige ependymoglial cellen tijdens regeneratie te volgen, moeten ze op betrouwbare wijze worden gelabeld. Verschillende methoden van in vivo cellabeling voor fluorescerende microscopie zijn eerder beschreven, zoals endogene verslaggevers of lipofiele kleurstoffen15. Deze methoden, in tegenstelling tot elektroporation, kan vereisen langere tijd en vaak bieden niet de mogelijkheid van één cel labeling of permanente lange termijn tracering. Elektroporation, echter (naast het labelen van één cel), biedt de mogelijkheid om nieuw DNA in de host-cel te introduceren. Bovendien, in vergelijking met andere methoden van DNA-overdracht in de cellen, is elektroporation aangetoond dat het een van de meest efficiënte methoden16,17,18,19is.
Hier gepresenteerd is een electroporatie protocol dat is verfijnd met het oog op het labelen van enkele ependymoglial cellen in de volwassen zebravis telencephalon. Dit protocol voorziet in de etikettering van enkelvoudige ependymoglial cellen om ze gedurende een lange periode van20 te kunnen volgen of om specifieke trajecten op autonome wijze te manipuleren21,22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>For coloring plasmid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>SignaGel, Parker laboratories INC.</td>
			<td>15-60</td>
			<td>Electrode Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>TetraTec APS 50, 10l-60l</td>
			<td></td>
			<td>Can be bought in the pet shops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX Tweezertrodes Electrodes</td>
			<td>Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0486</td>
			<td>1mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation device</td>
			<td>BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection device</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Wall Borosillicate Glass Capillary</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0766</td>
			<td>Model No: G100-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10056-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Joystick micromanipulator</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>MN - 151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Needle holder comes together with the injection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle pulling device</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>Model No: PC-10</td>
			<td>The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One International</td>
			<td>633161</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon

Elektroporation is een transfectie methode waarbij een elektrisch veld wordt toegepast op cellen om tijdelijke poriën in een celmembraan te creëren en de permeabiliteit ervan te vergroten, waardoor verschillende moleculen in de cel kunnen worden geïntroduceerd. In dit document wordt elektroporation gebruikt voor het introduceren van plasmiden aan ependymoglial cellen, die de ventriculaire zone van de volwassen zebravis telencephalon lijn. Een fractie van deze cellen toont stamcel eigenschappen en genereert nieuwe neuronen in de hersenen van de zebravis; Daarom is het bestuderen van hun gedrag essentieel om hun rol in neurogenese en regeneratie te bepalen. De introductie van plasmiden via electroporatie maakt lange termijn labeling en tracking van een enkele ependymoglial cel mogelijk. Bovendien kunnen plasmiden zoals CRE of of Cas9 worden geleverd aan enkelvoudige ependymoglial cellen, die genrecombinatie of genbewerking mogelijk maken en een unieke kans bieden om de autonome genfunctie van de cel te beoordelen in een gecontroleerde, natuurlijke Milieu. Ten slotte wordt dit gedetailleerde, stapsgewijze electroporatie protocol gebruikt om een succesvolle introductie van plasmiden tot een groot aantal enkelvoudige ependymoglial cellen te verkrijgen.

De beschreven elektroporation methode maakt de levering van plasmide DNA in ependymoglial cellen, die zich oppervlakkig bevinden in de zebravis telencephalon en net onder de dorsale Ependymale cellaag (Figuur 1a).
Als het resultaat van de elektroporation positief is, kan het label enkelvoudige ependymoglial cellen (rode cellen in Figuur 2a, b) worden waargenomen onder andere ependym...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon at JoVE.com

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Hier is een elektroporation methode voor plasmide DNA levering en ependymoglial cellabeling in de volwassen zebravis telencephalon. Dit protocol is een snelle en efficiënte methode om individuele ependymoglial cellen te visualiseren en te traceren en opent nieuwe mogelijkheden om elektroporation toe te passen op een breed scala aan genetische manipulaties.

Elektroporation methode voor in vivo levering van plasmide DNA in de volwassen zebravis Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

Dit protocol maakt het mogelijk om individuele ependymoglialcellen in de zebravistelencephalon te labelen om hun langdurige monitoring mogelijk te maken, evenals de manipulatie van specifieke paden op een cel-autonome manier. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het één cellabeling op een snelle en efficiënte manier mogelijk maakt, evenals genbewerkings- en signaleringstrajectmanipulatie op cel-autonome wijze. Deze methode maakt het mogelijk het onderzoeken van fundamentele celbiologie vragen, bijvoorbeeld over celdelaminatie, het behoud van epitheel homeostase, en de symmetrie van celdeling.Begin met het gebruik van een naald-pulling apparaat om glazen haarvaten te bereiden. Gebruik microloadertips om een voorbereide glazen capillair te vullen met tien microliter plasmideoplossing. Druk vervolgens op het menu verander capillaire "op de injectie-apparaat om de naald te worden geladen in de naaldhouder.Schakel vervolgens het injectieapparaat van verandering capillair naar inject-modus. Vervolgens, met behulp van een stereomicroscoop met een vier keer vergroting, en Finden tangen, snijd alleen het puntje van de capillaire. Druk vervolgens op het voetpedaal om te bevestigen dat de plasmideoplossingen zonder belemmering gemakkelijk uit de naald lopen.Wanneer de naald klaar is, breng een zebravis van de veehouder tank naar een container met verdovingsoplossing. En wacht een paar minuten tot de beweging van de kieuwen afneemt. Druk de verdoofde vis rugzijde omhoog op een voorbestempelde spons onder de stereomicroscoop, en gebruik een roestvrij stalen ontleedmicromes met een 40 millimeter snijkant en een 0,5 millimeter dikte om voorzichtig een klein gat in de visschedel aan de achterzijde van de telencephalon, net naast de rand van het optische tectum.Kantel de vis indien nodig en oriënteer de punt van de glazen capillaire naar de schedel in de juiste hoek om de penetratie van de capillaire tip door het gat te vergemakkelijken. Steek vervolgens heel voorzichtig de punt van het capillair in het gat door de rug ependymale cellaag, totdat het de telencephalische ventrikel bereikt en druk uitoefent op het voetpedaal gedurende ongeveer 10 seconden om ongeveer 1 microliter van de plasmide oplossing te leveren. Het succes van de levering kan worden bevestigd door het observeren van de verspreiding van de groene vloeistof in de ventrikel.Bedek de vistelencephalon met een kleine hoeveelheid ultrasone gel. Voor elektroporatie van het plasmide geïnjecteerde dier, verwijder de spons uit de injectie set-up en dompel de binnenkant van de elektrotips in ultrasone gel. Plaats de viskop tussen de elektroden, met de positieve elektrode aan de ventrale kant van het hoofd en de negatieve elektrode aan de rugzijde.Druk vervolgens, terwijl u nog steeds het lichaam van de vis in de spons houdt, de elektroden voorzichtig en precies tegen de telencephalon en beheer de stroom met het voetpedaal, waarbij de elektroden op hun plaats blijven totdat alle vijf de pulsen klaar zijn. Als de elektroporatie succesvol is, kan plasmid gelabeld enkele ependymoglial cellen worden waargenomen onder de niet-plasmide gelabeld ependymoglial cellen. Afhankelijk van de efficiëntie van het elektroporatieproces kan een hoger of lager aantal ependymoglial cellen worden gelabeld.Niettemin levert het aangetoonde protocol een hoger aantal gelabelde cellen op dan eerder gepubliceerde protocollen. Merk op dat de hoogste dichtheid van gelabelde cellen de neiging om meestal te voorschijn komen aan de binnenste ventriculaire kant van beide hemisferen als gevolg van de manier waarop de geïnjecteerde plasmide vloeistof zich verdeelt tussen de hemisferen. In deze video wordt een halfrond van de zebravis telencephalon gepresenteerd in 3D, waar de ependymoglial cellen met radio-processen, zijn in magenta wanneer waargenomen vanaf de zijkant.Door co-elektroporatie met een ander plasmid dat kernen labelt, kan celdeling van ependymoglial cellen worden waargenomen. Mislukte elektroporatie resulteert in een zeer laag aantal of geen gelabelde ependymoglial cellen. Dorsale ependymale cellen, echter, zijn het meest waarschijnlijk worden gelabeld.Hun soma is groter in cuboid en zij bezitten geen radio-langwerpige processen zoals duidelijk van een zijaanzicht van de ependymoglial cellaag. tdTomato-mem gelabelde cellen zijn waarschijnlijk ependymale cellen, die zich boven de laag van ependymoglia bevinden. De introductie van een tdTomato-mem die plasmid uitdrukt op individuele ependmyoglial cellen resulteert daarentegen in tdTomato-mem-expressie naast de initiële celetikettering.De belangrijkste dingen om te onthouden zijn om alleen de punt van de capillaire snijden en om de ependymale laag te penetreren tijdens het injecteren, zodat de vloeistof verspreidt zich door de ventrikel. Deze techniek maakt het mogelijk om op lange termijn enkele ependymoglial cellen te monitoren door middel van in vivo beeldvorming, en dus hun rol in de regeneratie van de hersenen en hun enorme in vivo genetische link vast te stellen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Nier Regeneratie in Adult zebravis door Gentamicin geïnduceerd letsel

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer naar de kip gehoororgaan door<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-elektroporatie

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in de Kip Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Toepassing van RNAi en warmte-schok-geïnduceerde transcriptie Factor expressie te herprogrammeren kiemcellen aan neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Nanoparticle-gemedieerde siRNA Gene-zwijgen in volwassen Zebrafish hart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Volwassen Zebrafish letsel modellen te bestuderen van de effecten van prednisolon in het herstel van botweefsel

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...