Name: electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon
Uploaded: 2019-09-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon at JoVE.com

Besonderer Dank geht an James Copti für die Bearbeitung des Manuskripts. Wir danken auch der Finanzierung von JN durch die Deutsche Forschungsstiftung (DFG) durch die SFB 870 und SPP "Integrative Analyse der Olfaction" und SPP 1738 "Emerging roles of non-coding RNAs in nervous system development, plastizität & disease", SPP1757 " Glial heterogenity" und Exzellenzstrategie im Rahmen des Munich Cluster for Systems Neurology (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).

Alle in diesem Protokoll verwendeten Tiere wurden unter Standardhaltungsbedingungen gehalten, und die Versuche wurden gemäß den Handhabungsrichtlinien und -vorschriften der EU und der Regierung von Oberbayern durchgeführt (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. Herstellung von Plasmidmischung zur Elektroporation
<ol><li>Verdünnen Sie das Plasmid von Interesse an sterilem Wasser und fügen Sie schnelle grüne Fleckenstammlösung [1 mg/ml] hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration des Plas...

<ol>
	<li>Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain.">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).</li><li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon:+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis.">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60 (3), 343-357 (2012).</li><li>Barbosa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain.">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 346 (6236), 789-793 (2015).</li><li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury.">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).</li><li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li><li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li><li>Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon.">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> Journal of Neurotrauma. , (2010).</li><li>Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+brain+injury+in+adult+zebrafish+stimulates+neurogenesis+and+long-distance+neuronal+integration.">Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration.</a> Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).</li><li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult.">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Development. 8 (3), (2013).</li><li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates.">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li><li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).</li><li>Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glia+and+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+central+nervous+system.">Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system.</a> Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).</li><li>Lyons, D. A., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+development+and+function+in+zebrafish.">Glial cell development and function in zebrafish.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).</li><li>Obermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Surface+Proteome+of+Adult+Neural+Stem+Cells+in+Zebrafish+Unveils+Long-Range+Cell-Cell+Connections+and+Age-Related+Changes+in+Responsiveness+to+IGF.">The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Kusumanto, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+in+vivo+transfer+of+plasmid+DNA+in+muscle:+comparison+of+electroporation+versus+ultrasound.">Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound.</a> Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).</li><li>Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gene+transfer+into+the+adult+zebrafish+brain+by+herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+electroporation:+methods+and+optogenetic+applications.">Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).</li><li>Van Tendeloo, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells:+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells.">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98 (1), 49-56 (2001).</li><li>Mars, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotransfection+and+lipofection+show+comparable+efficiency+for+in+vitro+gene+delivery+of+primary+human+myoblasts.">Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts.</a> The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).</li><li>Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+in+vivo+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+the+zebrafish+telencephalon.">Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon.</a> Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).</li><li>Di Giaimo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aryl+Hydrocarbon+Receptor+Pathway+Defines+the+Time+Frame+for+Restorative+Neurogenesis.">The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis.</a> Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).</li><li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+generation+of+customizable+gRNA+vectors+for+multiplex+CRISPR+approaches+through+string+assembly+gRNA+cloning+(STAgR).">One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR).</a> PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).</li><li>Barbosa, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , (2014).</li><li>Kelsh, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+pigmentation+mutations+and+the+processes+of+neural+crest+development.">Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development.</a> Development. 123, 369-389 (1996).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry.">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).</li><li>Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+formation+with+plasmid+DNA+increases+the+cytotoxicity+of+cationic+liposomes.">Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).</li><li>Chapouton, P., Godinho, L., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. 100, (2010).</li><li>Zhu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System.">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).</li></ol>

Dieses Elektroporationsprotokoll ist eine zuverlässige In-vivo-Methode zur Kennzeichnung einzelner ependymotaler Zellen. Das Protokoll kann eine weitere Anpassung benötigen, um andere Zelltypen wie Neuronen oder Oligodendrozyten zu kennzeichnen. Um eine erfolgreiche Kennzeichnung zu erreichen, können Plasmide verwendet werden, die verschiedene Promotoren enthalten. Chicken-beta Actin Promoter, eF1alpha, CMV und Ubiquitin Promoter wurden zuvor verwendet, um die Expression von verschiedenen Transgenen in Ependymoglia un...

Zebrafische sind ausgezeichnete Tiermodelle, um die Hirnregeneration nach einer Stichwunde zu untersuchen. Im Vergleich zu Säugetieren weisen auf der evolutionären Leiter weniger entwickelte Arten wie Zebrafische im Allgemeinen höhere Raten konstitutiver Neurogenese und breitere Bereiche des aufenthaltes von adulten neuronalen Stammzellen auf, was zu einer konstanten Erzeugung neuer Neuronen im gesamten die meisten Hirnbereiche im Erwachsenenleben. Diese Funktion scheint mit deutlich höheren Regenerationsfähigkeit von Zebrafischen im Vergleich zu Säugetieren1korrelieren, da Zebrafische ein bemerkenswertes Potenzial haben, in den meisten untersuchten Hirnverletzungsmodellen effizient neue Neuronen zu erzeugen2, 3,4,5,6,7,8. Hier wird der Zebrafisch Telencephalon untersucht, da es sich um ein Hirngebiet mit prominenter Neurogenese im Erwachsenenalter handelt. Diese Zonen der adulten Neurogenese sind homologe zu neurogenen Zonen im erwachsenen Säugetiergehirn9,10,11.
Reichlich neurogene Bereiche im Zebrafisch Telencephalon sind aufgrund der Existenz von radialen Glia wie Zellen oder Ependymoglia-Zellen vorhanden. Ependymogliade Zellen fungieren als ansässige adulte neuronale Stammzellen und sind verantwortlich für die Erzeugung neuer Neuronen sowohl im intakten als auch im regenerierenden Gehirn3,5. Lineage-Tracing-Experimente haben gezeigt, dass ventrikuläre Ependymoglia auf Verletzungen reagieren, sich dannvermehren und neue Neuroblasten erzeugen, die zur Läsionsstelle 5 wandern. Aufgrund der immerleten Natur von Zebrafischtelencephalon säumen ependymogliale Zellen die ventrikuläre Oberfläche und bauen die ventrale ventrikuläre Wand. Die dorsale ventrikuläre Wand wird durch eine dorsale ependymale Zellschicht gebildet (Abbildung 1A). Wichtig ist, dass Zebrafische ependymoglia die Eigenschaften sowohl der Radialglia als auch der ependymalen Zellen verkörpern. Lange radiale Prozesse sind ein typisches Merkmal von radialen Gliazellen, während Zellverlängerungen und enge Knoten (sowie ihre ventrikulären Positionen) typische Merkmale der ependymalen Zellen12,13,14sind. Daher werden diese Zellen als ependymogliade Zellen bezeichnet.
Um dem In-vivo-Verhalten einzelner ependymotgliaaler Zellen während der Regeneration zu folgen, müssen sie zuverlässig beschriftet werden. Verschiedene Methoden der In-vivo-Zellbeschriftung für die fluoreszierende Mikroskopie wurden bereits beschrieben, wie z. B. endogene Reporter oder lipophile Farbstoffe15. Diese Methoden können im Gegensatz zur Elektroporation längere Zeiträume erfordern und bieten oft nicht die Möglichkeit der Einzelzellkennzeichnung oder permanenten Langzeitverfolgung. Die Elektroporation bietet jedoch (neben der Einzelzellbeschriftung) die Möglichkeit, neue DNA in die Wirtszelle einzuführen. Darüber hinaus hat sich im Vergleich zu anderen Methoden der DNA-Übertragung in die Zellen gezeigt, dass die Elektroporation eine der effizientesten Methoden16,17,18,19ist.
Hier wird ein Elektroporationsprotokoll vorgestellt, das verfeinert wurde, um einzelne ependymogliale Zellen im erwachsenen Zebrafischtelencephalon zu kennzeichnen. Dieses Protokoll ermöglicht die Kennzeichnung einzelner ependyglialer Zellen, um ihnen über einen längeren Zeitraumvon 20 zu folgen oder bestimmte Wege zellautonom zu manipulieren21,22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>For coloring plasmid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>SignaGel, Parker laboratories INC.</td>
			<td>15-60</td>
			<td>Electrode Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>TetraTec APS 50, 10l-60l</td>
			<td></td>
			<td>Can be bought in the pet shops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX Tweezertrodes Electrodes</td>
			<td>Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0486</td>
			<td>1mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation device</td>
			<td>BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection device</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Wall Borosillicate Glass Capillary</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0766</td>
			<td>Model No: G100-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10056-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Joystick micromanipulator</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>MN - 151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Needle holder comes together with the injection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle pulling device</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>Model No: PC-10</td>
			<td>The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One International</td>
			<td>633161</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon

Elektroporation ist ein Transfektionsverfahren, bei dem ein elektrisches Feld auf Zellen angewendet wird, um temporäre Poren in einer Zellmembran zu erzeugen und ihre Durchlässigkeit zu erhöhen, wodurch verschiedene Moleküle in die Zelle eingeführt werden können. In diesem Papier wird Elektroporation verwendet, um Plasmide in ependymogliale Zellen einzuführen, die die ventrikuläre Zone des erwachsenen Zebrafischtelencephalons aussäumen. Ein Bruchteil dieser Zellen zeigt Stammzelleigenschaften und erzeugt neue Neuronen im Zebrafischgehirn; Daher ist es wichtig, ihr Verhalten zu untersuchen, um ihre Rolle bei der Neurogenese und Regeneration zu bestimmen. Die Einführung von Plasmiden über Elektroporation ermöglicht die langfristige Kennzeichnung und Verfolgung einer einzelnen ependymogliaalen Zelle. Darüber hinaus können Plasmide wie Cre recombinase oder Cas9 an einzelne ependymogliade Zellen abgegeben werden, was eine Genrekombination oder Genbearbeitung ermöglicht und eine einzigartige Gelegenheit bietet, die autonome Genfunktion der Zelle in einer kontrollierten, natürlichen umgebung. Schließlich wird dieses detaillierte, schrittweise Elektroporationsprotokoll verwendet, um eine erfolgreiche Einführung von Plasmiden in eine große Anzahl von einzelnen ependymogliaalen Zellen zu erhalten.

Die beschriebene Elektroporationsmethode ermöglicht die Abgabe von Plasmid-DNA in ependymogliale Zellen, die sich oberflächlich im Zebrafischtelencephalon und knapp unter der dorsalen ependymalen Zellschicht befinden (Abbildung 1A).
Wenn das Ergebnis der Elektroporation positiv ist, können markierte einzelne ependygliale Zellen (rote Zellen in Abbildung 2A,B) unter anderen ependy...

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Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Präsentiert wird hier eine Elektroporationsmethode für die Plasmid-DNA-Abgabe und ependymogliale Zellbeschriftung im erwachsenen Zebrafischtelencephalon. Dieses Protokoll ist eine schnelle und effiziente Methode zur Visualisierung und Verfolgung einzelner ependymoglialer Zellen und eröffnet neue Möglichkeiten, Elektroporation auf eine breite Palette genetischer Manipulationen anzuwenden.

Elektroporationsmethode zur In-Vivo-Lieferung von Plasmid-DNA im erwachsenen Zebrafisch Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Kennzeichnung einzelner ependymogliale Zellen im ZebrafischTelencephalon, um ihre Langzeitüberwachung zu ermöglichen, sowie die Manipulation bestimmter Wege auf zellautonome Weise. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Einzelzellbeschriftung auf schnelle und effiziente Weise sowie die Genbearbeitung und Signalwegmanipulation auf zellautonome Weise ermöglicht. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung grundlegender zellbiologischer Fragen, z. B. zur Zelldelamination, zur Aufrechterhaltung der epitheliaalen Homöostase und zur Symmetrie der Zellteilung.Beginnen Sie mit einem Nadelziehgerät, um Glaskapillaren vorzubereiten. Verwenden Sie Mikrolader-Spitzen, um eine vorbereitete Glaskapillare mit zehn Mikrolitern Plasmidlösung zu füllen. Dann drücken Menü wechselkapillar"auf der Injektionsvorrichtung, damit die Nadel in den Nadelhalter geladen werden kann.Wechseln Sie dann die Injektionsvorrichtung von der Kapillare in den Injektionsmodus. Dann schneiden Sie mit einem Stereomikroskop mit vierfacher Vergrößerung und Einer Zange nur die Spitze der Kapillare. Dann drucke auf das Fußpedal, um zu bestätigen, dass die Plasmidlösungen problemlos aus der Nadel herauslaufen.Wenn die Nadel fertig ist, übertragen Sie einen Zebrafisch aus dem Haltungsbecken in einen Behälter mit Anästhesielösung. Und warten Sie ein paar Minuten, bis die Bewegung der Kiemen nachlässt. Drücken Sie die sedierte Fisch-Rückenseite auf einen vorbenetzten Schwamm unter dem Stereomikroskop und verwenden Sie ein Edelstahl-Sezierendes Mikromesser mit einer 40-Millimeter-Schneide und einer Dicke von 0,5 Millimetern, um vorsichtig ein kleines Loch im Fischschädel an der hinteren Seite des Telencephalons zu schaffen, direkt neben dem Rand des optischen Tektums.Neigen Sie den Fisch nach Bedarf und richten Sie die Spitze der Glaskapillare in den richtigen Winkel, um das Eindringen der Kapillarspitze durch das Loch zu erleichtern. Dann legen Sie die Spitze der Kapillare sehr vorsichtig durch die dorsale ependymale Zellschicht in das Loch ein, bis sie die telenzephalische Herzkammer erreicht, und drücken Sie das Fußpedal für etwa 10 Sekunden, um etwa 1 Mikroliter der Plasmidlösung zu liefern. Der Erfolg der Lieferung kann durch die Beobachtung der Ausbreitung der grünen Flüssigkeit im gesamten Ventrikel bestätigt werden.Bedecken Sie den Fisch Telencephalon mit einer kleinen Menge Ultraschallgel. Für die Elektroporation des Plasmid-injizierten Tieres, entfernen Sie den Schwamm aus dem Injektionsaufbau und tauchen Sie die Innenseite der Elektrospitzen in Ultraschallgel. Positionieren Sie den Fischkopf zwischen den Elektroden, mit der positiven Elektrode an der ventralen Seite des Kopfes und der negativen Elektrode auf der dorsalen Seite.Dann, während Sie noch den Körper des Fisches im Schwamm halten, drücken Sie die Elektroden sanft und präzise gegen das Telencephalon und verabreichen Sie den Strom mit dem Fußpedal, wobei die Elektroden an Ort und Stelle gehalten werden, bis alle fünf Impulse fertig sind. Wenn die Elektroporation erfolgreich ist, können Plasmid-markierte einzelne ependymogliaale Zellen unter den nicht-plasmidmarkierten ependymogliaalen Zellen beobachtet werden. Je nach Effizienz des Elektroporationsprozesses kann eine höhere oder geringere Anzahl von ependymogliaalen Zellen beschriftet werden.Dennoch ergibt das demonstrierte Protokoll eine höhere Anzahl von markierten Zellen als zuvor veröffentlichte Protokolle. Beachten Sie, dass die höchste Dichte der markierten Zellen meist an der inneren ventrikulären Seite beider Hemisphären entsteht, da sich die injizierte Plasmidflüssigkeit zwischen den Hemisphären verteilt. In diesem Video wird eine Hemisphäre des Zebrafischtelencephalons in 3D dargestellt, wo die ependymogliale Zellen mit Radioprozessen in Magenta sind, wenn sie von der Seite beobachtet werden.Durch Ko-Elektroporation mit einem anderen Plasmid, das Kerne etikettiert, kann die Zellteilung von ependymogliaalen Zellen beobachtet werden. Erfolglose Elektroporation führt zu einer sehr geringen Anzahl oder keine beschrifteten ependymogliaalen Zellen. Dorsale ependymale Zellen sind jedoch am ehesten beschriftet.Ihr Soma ist im Quader größer und sie besitzen keine radiolänglichen Prozesse, wie aus einer Seitenansicht der ependymoglialzelligen Zellschicht ersichtlich ist. tdTomato-mem-markierte Zellen sind höchstwahrscheinlich ependymale Zellen, die sich oberhalb der Schicht von Ependymoglia befinden. Im Gegensatz dazu führt die Einführung eines tdTomato-mem, das Plasmid in einzelne ependmyogliale Zellen ausdrückt, zusätzlich zur anfänglichen Zellbeschriftung zu einer tdTomato-mem-Expression.Die wichtigsten Dinge, die Sie sich merken sollten, sind, nur die Spitze der Kapillare zu schneiden und die ependymale Schicht während der Injektion zu durchdringen, so dass sich die Flüssigkeit über den Ventrikel ausbreitet. Diese Technik ermöglicht die langzeitige Überwachung einzelner ependymotaler Zellen durch In-vivo-Bildgebung und damit die Etablierung ihrer Rolle bei der Regeneration des Gehirns sowie ihrer enormen genetischen In-vivo-Verbindung.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Nieren-Regeneration im erwachsenen Zebrafisch durch Gentamicin induzierte Schädigung

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gentransfer in das Huhn Hörorgan von<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-Elektroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation im Hühnchen auditorischen Hirnstamm

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Nanopartikel-vermittelten SiRNA Gen-silencing in Erwachsenen Zebrafisch-Herz

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Erwachsenen Zebrafisch Verletzungen Modelle zur Untersuchung der Auswirkungen von Prednisolon bei der Regeneration von Knochengewebe

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...