Name: electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon
Uploaded: 2019-09-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon at JoVE.com

Un ringraziamento speciale a James Copti per la modifica del manoscritto. Ringraziamo anche i finanziamenti a JN della Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) da parte dell'SFB 870 e dell'SPP "Integrative Analysis of Olfaction" e SPP 1738 "Ruoli emergenti di RNA non codificanti nello sviluppo di sistemi nervosi, plasticità e malattie", SPP1757 " L'eterogeneità gliale", e la strategia di eccellenza nell'ambito del Cluster di Monaco per la Neurologia dei Sistemi (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).

Tutti gli animali utilizzati in questo protocollo sono stati tenuti in condizioni di allevamento standard, e gli esperimenti sono stati effettuati secondo le linee guida e i regolamenti di gestione dell'UE e del governo della Baviera superiore (Az 55.2-1-54-2532-0916).
1. Preparazione della miscela di plasmide per l'elettroporazione
<ol><li>Diluire il plasmide di interesse per l'acqua sterile e aggiungere veloce soluzione di scorta di macchie verdi [1 mg/mL]. Assicurarsi che la concentrazion...

<ol>
	<li>Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain.">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).</li><li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon:+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis.">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60 (3), 343-357 (2012).</li><li>Barbosa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain.">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 346 (6236), 789-793 (2015).</li><li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury.">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).</li><li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li><li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li><li>Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon.">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> Journal of Neurotrauma. , (2010).</li><li>Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+brain+injury+in+adult+zebrafish+stimulates+neurogenesis+and+long-distance+neuronal+integration.">Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration.</a> Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).</li><li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult.">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Development. 8 (3), (2013).</li><li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates.">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li><li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).</li><li>Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glia+and+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+central+nervous+system.">Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system.</a> Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).</li><li>Lyons, D. A., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+development+and+function+in+zebrafish.">Glial cell development and function in zebrafish.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).</li><li>Obermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Surface+Proteome+of+Adult+Neural+Stem+Cells+in+Zebrafish+Unveils+Long-Range+Cell-Cell+Connections+and+Age-Related+Changes+in+Responsiveness+to+IGF.">The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Kusumanto, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+in+vivo+transfer+of+plasmid+DNA+in+muscle:+comparison+of+electroporation+versus+ultrasound.">Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound.</a> Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).</li><li>Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gene+transfer+into+the+adult+zebrafish+brain+by+herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+electroporation:+methods+and+optogenetic+applications.">Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).</li><li>Van Tendeloo, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells:+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells.">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98 (1), 49-56 (2001).</li><li>Mars, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotransfection+and+lipofection+show+comparable+efficiency+for+in+vitro+gene+delivery+of+primary+human+myoblasts.">Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts.</a> The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).</li><li>Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+in+vivo+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+the+zebrafish+telencephalon.">Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon.</a> Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).</li><li>Di Giaimo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aryl+Hydrocarbon+Receptor+Pathway+Defines+the+Time+Frame+for+Restorative+Neurogenesis.">The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis.</a> Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).</li><li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+generation+of+customizable+gRNA+vectors+for+multiplex+CRISPR+approaches+through+string+assembly+gRNA+cloning+(STAgR).">One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR).</a> PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).</li><li>Barbosa, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , (2014).</li><li>Kelsh, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+pigmentation+mutations+and+the+processes+of+neural+crest+development.">Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development.</a> Development. 123, 369-389 (1996).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry.">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).</li><li>Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+formation+with+plasmid+DNA+increases+the+cytotoxicity+of+cationic+liposomes.">Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).</li><li>Chapouton, P., Godinho, L., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. 100, (2010).</li><li>Zhu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System.">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).</li></ol>

Questo protocollo di elettroporazione è un metodo affidabile in vivo per etichettare le singole cellule ependymoglial. Il protocollo potrebbe essere necessario un ulteriore adattamento per etichettare altri tipi di cellule come neuroni o oligodendrociti. Per ottenere un'etichettatura di successo, è possibile utilizzare plasmidi contenenti diversi promotori. Pollo-beta actin promotore, eF1alpha, CMV e promotore di ubiquitina sono stati precedentemente utilizzati per guidare l'espressione di diversi transgeni in ependymo...

I pesci zebra sono eccellenti modelli animali per esaminare la rigenerazione cerebrale dopo una lesione da taglio. Rispetto ai mammiferi, sulla scala evolutiva, le specie meno evolute come il pesce zebra mostrano generalmente tassi più elevati di neurogenesi costitutiva e aree più ampie di residenza delle cellule staminali neurali adulte, portando a una generazione costante di nuovi neuroni in tutto la maggior parte delle aree cerebrali nella vita adulta. Questa caratteristica sembra correlare con una capacità rigenerativa significativamente più elevata del pesce zebra rispetto ai mammiferi1, poiché i pesci zebra hanno un notevole potenziale per generare in modo efficiente nuovi neuroni nella maggior parte dei modelli di lesioni cerebrali studiati2, 3,4,5,6,7,8. Qui, il telecefalo del pesce zebra è studiato, poiché è una zona del cervello con neurogenesi prominente in età adulta. Queste zone di neurogenesi adulta sono omologhe alle zone neurogeniche nel cervello dei mammiferi adulti9,10,11.
Abbondanti aree neurogeniche nel telencephalon del pesce zebra sono presenti a causa dell'esistenza di glia radiali come cellule o cellule ependymoglia. Le cellule ependymogliali agiscono come cellule staminali neurali adulte residenti e sono responsabili della generazione di nuovi neuroni sia nel cervello intatto che in quello rigenerante3,5. Esperimenti di tracciamento del lignaggio hanno dimostrato che l'ependymoglia ventricolare reagisce alle lesioni, quindi prolifera e genera nuovi neuroblasti che migrano al sito di lesione5. A causa della natura eversadela del telecefalo del pesce zebra, le cellule ependymogliali allineano la superficie ventricolare e costruiscono la parete ventricolare ventrale. La parete ventricolare dorsale è formata da uno strato di cellule ependymal dorsale (Figura 1A). È importante sottolineare che il pesce zebra ependymoglia incarna le caratteristiche della glia radiale dei mammiferi e delle cellule ependymal. I lunghi processi radiali sono una caratteristica tipica delle celle radiali glia, mentre le estensioni cellulari e le giunzioni strette (così come le loro posizioni ventricolari) sono caratteristiche tipiche delle cellule ependymal12,13,14. Pertanto, queste cellule sono indicate come cellule ependymoglial.
Per seguire il comportamento in vivo delle singole cellule ependymoglial durante la rigenerazione, devono essere etichettate in modo affidabile. Sono stati descritti in precedenza vari metodi di etichettatura cellulare in vivo per la microscopia fluorescente, come i giornalisti endogeni o i coloranti lipofili15. Questi metodi, a differenza dell'elettroporazione, possono richiedere periodi di tempo più lunghi e spesso non offrono la possibilità di etichettatura a cella singola o di tracciamento permanente a lungo termine. L'elettroporazione, tuttavia (oltre all'etichettatura a singola cellula), offre la possibilità di introdurre nuovo DNA nella cellula ospite. Inoltre, rispetto ad altri metodi di trasferimento del DNA nelle cellule, l'elettroporazione è stata dimostrata essere uno dei metodi più efficienti16,17,18,19.
Presentato qui è un protocollo di elettroporazione che è stato perfezionato allo scopo di etichettare singole cellule ependymoglial nel telecefalo di zebra per adulti. Questo protocollo consente l'etichettatura di singole cellule ependymoglial per seguirle per un periodo20 a lungo termine o per manipolare percorsi specifici in modo cellulare-autonomo21,22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>For coloring plasmid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>SignaGel, Parker laboratories INC.</td>
			<td>15-60</td>
			<td>Electrode Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>TetraTec APS 50, 10l-60l</td>
			<td></td>
			<td>Can be bought in the pet shops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX Tweezertrodes Electrodes</td>
			<td>Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0486</td>
			<td>1mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation device</td>
			<td>BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection device</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Wall Borosillicate Glass Capillary</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0766</td>
			<td>Model No: G100-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10056-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Joystick micromanipulator</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>MN - 151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Needle holder comes together with the injection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle pulling device</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>Model No: PC-10</td>
			<td>The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One International</td>
			<td>633161</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon

L'elettroporazione è un metodo di trasfezione in cui un campo elettrico viene applicato alle cellule per creare pori temporanei in una membrana cellulare e aumentarne la permeabilità, consentendo così l'introduzione di diverse molecole nella cellula. In questo documento, l'elettroporazione viene utilizzata per introdurre il plasmidia alle cellule ependymoglial, che allineano la zona ventricolare del telencephalon del pesce zebra adulto. Una frazione di queste cellule mostra le proprietà delle cellule staminali e genera nuovi neuroni nel cervello del pesce zebra; Pertanto, studiare il loro comportamento è essenziale per determinare i loro ruoli nella neurogenesi e rigenerazione. L'introduzione di plasmidi tramite elettroporazione consente l'etichettatura e il tracciamento a lungo termine di una singola cellula ependymoglial. Inoltre, plasmidi come Cre ricombinase o Cas9 possono essere consegnati a singole cellule ependymoglial, il che consente la ricombinazione genica o l'editing genico e fornisce un'opportunità unica per valutare la funzione genica autonoma della cellula in un l'ambiente. Infine, questo protocollo dettagliato di elettroporazione passo-passo viene utilizzato per ottenere l'introduzione di successo di plasmidi in un gran numero di singole cellule ependymoglial.

Il metodo di elettroporazione descritto consente la consegna di DNA plasmide in cellule ependymogliali, che si trovano superficialmente nel telecefalo del pesce zebra e appena sotto lo strato cellulare ependymal dorsale (Figura 1A).
Se il risultato dell'elettroporazione è positivo, è possibile osservare le singole celle ependymoglial (cellule rosse nella figura 2A,B) tra le altre ...

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Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Presentato qui è un metodo di elettroporazione per la consegna di DNA plasmide e l'etichettatura delle cellule ependymoglial nel telecefalo di pesce zebra adulto. Questo protocollo è un metodo rapido ed efficiente per visualizzare e tracciare singole cellule ependymoglial e apre nuove possibilità di applicare l'elettroporazione a un'ampia gamma di manipolazioni genetiche.

Metodo di elettroporazione per in vivo Consegna del DNA plasmide nel Telencephalon del pesce zebra adulto

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

Questo protocollo consente l'etichettatura delle singole cellule ependimogliali nel telencefalo zebrafish per consentire il loro monitoraggio a lungo termine, nonché la manipolazione di percorsi specifici in modo autonomo dalle cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'etichettatura a singola cellula in modo rapido ed efficiente, così come l'editing genico e la manipolazione del percorso di segnalazione in modo autonomo alle cellule. Questo metodo consente lo studio delle domande di biologia cellulare di base, ad esempio, sulla delaminazione cellulare, sul mantenimento dell'omeostasi epiteliale e sulla simmetria della divisione cellulare.Iniziare utilizzando un apparato di trazione dell'ago per preparare capillari di vetro. Utilizzare le punte del microloader per riempire un capillare di vetro preparato con dieci microlitri di soluzione plasmide. Quindi premere il menu cambia capillare"sul dispositivo di iniezione per consentire il caricamento dell'ago nel supporto dell'ago.Quindi passare dal dispositivo di iniezione dal cambio capillare alla modalità di iniezione. Quindi, usando uno stereomicroscopio con un ingrandimento quattro volte superiore e le forcep Finden, tagliano solo la punta del capillare. Quindi applicare pressione sul pedale del piede per confermare che le soluzioni plasmide escono facilmente dall'ago senza impedimenti.Quando l'ago è pronto, trasferire un zebrafish dal serbatoio di allevamento a un contenitore di soluzione anestetica. E attendere qualche minuto fino a quando il movimento delle branchie si attenua. Premere il lato dorsale del pesce sedato su una spugna pre-bagnata sotto lo stereomicroscopio, e utilizzare un microknife sezionante in acciaio inossidabile con un tagliente di 40 millimetri e uno spessore di 0,5 millimetri per creare con cura un piccolo foro nel cranio del pesce sul lato posteriore del telencefalo, proprio accanto al bordo del tectum ottico.Inclinare il pesce se necessario e orientare la punta del capillare di vetro verso il cranio nell'angolo corretto per facilitare la penetrazione della punta capillare attraverso il foro. Quindi, inserire con molta attenzione la punta del capillare nel foro attraverso lo strato cellulare ependimale dorsale, fino a raggiungere il ventricolo telencefalico, e applicare pressione sul pedale per circa 10 secondi per fornire circa 1 microlitro della soluzione plasmide. Il successo della consegna può essere confermato osservando la diffusione del liquido verde in tutto il ventricolo.Coprire il telencefalo di pesce con una piccola quantità di gel ad ultrasuoni. Per l'elettroporazione dell'animale plasmide iniettato, rimuovere la spugna dall'insieme di iniezione e immergere il lato interno degli elettrotipi nel gel ad ultrasuoni. Posizionare la testa del pesce tra gli elettrodi, con l'elettrodo positivo sul lato ventrale della testa e l'elettrodo negativo sul lato dorsale.Quindi, pur tenendo ancora il corpo del pesce nella spugna, premere gli elettrodi delicatamente e precisamente contro il telencefalo e somministrare la corrente con il pedale del piede, tenendo gli elettrodi in posizione fino al termine di tutti e cinque gli impulsi. Se l'elettroporazione ha successo, le singole cellule ependimogliali etichettate con plasmide possono essere osservate tra le cellule ependimogliali etichettate non plasmide. A seconda dell'efficienza del processo di elettroporazione, può essere etichettato un numero maggiore o inferiore di cellule ependimogliali.Tuttavia, il protocollo dimostrato produce un numero maggiore di celle etichettate rispetto ai protocolli pubblicati in precedenza. Si noti che la più alta densità di cellule etichettate tende ad emergere principalmente sul lato ventricolare interno di entrambi gli emisferi a causa del modo in cui il liquido plasmide iniettato distribuisce tra gli emisferi. In questo video, un emisfero del telencefalo zebrafish è presentato in 3D, dove le cellule ependimogliali con processi radio, sono in magenta quando osservate di lato.Attraverso la co-elettroporazione con un altro plasmide che etichetta i nuclei, si può osservare la divisione cellulare delle cellule ependimogliali. L'elettroporazione non riuscita si traduce in un numero molto basso o in nessuna cella ependimogliale etichettata. Le cellule ependimali dorsali, tuttavia, hanno maggiori probabilità di essere etichettate.Il loro soma è più grande in cuboide e non possiedono processi radio-allungati come evidente da una vista laterale dello strato cellulare ependimogliale. le cellule etichettate tdTomato-mem sono molto probabilmente cellule ependimali, che si trovano sopra lo strato di ependimoglia. Al contrario, l'introduzione di un tdTomato-mem che esprime plasmide alle singole cellule ependmiogliali si traduce in espressione tdTomato-mem oltre all'etichettatura iniziale delle cellule.Le cose più importanti da ricordare sono tagliare solo la punta del capillare e penetrare nello strato ependimale durante l'iniezione in modo che il liquido si diffonda in tutto il ventricolo. Questa tecnica consente il monitoraggio a lungo termine di singole cellule ependimogliali attraverso l'imaging in vivo, e quindi stabilendo il loro ruolo nella rigenerazione cerebrale e il loro vasto legame genetico in vivo.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Rene Rigenerazione in Zebrafish adulti da Gentamicina Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer nel pollo Auditory Organ<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-elettroporazione

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Imaging in vivo del transgenico espressione genica nei singoli retinica Progenitori in embrioni di zebrafish Chimerico da Cell studio Influenze non autonomo

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation nel Brainstem Auditory del pollo

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Applicazione di RNAi ed espressione di fattore di trascrizione indotta da calore-shock per riprogrammare le cellule germinali ai neuroni in c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Nanoparticelle-mediata siRNA silenziamento genico nel cuore di Zebrafish adulto

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizzare il nodo e la piastra Notochordal In embrioni di topo Gastrulating mediante microscopia elettronica a scansione e intero Monte immunofluorescenza

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Modelli di lesione di Zebrafish adulto per studiare gli effetti del Prednisolone nella rigenerazione di tessuto osseo

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...