Name: electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon
Uploaded: 2019-09-13T15:00:00
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पांडुलिपि के संपादन के लिए जेम्स Copti के लिए विशेष धन्यवाद. हम भी आभारी जर्मन अनुसंधान फाउंडेशन (DFG) से जेएन के लिए धन SFB 870 और एसपीपी द्वारा "Olfaction के एकीकृत विश्लेषण" और SPP 1738 "नर्वस सिस्टम के विकास में गैर-कोडिंग आरएनए की भूमिका, प्लास्टिक और रोग", SPP1757 " Glial विषमता", और उत्कृष्टता रणनीति सिस्टम न्यूरोलॉजी के लिए म्यूनिख क्लस्टर के ढांचे के भीतर (EXC 2145 SyNergy - आईडी 390857198).

इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सभी जानवरों को मानक पशुपालन शर्तों के तहत रखा गया था, और यूरोपीय संघ और ऊपरी बवेरिया की सरकार के हैंडलिंग दिशानिर्देशों और विनियमों के अनुसार प्रयोग किए गए हैं (एजेड 55.2-1-54-2532-0916)।<...

<ol>
	<li>Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain.">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).</li><li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon:+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis.">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60 (3), 343-357 (2012).</li><li>Barbosa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain.">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 346 (6236), 789-793 (2015).</li><li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury.">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).</li><li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li><li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li><li>Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon.">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> Journal of Neurotrauma. , (2010).</li><li>Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+brain+injury+in+adult+zebrafish+stimulates+neurogenesis+and+long-distance+neuronal+integration.">Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration.</a> Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).</li><li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult.">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Development. 8 (3), (2013).</li><li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates.">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li><li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).</li><li>Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glia+and+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+central+nervous+system.">Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system.</a> Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).</li><li>Lyons, D. A., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+development+and+function+in+zebrafish.">Glial cell development and function in zebrafish.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).</li><li>Obermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Surface+Proteome+of+Adult+Neural+Stem+Cells+in+Zebrafish+Unveils+Long-Range+Cell-Cell+Connections+and+Age-Related+Changes+in+Responsiveness+to+IGF.">The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Kusumanto, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+in+vivo+transfer+of+plasmid+DNA+in+muscle:+comparison+of+electroporation+versus+ultrasound.">Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound.</a> Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).</li><li>Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gene+transfer+into+the+adult+zebrafish+brain+by+herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+electroporation:+methods+and+optogenetic+applications.">Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).</li><li>Van Tendeloo, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells:+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells.">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98 (1), 49-56 (2001).</li><li>Mars, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotransfection+and+lipofection+show+comparable+efficiency+for+in+vitro+gene+delivery+of+primary+human+myoblasts.">Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts.</a> The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).</li><li>Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+in+vivo+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+the+zebrafish+telencephalon.">Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon.</a> Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).</li><li>Di Giaimo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aryl+Hydrocarbon+Receptor+Pathway+Defines+the+Time+Frame+for+Restorative+Neurogenesis.">The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis.</a> Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).</li><li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+generation+of+customizable+gRNA+vectors+for+multiplex+CRISPR+approaches+through+string+assembly+gRNA+cloning+(STAgR).">One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR).</a> PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).</li><li>Barbosa, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , (2014).</li><li>Kelsh, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+pigmentation+mutations+and+the+processes+of+neural+crest+development.">Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development.</a> Development. 123, 369-389 (1996).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry.">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).</li><li>Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+formation+with+plasmid+DNA+increases+the+cytotoxicity+of+cationic+liposomes.">Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).</li><li>Chapouton, P., Godinho, L., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. 100, (2010).</li><li>Zhu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System.">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).</li></ol>

यह इलेक्ट्रोपोट्रेशन प्रोटोकॉल व्यक्तिगत ependymoglial कोशिकाओं लेबलिंग की vivo विधि में एक विश्वसनीय है. प्रोटोकॉल न्यूरॉन्स या oligodendrocytes के रूप में अन्य सेल प्रकार लेबल करने के लिए एक और अनुकूलन की आवश्यकता हो स?...

ज़ेब्राफ़िश एक चाकू घाव चोट के बाद मस्तिष्क पुनर्जनन की जांच करने के लिए उत्कृष्ट पशु मॉडल हैं। स्तनधारियों की तुलना में, विकासवादी सीढ़ी पर, कम विकसित प्रजातियों जैसे ज़ेब्राफ़िश आम तौर पर गठन neurogenesis और वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल निवास के व्यापक क्षेत्रों की उच्च दर दिखाने के लिए, भर में नए न्यूरॉन्स की निरंतर पीढ़ी के लिए अग्रणी वयस्क जीवन में सबसे अधिक मस्तिष्क क्षेत्रों. यह सुविधा स्तनधारियों की तुलना में जेब्राफ़िश की काफी अधिक पुनर्योजी क्षमता के साथ सहसंबंधित प्रतीत होता है1, के रूप में ज़ेब्राफ़िश सबसे मस्तिष्क चोट मॉडल में नए न्यूरॉन्स कुशलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए उल्लेखनीय क्षमता है2का अध्ययन किया, 3,4,5,6,7,8. यहाँ, ज़ेब्राफ़िश टेलीनेसेलॉन का अध्ययन किया जाता है, क्योंकि यह वयस्कता में प्रमुख न्यूरोजेनेसिस के साथ एक मस्तिष्क क्षेत्र है। वयस्क तंत्रिकाजनन के ये क्षेत्र वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क9,10,11में न्यूरोजेनिक क्षेत्रों के लिए समजात हैं .
जेब्राफिश टेलीनसेफेलॉन में प्रचुर तंत्रिकाजन्य क्षेत्र कोशिकाओं या एपेन्डीमोग्लिया कोशिकाओं जैसे रेडियल ग्लिया के अस्तित्व के कारण मौजूद होते हैं। Ependymoglial कोशिकाओं निवासी वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के रूप में कार्य और दोनों बरकरार और regenerating मस्तिष्क3,5में नए न्यूरॉन्स की पीढ़ी के लिए जिम्मेदार हैं . वंश अनुरेखण प्रयोगों से पता चला है कि वेंट्रिकुलर ependymoglia चोट के लिए प्रतिक्रिया है, तो proliferate और नए neuroblasts कि घाव साइट5की ओर पलायन उत्पन्न करते हैं. कारण जेब्राफिश टेलिफेलॉन की उत्क्रमित प्रकृति के कारण, एपेन्डीमोग्लियल कोशिकाएं वेंट्रिकुलर सतह को लाइन करती हैं और वेंट्रिकल दीवार का निर्माण करती हैं। पृष् ठ वेंट्रिकुलर भित् ति एक पृष् ठ एपेन्डीमल कोशिका परत द्वारा बनाई जाती है (चित्र 1क) महत्वपूर्ण बात यह है कि जेब्राफ़िश एपेन्डीमोग्लिया दोनों स्तनधारी रेडियल ग्लिया और एपेन्डीमल कोशिकाओं की विशेषताओं का प्रतीक है। लंबी रेडियल प्रक्रमों में रेडियल ग्लिया कोशिकाओं की एक विशिष्ट विशेषता होती है, जबकि कोशिकीय विस्तार और तंग संधि (साथ ही उनके वेंट्रिकुलर स्थिति) एपेन्डीमल कोशिकाओं की विशिष्ट विशेषताएं हैं12,13,14. इसलिए, इन कोशिकाओं को ependymoglial कोशिकाओं के रूप में संदर्भित कर रहे हैं.
पुनर्जनन के दौरान एकल ependymoglial कोशिकाओं के विवो व्यवहार में पालन करने के लिए, वे मज़बूती से लेबल की जरूरत है. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए विवो सेल लेबलिंग के विभिन्न तरीकों का पहले वर्णन किया गया है, जैसे अंतर्जात पत्रकारों या लिपोफिलिकरंगों 15. इन विधियों, इलेक्ट्रोपोट्रेशन के विपरीत, समय की लंबी अवधि की आवश्यकता हो सकती है और अक्सर एकल सेल लेबलिंग या स्थायी दीर्घकालिक अनुरेखण की संभावना की पेशकश नहीं करते. इलेक्ट्रोपोरेशन, हालांकि (एकल सेल लेबलिंग के अलावा), मेजबान सेल में नए डीएनए शुरू करने की संभावना प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं में डी एन ए अंतरण के अन्य विधियों की तुलना में विद्युत-प्रचालकन को16,17,18,19के सर्वाधिक कुशल विधियों में से एक माना गया है ।
यहाँ प्रस्तुत एक इलेक्ट्रोपोरोनेशन प्रोटोकॉल है कि वयस्क ज़ेब्राफ़िश telencephalon में एकल ependymoglial कोशिकाओं लेबलिंग के उद्देश्य के लिए परिष्कृत किया गया है. इस प्रोटोकॉल एकल ependymoglial कोशिकाओं की लेबलिंग के लिए अनुमति देता है ताकि उन्हें एक लंबी अवधि20 पर पालन करने के लिए या एक सेल स्वायत्त तरीके से विशिष्ट रास्ते में हेरफेर करने के लिए21,22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>For coloring plasmid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>SignaGel, Parker laboratories INC.</td>
			<td>15-60</td>
			<td>Electrode Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>TetraTec APS 50, 10l-60l</td>
			<td></td>
			<td>Can be bought in the pet shops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX Tweezertrodes Electrodes</td>
			<td>Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0486</td>
			<td>1mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation device</td>
			<td>BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection device</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Wall Borosillicate Glass Capillary</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0766</td>
			<td>Model No: G100-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10056-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Joystick micromanipulator</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>MN - 151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Needle holder comes together with the injection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle pulling device</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>Model No: PC-10</td>
			<td>The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One International</td>
			<td>633161</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon

विद्युत-संश्लेषण एक संक्रमण विधि है जिसमें कोशिका झिल्ली में अस्थायी छिद्र बनाने और इसकी पारगम्यता बढ़ाने के लिए कोशिकाओं पर विद्युत क्षेत्र लागू किया जाता है, जिससे कोशिका में विभिन्न अणुओं को पेश किया जा सकता है। इस पेपर में, इलेक्ट्रोपोरोनेशन का उपयोग एपेन्डीमोग्लियल कोशिकाओं को प्लाज्मिड ्सवेश करने के लिए किया जाता है, जो वयस्क जेब्राफिश टेलीनसेफेलॉन के वेंट्रिकुलर क्षेत्र को लाइन करते हैं। इन कोशिकाओं का एक अंश स्टेम सेल गुणों से पता चलता है और ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क में नए न्यूरॉन्स उत्पन्न करता है; इसलिए, उनके व्यवहार का अध्ययन neurogenesis और पुनर्जनन में उनकी भूमिका निर्धारित करने के लिए आवश्यक है. इलेक्ट्रोपोरिओशन के माध्यम से प्लाज्मिड की शुरूआत एक एकल ependymoglial सेल की लंबी अवधि के लेबलिंग और ट्रैकिंग सक्षम बनाता है। इसके अलावा, इस तरह के क्रे recombinase या Cas9 के रूप में प्लाज्मिड एकल ependymoglial कोशिकाओं को दिया जा सकता है, जो जीन पुनर्संयोजन या जीन संपादन सक्षम बनाता है और एक नियंत्रित में सेल के स्वायत्त जीन समारोह का आकलन करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है, प्राकृतिक वातावरण. अंत में, यह विस्तृत, कदम दर कदम electroporation प्रोटोकॉल एकल ependymoglial कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में प्लाज्मिड के सफल परिचय प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

वर्णित इलेक्ट्रोपोरोनेशन विधि में प्लाज्मिड डीएनए की डिलीवरी की अनुमति देता है ependymoglial कोशिकाओं में, जो सतही रूप से ज़ेब्राफ़िश टेलीनेफेलॉन में स्थित हैं और सिर्फ पृष्ठीय ependymal कोशिका परत क?...

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Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

यहाँ प्रस्तुत प्लाज्मिड डीएनए वितरण और वयस्क ज़ेब्राफ़िश टेलीनसेफेलॉन में ependymoglial सेल लेबलिंग के लिए एक इलेक्ट्रोपोट्रेशन विधि है। इस प्रोटोकॉल कल्पना और व्यक्तिगत ependymoglial कोशिकाओं का पता लगाने और आनुवंशिक जोड़तोड़ की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इलेक्ट्रोपोट्रेशन लागू करने के लिए नई संभावनाओं को खोलता है करने के लिए एक त्वरित और कुशल तरीका है।

वयस्क ज़ेब्राफ़िश टेलीनसेफेलॉन में प्लास्मिड डीएनए के विवो डिलिवरी के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन विधि

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

यह प्रोटोकॉल जेब्राफिश टेलेंसेफेलन में व्यक्तिगत एपेंडीमोग्लियाल कोशिकाओं की लेबलिंग की अनुमति देता है ताकि उनकी दीर्घकालिक निगरानी के साथ-साथ सेल-स्वायत्त तरीके से विशिष्ट रास्तों में हेरफेर किया जा सके। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह तेजी से और कुशल तरीके से एकल सेल लेबलिंग की अनुमति देता है, साथ ही जीन संपादन और सेल-स्वायत्त तरीके से मार्ग हेरफेर संकेत देता है। यह विधि बुनियादी सेल जीव विज्ञान प्रश्नों की जांच की अनुमति देती है, उदाहरण के लिए, सेल डेलामिनेशन, एपिथेलियल होमोस्टेसिस के रखरखाव और सेल डिवीजन की समरूपता के बारे में।कांच के केशिकाओं को तैयार करने के लिए सुई खींचने वाले उपकरण का उपयोग करके शुरू करें। प्लाज्मिड समाधान के दस माइक्रोलीटर के साथ एक तैयार ग्लास केशिका को भरने के लिए माइक्रोलोडर युक्तियों का उपयोग करें। फिर सुई को सुई धारक में लोड करने की अनुमति देने के लिए इंजेक्शन डिवाइस पर मेनू परिवर्तन केशिका को दबाएं।फिर इंजेक्शन डिवाइस को चेंज केशिका से इंजेक्ट मोड में स्विच करें। फिर, चार बार आवर्धन के साथ एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके, और फाइंडन संदंश, केवल केशिका की नोक काटें। फिर पैर पेडल पर दबाव लागू करने की पुष्टि करने के लिए कि प्लाज्मिड समाधान आसानी से सुई से बाहर चलाता है बिना बाधा के।जब सुई तैयार हो जाए, तो पशुपालन टैंक से एक जेब्राफिश को एनेस्थेटिक समाधान के कंटेनर में स्थानांतरित करें। और कुछ मिनट इंतजार जब तक गहरे नाले के आंदोलन कम हो जाती है । बेहोश मछली पृष्ठीय पक्ष को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे एक पूर्व-गीला स्पंज पर दबाएं, और ऑप्टिक टेक्ट्रम की सीमा के ठीक बगल में टेलेंसेफलन के पीछे मछली खोपड़ी में एक छोटा छेद बनाने के लिए 40 मिलीमीटर अत्याधुनिक और 0.5 मिलीमीटर मोटाई के साथ एक स्टेनलेस स्टील विच्छेदन माइक्रोनाइफ का उपयोग करें।मछली को आवश्यक के रूप में झुकाएं और छेद के माध्यम से केशिका टिप के प्रवेश को सुविधाजनक बनाने के लिए सही कोण में खोपड़ी की ओर कांच के केशिका की नोक को उन्मुख करें। फिर, बहुत सावधानी से पृष्ठीय एपेंडिमल सेल परत के माध्यम से छेद में केशिका की नोक डालें, जब तक कि यह टेलेंसेफेलिक वेंट्रिकल तक न पहुंच जाए, और प्लाज्मिड समाधान के लगभग 1 माइक्रोलीटर देने के लिए लगभग 10 सेकंड तक पैर के पेडल पर दबाव लागू न करें। पूरे वेंट्रिकल में हरे रंग के तरल के प्रसार को देख कर डिलीवरी की सफलता की पुष्टि की जा सकती है।मछली टेलेंसेफेलन को थोड़ी मात्रा में अल्ट्रासाउंड जेल से ढक दें। प्लाज्मिड इंजेक्शन जानवर के इलेक्ट्रोपॉनेशन के लिए, इंजेक्शन सेट-अप से स्पंज को हटा दें और इलेक्ट्रोटिप्स के भीतरी हिस्से को अल्ट्रासाउंड जेल में विसर्जित कर दें। इलेक्ट्रोड के बीच मछली सिर की स्थिति, सिर के वेंट्रल साइड में सकारात्मक इलेक्ट्रोड और पृष्ठीय पक्ष पर नकारात्मक इलेक्ट्रोड के साथ।फिर, जबकि अभी भी स्पंज में मछली के शरीर पकड़, इलेक्ट्रोड धीरे और ठीक telencephalon के खिलाफ प्रेस और पैर पेडल के साथ वर्तमान प्रशासन, जगह में इलेक्ट्रोड पकड़े जब तक सभी पांच दालों समाप्त हो रहे हैं । यदि इलेक्ट्रोपॉन्रेशन सफल होता है, तो प्लाज्मिड लेबल वाली एकल एपेंडीमोग्लियाल कोशिकाओं को गैर-प्लाज्मिड लेबल वाले एपेंडीमोग्लियाल कोशिकाओं के बीच देखा जा सकता है। इलेक्ट्रोपाउनेशन प्रक्रिया की दक्षता के आधार पर, एपेंडीमोग्लियाल कोशिकाओं की एक उच्च या कम संख्या लेबल की जा सकती है।फिर भी, प्रदर्शन प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल की तुलना में लेबल कोशिकाओं की एक उच्च संख्या पैदावार । ध्यान दें कि लेबल की कोशिकाओं का उच्चतम घनत्व ज्यादातर दोनों गोलार्द्धों के आंतरिक वेंट्रिकुलर पक्ष में उभरने की आदत है जिस तरह से इंजेक्शन प्लाज्मिड तरल गोलार्द्धों के बीच वितरित करता है। इस वीडियो में, जेब्राफिश टेलेंसेफलन का एक गोलार्द्ध 3 डी में प्रस्तुत किया गया है, जहां रेडियो-प्रक्रियाओं के साथ एपेंडीमोग्लियाल कोशिकाएं, साइड से देखे जाने पर मजेंटा में होती हैं।एक अन्य प्लाज्मिड के साथ सह-इलेक्ट्रोपंट्रेशन के माध्यम से जो नाभिक को लेबल करता है, ईपेंडीमोग्लियाल कोशिकाओं का कोशिका विभाजन देखा जा सकता है। असफल इलेक्ट्रोपॉलपेशन के परिणामस्वरूप बहुत कम संख्या या कोई लेबल ईपेंडीमोग्लियाल कोशिकाएं नहीं होती हैं। हालांकि, पृष्ठीय एपेंडिमल कोशिकाओं को लेबल किए जाने की सबसे अधिक संभावना है।उनका सोमा क्यूबाइड में बड़ा है और उनके पास रेडियो-लम्बी प्रक्रियाएं नहीं हैं जो एपेंडीमोग्लियल सेल परत के एक तरफ के दृश्य से स्पष्ट हैं। टीडीटोमाटो-मेम लेबल कोशिकाएं सबसे अधिक संभावना एपेंडिमल कोशिकाएं होती हैं, जो एपेंडीमोग्लिया की परत के ऊपर स्थित होती हैं। इसके विपरीत, एक टीडीटोमाटो-मेम की शुरूआत, जो व्यक्तिगत ईपेंडमायोग्लियाल कोशिकाओं को प्लाज्मिड व्यक्त करती है, प्रारंभिक सेल लेबलिंग के अलावा टीडीटोमाटो-मेम अभिव्यक्ति में परिणाम देती है।याद रखने के लिए सबसे महत्वपूर्ण चीजें केवल केशिका की नोक को काटना और इंजेक्शन लगाते समय एपेंडिमल परत को भेदना है ताकि तरल पूरे वेंट्रिकल में फैल जाए। यह तकनीक वीवो इमेजिंग के माध्यम से एकल ependymoglial कोशिकाओं की दीर्घकालिक निगरानी में सक्षम बनाता है, और इसलिए मस्तिष्क उत्थान में उनकी भूमिका के साथ-साथ वीवो आनुवंशिक लिंक में उनके विशाल की स्थापना करता है।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Gentamicin प्रेरित चोट से वयस्क zebrafish में किडनी पुनर्जनन

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

इवांस नीले रंग की डाई के साथ zebrafish लार्वा कंकाल की मांसपेशी वफ़ादारी का विश्लेषण

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

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चिकन श्रवण अंग में जीन स्थानांतरण द्वारा<em&gt; Ovo में</em&gt; माइक्रो-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

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Chimeric zebrafish भ्रूण में अलग-अलग रेटिना प्रोजेनिटर्स में ट्रांसजेनिक जीन एक्सप्रेशन के vivo इमेजिंग में सेल Nonautonomous प्रभावों का अध्ययन करने के लिए

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

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चिकन श्रवण ब्रेनस्टम में ओवो इलेक्ट्रोप्लोरेशन में

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

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वयस्क Drosophila melanogaster दिमाग में मशरूम शरीर और Photoreceptor न्यूरॉन्स के विच्छेदन और Immunofluorescent धुंधला

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

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RNAi और हीट शॉक-प्रेरित प्रतिलेखन कारक अभिव्यक्ति के आवेदन के लिए सी. एलिगेंस में न्यूरॉन्स के लिए रोगाणु कोशिकाओं reprogram

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

वयस्क Zebrafish दिल में Nanoparticle-मध्यस्थता सिरना जीन-मुंह बंद करने

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Gastrulating माउस में नोड और Notochordal प्लेट visualizing इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग कर भ्रूण

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

वयस्क Zebrafish चोट मॉडल Prednisolone के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अस्थि ऊतक पुनः उत्पन्न करने में

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...