Name: electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon
Uploaded: 2019-09-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon at JoVE.com

תודות מיוחדות לג Copti לעריכת כתב היד. אנו גם מממנים בהכרת תודה ל JN מקרן המחקר הגרמני (DFG) על ידי SFB 870 ו SPP ניתוח אינטגרטיבי של Olfaction "ו SPP 1738" תפקידים מתעוררים RNAs ללא קידוד בפיתוח מערכת העצבים, פלסטיות & מחלה ", SPP1757" Glial טרוגניות ", ואסטרטגיית מצוינות במסגרת אשכול מינכן לנוירולוגיה מערכות (EXC 2145 סינרגיה-ID 390857198).

כל החיות המשמשות בפרוטוקול זה נשמרו תחת תנאי גידול סטנדרטיים, וניסויים בוצעו על פי הנחיות הטיפול והתקנות של האיחוד האירופי וממשלת בוואריה עילית (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. הכנת תערובת פלאמיד לאלקטרופורציה
<ol><li>לדלל את הפלסטלינה של העניין במים סטריליים ולהוסיף מהיר הירוק פתרון מלאי ?...

<ol>
	<li>Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain.">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).</li><li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon:+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis.">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60 (3), 343-357 (2012).</li><li>Barbosa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain.">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 346 (6236), 789-793 (2015).</li><li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury.">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).</li><li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li><li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li><li>Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon.">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> Journal of Neurotrauma. , (2010).</li><li>Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+brain+injury+in+adult+zebrafish+stimulates+neurogenesis+and+long-distance+neuronal+integration.">Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration.</a> Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).</li><li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult.">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Development. 8 (3), (2013).</li><li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates.">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li><li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).</li><li>Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glia+and+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+central+nervous+system.">Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system.</a> Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).</li><li>Lyons, D. A., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+development+and+function+in+zebrafish.">Glial cell development and function in zebrafish.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).</li><li>Obermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Surface+Proteome+of+Adult+Neural+Stem+Cells+in+Zebrafish+Unveils+Long-Range+Cell-Cell+Connections+and+Age-Related+Changes+in+Responsiveness+to+IGF.">The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Kusumanto, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+in+vivo+transfer+of+plasmid+DNA+in+muscle:+comparison+of+electroporation+versus+ultrasound.">Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound.</a> Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).</li><li>Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gene+transfer+into+the+adult+zebrafish+brain+by+herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+electroporation:+methods+and+optogenetic+applications.">Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).</li><li>Van Tendeloo, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells:+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells.">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98 (1), 49-56 (2001).</li><li>Mars, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotransfection+and+lipofection+show+comparable+efficiency+for+in+vitro+gene+delivery+of+primary+human+myoblasts.">Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts.</a> The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).</li><li>Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+in+vivo+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+the+zebrafish+telencephalon.">Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon.</a> Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).</li><li>Di Giaimo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aryl+Hydrocarbon+Receptor+Pathway+Defines+the+Time+Frame+for+Restorative+Neurogenesis.">The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis.</a> Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).</li><li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+generation+of+customizable+gRNA+vectors+for+multiplex+CRISPR+approaches+through+string+assembly+gRNA+cloning+(STAgR).">One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR).</a> PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).</li><li>Barbosa, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , (2014).</li><li>Kelsh, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+pigmentation+mutations+and+the+processes+of+neural+crest+development.">Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development.</a> Development. 123, 369-389 (1996).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry.">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).</li><li>Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+formation+with+plasmid+DNA+increases+the+cytotoxicity+of+cationic+liposomes.">Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).</li><li>Chapouton, P., Godinho, L., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. 100, (2010).</li><li>Zhu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System.">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).</li></ol>

פרוטוקול אלקטרופורציה זו הוא שיטה אמינה בvivo לתיוג תאים בודדים ependymoglial. הפרוטוקול עשוי להזדקק לעיבוד נוסף כדי לתייג סוגי תאים אחרים כגון נוירונים או oligodendrocytes הפוך. כדי להשיג תוויות מוצלחות, ניתן להשתמש בפלמידים המכילים היזמים שונים. עוף בטא אקטין מיזם, eF1alpha, cmv ו מקדם אוביקוויב השתמשו בעבר ?...

בכדי לבחון התחדשות מוחית. לאחר פציעה בפצע דקירה בהשוואה ליונקים, על הסולם האבולוציוני, מינים מפותחים פחות כגון דג זברה בדרך כלל להציג שיעורי גבוה יותר של נוירוגנזה ואזורים נרחבים של מגורים מבוגרים תא גזע עצבי, המוביל לדור קבוע של נוירונים חדשים ברחבי רוב אזורי המוח בחיים הבוגרים. תכונה זו מופיעה בתיאום עם קיבולת משובי גבוהה באופן משמעותי של דג דג זברה בהשוואה ליונקים1, כמו דג זברה יש פוטנציאל מדהים ליצור ביעילות נוירונים חדשים ברוב מודלים של פגיעה במוח למדו2, . שלוש,ארבע,חמש,שש,שבע, שמונה כאן מחקר הדגים הזינצאלון נלמד, שכן הוא אזור מוחי עם נוירוגנזה בולטת בבגרות. אזורים אלה של נוירוגנזה למבוגרים הם הומוולוגי לאזורים נוירוגניים במוח היונקים הבוגרים9,10,11.
שופע באזורים נוירוגניים ב-דג זברה telencephalon נוכחים בשל קיומו של הרדיאלי glia כמו תאים או תאים ependymoglia. Ependymoglial תאים לפעול כתושב תאי גזע עצביים למבוגרים ואחראים על הדור של נוירונים חדשים במוח שלמים ומתחדשות3,5. ניסויים מעקב השושלת הראו כי ependymoglia חדרית להגיב לפציעה, לאחר מכן מתרבים וליצור חדש neuroblasts נמשך להגר לאתר הנגע5. בשל טבעו הטבעי של הדגים הזינצאלון, תאים ependymoglial קו המשטח החדרית ולבנות את הקיר החדרית הגייתי. הקיר הבין-חדרית נוצר על ידי שכבת תא ependymal (איור 1A). וחשוב מכך, דג זברה ependymoglia לגלם את המאפיינים של שני היונקים הרדיאליים והתאים ependymal. תהליכים רדיאליים ארוכים הם תכונה טיפוסית של תאים הרדיאלי של גליה, ואילו הרחבות סלולר וצמתים הדוקים (כמו גם המיקומים החדרית שלהם) הם תכונות טיפוסיות של ependymal תאים12,13,14. לכן, תאים אלה נחשבים לתאים ependymoglial.
כדי לעקוב אחר התנהגות vivo של תאים בודדים ependymoglial במהלך התחדשות, הם צריכים להיות מתויג באופן אמין. שיטות שונות של vivo תא תיוג עבור מיקרוסקופ פלורסנט תוארו בעבר, כגון כתבים אנדוגני או צבע ליפופילית15. שיטות אלה, בניגוד לאלקטרופורציה, עשויות לדרוש פרקי זמן ארוכים יותר ולעתים קרובות אינן מציעות אפשרות של תיוג תאים בודד או מעקב קבוע לטווח ארוך. אלקטרופורציה, עם זאת (מלבד תוויות תא יחיד), מציעה את האפשרות של החדרת DNA חדש לתא המארח. יתר על כן, לעומת שיטות אחרות של העברת DNA לתוך התאים, אלקטרופורציה הוכח להיות אחת השיטות היעילות ביותר16,17,18,19.
מוצג כאן הוא פרוטוקול אלקטרופורציה כי כבר מעודן לצורך תיוג תאים ependymoglial בודדים בתוך המבוגר הדגים telencephalon. פרוטוקול זה מאפשר תיוג של תאים ependymoglial יחיד כדי לעקוב אחריהם לאורך תקופה ארוכת טווח20 או לטפל מסלולים ספציפיים באופן אוטונומי התא21,22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>For coloring plasmid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>SignaGel, Parker laboratories INC.</td>
			<td>15-60</td>
			<td>Electrode Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>TetraTec APS 50, 10l-60l</td>
			<td></td>
			<td>Can be bought in the pet shops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX Tweezertrodes Electrodes</td>
			<td>Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0486</td>
			<td>1mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation device</td>
			<td>BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection device</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Wall Borosillicate Glass Capillary</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0766</td>
			<td>Model No: G100-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10056-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Joystick micromanipulator</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>MN - 151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Needle holder comes together with the injection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle pulling device</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>Model No: PC-10</td>
			<td>The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One International</td>
			<td>633161</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon

אלקטרופורציה היא שיטת המשך החצייה שבה שדה חשמלי מוחל על תאים כדי ליצור נקבוביות זמניות בקרום התא ולהגדיל את החדירות שלה, ובכך לאפשר למולקולות שונות להיות מוצגים לתא. במאמר זה, אלקטרופורציה משמש כדי להחדיר פלמידים כדי ependymoglial תאים, אשר קו האזור החדרית של המבוגר ביותר הדגים telencephalon. חלק של תאים אלה מראה מאפייני תא גזע ומייצר נוירונים חדשים במוח דג זברה; לכן, לימוד התנהגותם חיוני כדי לקבוע את תפקידם בנוירוגנזה והתחדשות. הקדמה של פלסטלינה באמצעות אלקטרופורציה מאפשרת תיוג לטווח ארוך ומעקב אחר תא ependymoglial יחיד. יתר על כן, פלמידים כגון היצורים recombinase או Cas9 יכולים להיות מועברים לתאים בודדים ependymoglial, אשר מאפשר שילוב גנים או לערוך גנים ומספק הזדמנות ייחודית להעריך את פונקציית הגן האוטונומית של התא בשליטה, טבעי סביבה. בסופו של דבר, פרוטוקול האלקטרופורציה המפורט, שלב-אחר-שלב משמש להשגת הקדמה מוצלחת של פלמידים למספר רב של תאים ependymoglial בודדים.

שיטת האלקטרופורציה המתוארת מאפשרת אספקת דנ א פלמיד לתוך ependymoglial תאים, אשר נמצאים באופן שטחי ביותר בתוך הטלודג הזינצאלון ומתחת לשכבת התא הependymal (איור 1A).
אם תוצאת האלקטרופורציה חיובית, הנקראת ependymoglial תאים בודדים (תאים אדומי?...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon at JoVE.com

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

מוצג כאן הוא שיטת אלקטרופורציה עבור משלוח ה-DNA של הפלזמה ותיוג תא ependymoglial במבוגר בלדג טלנצאלון. פרוטוקול זה הוא שיטה מהירה ויעילה כדי להמחיש ולעקוב אחר תאים ependymoglial בודדים ופותחת אפשרויות חדשות להחיל אלקטרופורציה על מגוון רחב של מניפולציות גנטיות.

שיטת אלקטרופורציה לVivo משלוח של דנ א פלמיד בוגרים בדג טלנצאלון

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

פרוטוקול זה מאפשר תיוג של תאים ependymoglial בודדים בטלנצפלון דג הזברה כדי לאפשר ניטור ארוך טווח שלהם, כמו גם מניפולציה של מסלולים ספציפיים באופן תא אוטונומי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת תיוג תא יחיד בצורה מהירה ויעילה, כמו גם עריכת גנים ומניפולציה מסלול איתות באופן תא אוטונומי. שיטה זו מאפשרת חקירה של שאלות בסיסיות של ביולוגיה של התא, למשל, על דללנציה של תאים, תחזוקה של הומלוסטזיס אפיתל, ואת הסימטריה של חלוקת התא.התחל באמצעות מנגנון מושך מחט להכין נימי זכוכית. השתמש בטיפים microloader כדי למלא נימי זכוכית מוכן עם עשרה microliters של פתרון פלסמיד. לאחר מכן לחץ על תפריט לשנות נימי"על מכשיר ההזרקה כדי לאפשר את המחט להיות טעון לתוך מחזיק המחט.לאחר מכן החלף את התקן ההזרקה משינוי נימי למצב הזרקה. לאחר מכן, באמצעות סטריאומיקרוסקופ עם הגדלה פי ארבעה, ומדפים Finden, לחתוך רק את קצה נימי. לאחר מכן להחיל לחץ על דוושת כף הרגל כדי לאשר כי פתרונות פלסמיד פועל בקלות מתוך המחט ללא הפרעה.כאשר המחט מוכנה, להעביר דג זברה ממיכל הבעלים למיכל של פתרון הרדמה. ולחכות כמה דקות עד שתנועת הזימים תירגע. לחץ על צד הגב דגים הרגעה עד ספוג רטוב מראש מתחת סטריאומיקרוסקופ, ולהשתמש נירוסטה לנתח microknife עם 40 מילימטר חיתוך קצה ועובי 0.5 מילימטר כדי ליצור בזהירות חור קטן בגולגולת הדג בצד האחורי של telencephalon, ממש ליד הגבול של טקטום אופטי.להטות את הדג לפי הצורך ולכוון את קצה נימי הזכוכית לכיוון הגולגולת בזווית הנכונה כדי להקל על חדירה של קצה נימי דרך החור. לאחר מכן, בזהירות רבה להכניס את קצה נימי לתוך החור דרך שכבת התא ependymal הגבי, עד שהוא מגיע החדר telencephalic, ולהחיל לחץ על דוושת כף הרגל במשך כ 10 שניות כדי לספק כ 1 microliter של פתרון פלסמיד. ההצלחה של המשלוח ניתן לאשר על ידי התבוננות התפשטות הנוזל הירוק לאורך החדר.מכסים את הדג telencephalon עם כמות קטנה של ג'ל אולטרסאונד. עבור אלקטרופורציה של החיה מוזרק פלסמיד, להסיר את הספוג מן הגדרת ההזרקה לטבול את הצד הפנימי של electrotips לתוך ג'ל אולטרסאונד. מקם את ראש הדג בין האלקטרודות, עם האלקטרודה החיובית בצד הגחוני של הראש והאלקטרודה השלילית בצד הגבי.לאחר מכן, בעוד עדיין מחזיק את הגוף של הדג בספוג, לחץ על האלקטרודות בעדינות ובדיוק נגד telencephalon ולנהל את הזרם עם דוושת הרגל, מחזיק את האלקטרודות במקום עד כל חמשת הפולסים הם סיימו. אם האלקטרופוריה מוצלחת, ניתן לראות פלסמיד שכותרתו תאים ependymoglial יחיד בין התאים שאינם פלסמיד שכותרתו ependymoglial. בהתאם ליעילות של תהליך האלקטרופוזיה, מספר גבוה או נמוך יותר של תאים ependymoglial עשוי להיות מסומן.עם זאת, הפרוטוקול המודגם מניב מספר גבוה יותר של תאים מסומנים בתווית מאשר פרוטוקולים שפורסמו בעבר. שים לב כי הצפיפות הגבוהה ביותר של תאים מסומנים נוטה להופיע בעיקר בצד החדר הפנימי של שתי ההמיספרות בשל האופן שבו נוזל פלסמיד מוזרק מפיץ בין ההמיספרות. בסרטון זה, חצי כדור אחד של telencephalon דג הזברה מוצג 3D, שם התאים ependymoglial עם תהליכי רדיו, נמצאים מגנטה כאשר נצפה מהצד.באמצעות אלקטרופורציה שותף עם פלסמיד אחר כי תוויות גרעינים, חלוקת תאים של תאים ependymoglial ניתן לראות. אלקטרופוליאציה לא מוצלחת גורמת למספר נמוך מאוד או ללא תאים ependymoglial שכותרתו. תאים ependymal הגבית, לעומת זאת, הם הסיכוי הטוב ביותר להיות מתויג.סומא שלהם הוא גדול יותר בקובואיד והם אינם בעלי תהליכים מוארכים רדיו כפי שניתן לראות מנקודת מבט צדדית של שכבת התא ependymoglial. תאים המסומן tdTomato-mem הם ככל הנראה תאים תלותיים, הממוקמים מעל השכבה של ependymoglia. לעומת זאת, כניסתה של tdTomato-mem המבטאת פלסמיד לתאי ependmyoglial בודדים גורמת לביטוי tdTomato-mem בנוסף לתיוג התא הראשוני.הדברים החשובים ביותר לזכור הם לחתוך רק את קצה נימי לחדור את השכבה ependymal תוך הזרקת כך הנוזל מתפשט בכל החדר. טכניקה זו מאפשרת ניטור ארוך טווח של תאים ependymoglial יחיד באמצעות הדמיה in vivo, ולכן לבסס את תפקידם התחדשות המוח, כמו גם הקישור הגנטי העצום שלהם vivo.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי<em&gt; ב אובו</em&gt; מיקרו electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

ב Electrooration Ovo ב המוח עוף שמיעה

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

בתיווך Nanoparticle siRNA ג'ין להחרשת בלב דג זברה למבוגרים

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

דג זברה בוגרת מודלים פציעה ללמוד את השפעות Prednisolone רגנרציה רקמת העצם

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...