Name: electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon
Uploaded: 2019-09-13T15:00:00
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Un merci spécial à James Copti pour l'édition du manuscrit. Nous remercions également JN de la Fondation allemande de recherche (DFG) par le SFB 870 et SPP "Integrative Analysis of Olfaction" et SPP 1738 "Emerging roles of non-coding RNAs in nervous system development, plasticity and disease", SPP1757 " L'hétérogénéité gliale » et la stratégie d'excellence dans le cadre du Cluster for Systems Neurology de Munich (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198).

Tous les animaux utilisés dans ce protocole ont été gardés dans des conditions d'élevage standard, et des expériences ont été réalisées conformément aux directives et règlements de manipulation de l'UE et du gouvernement de Haute-Bavière (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. Préparation du mélange de Plasmide pour l'électroporation
<ol><li>Diluer le plasmide de l'intérêt pour l'eau stérile et ajouter une solution de bouillon de taches vertes rapides [1 mg/mL]. Assurez-vous que la c...

<ol>
	<li>Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain.">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).</li><li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon:+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis.">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60 (3), 343-357 (2012).</li><li>Barbosa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain.">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 346 (6236), 789-793 (2015).</li><li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury.">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).</li><li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li><li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li><li>Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon.">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> Journal of Neurotrauma. , (2010).</li><li>Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+brain+injury+in+adult+zebrafish+stimulates+neurogenesis+and+long-distance+neuronal+integration.">Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration.</a> Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).</li><li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult.">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Development. 8 (3), (2013).</li><li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates.">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li><li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).</li><li>Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glia+and+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+central+nervous+system.">Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system.</a> Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).</li><li>Lyons, D. 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J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Kusumanto, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+in+vivo+transfer+of+plasmid+DNA+in+muscle:+comparison+of+electroporation+versus+ultrasound.">Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound.</a> Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).</li><li>Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gene+transfer+into+the+adult+zebrafish+brain+by+herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+electroporation:+methods+and+optogenetic+applications.">Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).</li><li>Van Tendeloo, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells:+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells.">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98 (1), 49-56 (2001).</li><li>Mars, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotransfection+and+lipofection+show+comparable+efficiency+for+in+vitro+gene+delivery+of+primary+human+myoblasts.">Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts.</a> The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).</li><li>Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+in+vivo+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+the+zebrafish+telencephalon.">Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon.</a> Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).</li><li>Di Giaimo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aryl+Hydrocarbon+Receptor+Pathway+Defines+the+Time+Frame+for+Restorative+Neurogenesis.">The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis.</a> Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).</li><li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+generation+of+customizable+gRNA+vectors+for+multiplex+CRISPR+approaches+through+string+assembly+gRNA+cloning+(STAgR).">One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR).</a> PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).</li><li>Barbosa, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , (2014).</li><li>Kelsh, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+pigmentation+mutations+and+the+processes+of+neural+crest+development.">Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development.</a> Development. 123, 369-389 (1996).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry.">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).</li><li>Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+formation+with+plasmid+DNA+increases+the+cytotoxicity+of+cationic+liposomes.">Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).</li><li>Chapouton, P., Godinho, L., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. 100, (2010).</li><li>Zhu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System.">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).</li></ol>

Ce protocole d'électroporation est une méthode in vivo fiable d'étiquetage des cellules ependymoglial individuelles. Le protocole peut avoir besoin d'une autre adaptation pour étiqueter d'autres types de cellules comme les neurones ou les oligodendrocytes. Pour réussir l'étiquetage, des plasmides contenant différents promoteurs peuvent être utilisés. Chicken-bêta actin promoteur, eF1alpha, CMV et ubiquitin promoteur ont déjà été utilisés pour conduire l'expression de différents transgènes dans ependymogl...

Les poissons zèbres sont d'excellents modèles animaux pour examiner la régénération du cerveau après une blessure au couteau. Par rapport aux mammifères, sur l'échelle évolutive, les espèces moins évoluées telles que le poisson zèbre montrent généralement des taux plus élevés de neurogenèse constitutive et de zones plus larges de résidence de cellules souches neurales adultes, conduisant à la génération constante de nouveaux neurones tout au long la plupart des zones du cerveau dans la vie adulte. Cette caractéristique semble être en corrélation avec la capacité régénératrice significativement plus élevée du poisson zèbre par rapport aux mammifères1, car le poisson zèbre a un potentiel remarquable pour générer efficacement de nouveaux neurones dans la plupart des modèles de lésions cérébrales étudiés2, 3,4,5,6,7,8. Ici, le ténèbre telencephalon est étudié, car il s'agit d'une zone du cerveau avec une neurogenèse proéminente à l'âge adulte. Ces zones de neurogenèse adulte sont homologues aux zones neurogènes dans le cerveau des mammifères adultes9,10,11.
Les zones neurogènes abondantes dans le téencéphale de poisson-zèbre sont présentes en raison de l'existence de gliales radiales comme les cellules ou les cellules d'éparymoglia. Les cellules ependymoglial agissent en tant que cellules souches neurales adultes résidentes et sont responsables de la génération de nouveaux neurones dans le cerveau intact et régénérant3,5. Les expériences de traçage de lignée ont montré que les éparggies ventriculaires réagissent aux blessures, puis prolifèrent et génèrent de nouveaux neuroblastes qui migrent vers le site de lésion5. En raison de la nature everted du téleencéphalon de poisson-zèbre, les cellules ependymoglial tapissent la surface ventriculaire et construisent la paroi ventriculaire ventrale. La paroi ventriculaire dorsal est formée par une couche cellulaire ependymale dorsal (Figure 1A). Fait important, le poisson zèbre ependymoglia incarne les caractéristiques des cellules radiales et des cellules éparymatiques des mammifères. Les longs processus radiaux sont une caractéristique typique des cellules de la gliale radiale, tandis que les extensions cellulaires et les jonctions serrées (ainsi que leurs positions ventriculaires) sont des caractéristiques typiques des cellules éparymales12,13,14. Par conséquent, ces cellules sont appelées cellules éparymoglial.
Pour suivre le comportement in vivo des cellules ependymoglial simples pendant la régénération, elles doivent être étiquetées de manière fiable. Diverses méthodes d'étiquetage cellulaire in vivo pour la microscopie fluorescente ont déjà été décrites, telles que les reporters endogènes ou les colorants lipophiles15. Ces méthodes, contrairement à l'électroporation, peuvent nécessiter de plus longues périodes de temps et souvent n'offrent pas la possibilité d'étiquetage à cellule unique ou de traçage permanent à long terme. L'électroporation, cependant (en plus de l'étiquetage à cellule unique), offre la possibilité d'introduire un nouvel ADN dans la cellule hôte. En outre, par rapport à d'autres méthodes de transfert d'ADN dans les cellules, l'électroporation a été démontrée comme l'une des méthodes les plus efficaces16,17,18,19.
Présenté ici est un protocole d'électroporation qui a été affiné dans le but d'étiqueter les cellules ependymoglial unique dans le ténencéphale de poisson zèbre adulte. Ce protocole permet l'étiquetage des cellules éparymoglial simples afin de les suivre sur une période à long terme20 ou de manipuler des voies spécifiques d'une manière cellulaire-autonome21,22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>For coloring plasmid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>SignaGel, Parker laboratories INC.</td>
			<td>15-60</td>
			<td>Electrode Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>TetraTec APS 50, 10l-60l</td>
			<td></td>
			<td>Can be bought in the pet shops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX Tweezertrodes Electrodes</td>
			<td>Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0486</td>
			<td>1mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation device</td>
			<td>BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection device</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Wall Borosillicate Glass Capillary</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0766</td>
			<td>Model No: G100-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10056-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Joystick micromanipulator</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>MN - 151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Needle holder comes together with the injection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle pulling device</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>Model No: PC-10</td>
			<td>The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One International</td>
			<td>633161</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon

L'électroporation est une méthode de transfection dans laquelle un champ électrique est appliqué aux cellules pour créer des pores temporaires dans une membrane cellulaire et augmenter sa perméabilité, permettant ainsi l'introduction de différentes molécules dans la cellule. Dans cet article, l'électroporation est utilisée pour introduire des plasmides aux cellules éparymogliales, qui tapissent la zone ventriculaire du ténaudif zèbre adulte. Une fraction de ces cellules montre des propriétés de cellules souches et génère de nouveaux neurones dans le cerveau du poisson zèbre; par conséquent, l'étude de leur comportement est essentielle pour déterminer leurs rôles dans la neurogenèse et la régénération. L'introduction de plasmides par électroporation permet l'étiquetage à long terme et le suivi d'une seule cellule éparymoglial. En outre, les plasmides tels que Cre recombinase ou Cas9 peuvent être livrés à des cellules éparymogliales uniques, ce qui permet la recombinaison ou l'édition de gènes et offre une occasion unique d'évaluer la fonction génétique autonome de la cellule dans un système contrôlé, naturel l'environnement. Enfin, ce protocole détaillé d'électroporation étape par étape est utilisé pour obtenir l'introduction réussie des plasmides dans un grand nombre de cellules éparymogliales simples.

La méthode d'électroporation décrite permet la livraison de l'ADN plasmide dans les cellules éparymogliales, qui sont situées superficiellement dans le téencéphale de poisson zèbre et juste sous la couche de cellules ependymales dorsales (Figure 1A).
Si le résultat de l'électroporation est positif, les cellules épendymoglial simples étiquetées (cellules rouges dans la figure 2A,...

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Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Présenté ici est une méthode d'électroporation pour la livraison d'ADN plasmide et l'étiquetage des cellules épendymogliales dans le téncephalon de poisson zèbre adulte. Ce protocole est une méthode rapide et efficace pour visualiser et tracer les cellules ependymoglial individuelles et ouvre de nouvelles possibilités d'appliquer l'électroporation à un large éventail de manipulations génétiques.

Méthode d'électroporation pour la livraison in vivo de l'ADN de Plasmid dans le Telencephalon adulte de poisson zèbre

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

Ce protocole permet l’étiquetage des cellules ependymoglial individuelles dans le télencéphale de poisson zèbre pour permettre leur surveillance à long terme, aussi bien que la manipulation des voies spécifiques d’une manière cellule-autonome. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’étiquetage d’une seule cellule de manière rapide et efficace, ainsi que l’édition de gènes et la manipulation des voies de signalisation de manière autonome. Cette méthode permet d’étude des questions fondamentales de biologie cellulaire, par exemple, sur la délamination cellulaire, le maintien de l’homéostasie épithéliale et la symétrie de la division cellulaire.Commencez par utiliser un appareil de traction d’aiguilles pour préparer des capillaires en verre. Utilisez des pointes de microchargeur pour remplir un capillaire en verre préparé de dix microlitres de solution plasmide. Ensuite, appuyez sur le menu changer capillaire"sur le dispositif d’injection pour permettre à l’aiguille d’être chargé dans le porte-aiguille.Ensuite, passez du dispositif d’injection du capillaire de changement au mode d’injection. Ensuite, à l’aide d’un stéréomicroscope avec un grossissement quatre fois, et finden forceps, couper seulement la pointe du capillaire. Ensuite, appliquez une pression sur la pédale pour confirmer que les solutions plasmides s’épuisent facilement de l’aiguille sans entrave.Lorsque l’aiguille est prête, transférer un poisson zèbre du réservoir d’élevage dans un récipient de solution anesthésique. Et attendre quelques minutes jusqu’à ce que le mouvement des branchies s’apaie. Appuyez sur le côté dorsal du poisson sous sedated vers le haut sur une éponge pré-mouillée sous le stéréomicroscope, et utilisez un microknife disséquant en acier inoxydable avec un bord de coupe de 40 millimètres et une épaisseur de 0,5 millimètre pour créer soigneusement un petit trou dans le crâne de poisson sur le côté postérieur du telencéphalon, juste à côté de la bordure du tectum optique.Inclinez le poisson au besoin et orientez la pointe du capillaire en verre vers le crâne dans l’angle correct pour faciliter la pénétration de la pointe capillaire à travers le trou. Ensuite, insérez très soigneusement la pointe du capillaire dans le trou à travers la couche dorsale des cellules épendymales, jusqu’à ce qu’elle atteigne le ventricule télencéphale, et appliquez une pression sur la pédale pendant environ 10 secondes pour délivrer environ 1 microlitre de la solution plasmide. Le succès de la livraison peut être confirmé en observant la propagation du liquide vert dans tout le ventricule.Couvrir le télencéphale de poisson avec une petite quantité de gel à ultrasons. Pour l’électroporation de l’animal injecté par plasmide, retirez l’éponge de l’injection et plongez le côté intérieur des électrotips dans le gel à ultrasons. Placez la tête de poisson entre les électrodes, avec l’électrode positive sur le côté ventral de la tête et l’électrode négative sur le côté dorsal.Puis, tout en tenant le corps du poisson dans l’éponge, appuyez sur les électrodes doucement et précisément contre le télencéphale et administrer le courant avec la pédale, en maintenant les électrodes en place jusqu’à ce que les cinq impulsions soient terminées. Si l’électroporation est réussie, des cellules ependymoglial simples étiquetées plasmides peuvent être observées parmi les cellules ependymoglial non plasmides étiquetées. Selon l’efficacité du processus d’électroporation, un nombre plus élevé ou inférieur de cellules épendymogliales peut être étiqueté.Néanmoins, le protocole démontré donne un plus grand nombre de cellules étiquetées que les protocoles précédemment publiés. Notez que la plus forte densité de cellules étiquetées tend à émerger principalement du côté ventriculaire intérieur des deux hémisphères en raison de la façon dont le liquide plasmide injecté se répartit entre les hémisphères. Dans cette vidéo, un hémisphère du télencéphale de poisson zèbre est présenté en 3D, où les cellules épendymoglial avec des processus radio, sont dans le magenta une fois observés du côté.Par co-électroporation avec un autre plasmide qui étiquette les noyaux, la division cellulaire des cellules épendymoglial peut être observée. L’électroporation infructueuse entraîne un nombre très faible ou aucune cellule épendymoglial étiquetée. Les cellules épendymales dorsales, cependant, sont les plus susceptibles d’être étiquetées.Leur soma est plus grand dans cuboïde et ils ne possèdent pas de processus radio-allongés comme évident d’une vue latérale de la couche cellulaire épendymoglial. les cellules étiquetées tdTomato-mem sont très probablement des cellules épendymales, qui sont situées au-dessus de la couche d’ependymoglia. En revanche, l’introduction d’un tdTomato-mem exprimant le plasmide aux cellules ependmyoglial individuelles a comme conséquence l’expression de tdTomato-mem en plus de l’étiquetage initial de cellules.Les choses les plus importantes à retenir sont de couper seulement la pointe du capillaire et de pénétrer la couche épendymale tout en injectant de sorte que le liquide se propage dans tout le ventricule. Cette technique permet la surveillance à long terme des cellules ependymoglial simples par imagerie in vivo, et donc établir leur rôle dans la régénération du cerveau ainsi que leur vaste lien génétique in vivo.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Régénération rénale à l&#39;âge adulte poisson zèbre par gentamicine blessures induites

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Recherche

Biologie du développement

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Transfert de gènes dans l&#39;organe de poulet Auditory par<em&gt; Dans Ovo</em&gt; Micro-électroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Imagerie in vivo de Transgenic Gene Expression en Retinal individuelle progéniteurs dans chimériques Zebrafish Embryons à étudier cellulaires Influences non autonomes

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Dans Ovo Electroporation dans le Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application de RNAi et Expression du facteur de Transcription induite par la chaleur-choc pour reprogrammer les cellules germinales de neurones chez c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

SiRNA de nanoparticule-mediated Gene silencing coeur de poisson-zèbre adulte

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiser le nœud et la notochorde plaque en Gastrulating des embryons de souris à l’aide de la microscopie électronique à balayage et toute monture Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Modèles de lésion du poisson-zèbre adulte pour étudier les effets de la Prednisolone dans la régénération de tissu osseux

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...