Name: electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon
Uploaded: 2019-09-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon at JoVE.com

원고의 편집제임스 콥티에 특별한 감사. 우리는 또한 SFB 870및 SPP "Olfaction의 통합 분석"과 SPP 1738 "신경계 발달, 가소성 및 질병에서 비 코딩 RNA의 새로운 역할", SPP1757에 의해 독일 연구 재단 (DFG)에서 JN에 자금을 감사하게 인정합니다. " Glial 이질성", 시스템 신경학에 대한 뮌헨 클러스터의 프레임 워크 내에서 우수 전략 (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).

이 프로토콜에 사용된 모든 동물은 표준 축산 조건하에서 보관되었으며, EU 및 상부 바이에른 정부의 취급 지침 및 규정에 따라 실험이 수행되었습니다(AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. 전기 포공용 플라스미드 혼합물 의 준비
<ol><li>멸균수에 관심 있는 플라스미드를 희석하고 빠른 녹색 얼룩 스톡 용액 [1 mg/mL]을 추가합니다. 플라스미드의 최종 농도가 1 μg/μL인지 확인하십시오.</li>
	<li...

<ol>
	<li>Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain.">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).</li><li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon:+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis.">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60 (3), 343-357 (2012).</li><li>Barbosa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain.">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 346 (6236), 789-793 (2015).</li><li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury.">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).</li><li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li><li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li><li>Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon.">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> Journal of Neurotrauma. , (2010).</li><li>Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+brain+injury+in+adult+zebrafish+stimulates+neurogenesis+and+long-distance+neuronal+integration.">Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration.</a> Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).</li><li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult.">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Development. 8 (3), (2013).</li><li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates.">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li><li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).</li><li>Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glia+and+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+central+nervous+system.">Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system.</a> Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).</li><li>Lyons, D. A., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+development+and+function+in+zebrafish.">Glial cell development and function in zebrafish.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).</li><li>Obermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Surface+Proteome+of+Adult+Neural+Stem+Cells+in+Zebrafish+Unveils+Long-Range+Cell-Cell+Connections+and+Age-Related+Changes+in+Responsiveness+to+IGF.">The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Kusumanto, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+in+vivo+transfer+of+plasmid+DNA+in+muscle:+comparison+of+electroporation+versus+ultrasound.">Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound.</a> Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).</li><li>Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gene+transfer+into+the+adult+zebrafish+brain+by+herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+electroporation:+methods+and+optogenetic+applications.">Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).</li><li>Van Tendeloo, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells:+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells.">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98 (1), 49-56 (2001).</li><li>Mars, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotransfection+and+lipofection+show+comparable+efficiency+for+in+vitro+gene+delivery+of+primary+human+myoblasts.">Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts.</a> The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).</li><li>Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+in+vivo+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+the+zebrafish+telencephalon.">Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon.</a> Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).</li><li>Di Giaimo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aryl+Hydrocarbon+Receptor+Pathway+Defines+the+Time+Frame+for+Restorative+Neurogenesis.">The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis.</a> Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).</li><li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+generation+of+customizable+gRNA+vectors+for+multiplex+CRISPR+approaches+through+string+assembly+gRNA+cloning+(STAgR).">One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR).</a> PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).</li><li>Barbosa, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , (2014).</li><li>Kelsh, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+pigmentation+mutations+and+the+processes+of+neural+crest+development.">Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development.</a> Development. 123, 369-389 (1996).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry.">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).</li><li>Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+formation+with+plasmid+DNA+increases+the+cytotoxicity+of+cationic+liposomes.">Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).</li><li>Chapouton, P., Godinho, L., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. 100, (2010).</li><li>Zhu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System.">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).</li></ol>

이러한 전기 개공 프로토콜은 개별 에펜디모글리아 세포를 라벨링하는 신뢰할 수 있는 생체 내 방법이다. 프로토콜은 뉴런 또는 올리고엔드로시트와 같은 다른 세포 유형에 라벨을 붙이기 위해 추가적인 적응이 필요할 수 있다. 성공적인 라벨링을 달성하기 위해, 다른 프로모터를 함유하는 플라스미드를 사용할 수 있다. 치킨 베타 액틴 프로모터, eF1alpha, CMV 및 유비퀴틴 프로모터는 이전에 에펜?...

Zebrafish는 찔린 상처 부상 후 뇌 재생을 검사하는 우수한 동물 모델입니다. 포유류에 비해, 진화 사다리에, 제브라피시와 같은 덜 진화 된 종은 일반적으로 구성 신경 발생의 높은 비율을 보여주고 성인 신경 줄기 세포 거주의 넓은 영역, 전반에 걸쳐 새로운 뉴런의 일정한 생성으로 이어지는 성인 생활에서 대부분의 뇌 영역. 이 기능은 포유류 1에 비해 제브라피시의 상당히 높은 재생 능력과 상관 관계가 나타납니다1,제브라피쉬는 효율적으로 연구대부분의뇌 손상 모델에서 새로운 뉴런을 생성하는 놀라운 잠재력을 가지고2, 3,4,5,6,7,8. 여기에서, 얼룩말 말살론은 성인기에 있는 눈에 띄는 신경 발생을 가진 두뇌 지역이기 때문에, 공부됩니다. 이러한 성인 신경발생 영역은 성인 포유류뇌의신경발생 영역과 상동성이며9,10,11.
얼룩말기 말뇌에 풍부한 신경 영역은 세포 또는 ependymoglia 세포 같이 방사형 신경교의 존재 때문에 존재합니다. Ependymoglial 세포는 상주 성체 신경 줄기 세포역할을 하며 뇌의 손상및 재생 모두에서 새로운 뉴런의 생성을 담당하고 있으며3,5. 계보 추적 실험은 심실 ependymoglia가 상해에 반응한다는 것을 보여주었습니다, 그 때 증식하고 병변사이트5로이동하는 새로운 neuroblasts를 생성합니다. zebrafish 말뇌파의 적중특성으로 인해, ependymoglial 세포는 심실 표면을 일렬로 세우고 심실 벽을 건설합니다. 등쪽 심실 벽은 등쪽 에펜디멀 세포층에 의해 형성된다(도1A). 중요한 것은, 제브라피쉬 ependymoglia는 포유류 방사형 글리아 및 형형 세포 둘 다의 특성을 구현합니다. 긴 방사형 과정은 방사형 신경교 세포의 전형적인 특징이며, 반면 세포 확장 및 단단한 접합부 (뿐만 아니라 심실 위치)는 ependymal 세포12,13,14의전형적인 특징이다. 따라서, 이들 세포는 에펜디모글리아 세포라고 한다.
재생 중에 단일 ependymoglial 세포의 생체 내 거동을 따르려면, 그들은 안정적으로 표지 될 필요가있다. 형광 현미경 검사법에 대한 생체 내 세포 표지의 다양한 방법은 내인성 리포터 또는 친유성염료(15)와같은 이전에 기술되어 왔다. 이러한 방법은 전기 천공과는 달리 더 오랜 시간이 필요할 수 있으며 종종 단일 세포 라벨링 또는 영구 장기 추적의 가능성을 제공하지 않습니다. 전기 천공은, 그러나 (단 하나 세포 표지 이외에) 호스트 세포로 새로운 DNA를 소개의 가능성을 제안합니다. 더욱이, 세포 내로의 DNA 전달의 다른 방법에 비해, 전기천공은16,17,18,19중가장 효율적인 방법 중 하나인 것으로 입증되었다.
여기서 제시된 것은 성체 얼룩말기 말뇌골론에서 단일 에펜디모글리아 세포에 라벨을 붙이기 위한 목적으로 정제된 전기 개루 프로토콜이다. 이 프로토콜은 장기간20에 걸쳐 이를 따르거나 세포 자율 방식으로 특정 경로를 조작하기 위해 단일 ependymoglial 세포의 라벨링을허용한다 21,22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>For coloring plasmid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>SignaGel, Parker laboratories INC.</td>
			<td>15-60</td>
			<td>Electrode Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>TetraTec APS 50, 10l-60l</td>
			<td></td>
			<td>Can be bought in the pet shops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX Tweezertrodes Electrodes</td>
			<td>Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0486</td>
			<td>1mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation device</td>
			<td>BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection device</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Wall Borosillicate Glass Capillary</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0766</td>
			<td>Model No: G100-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10056-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Joystick micromanipulator</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>MN - 151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Needle holder comes together with the injection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle pulling device</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>Model No: PC-10</td>
			<td>The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One International</td>
			<td>633161</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon

전기 개출은 세포막에 일시적인 기공을 생성하고 투과성을 증가시켜 다른 분자가 세포에 도입 될 수 있도록 하는 형질전환 방법입니다. 이 논문에서, 전기 천공은 성인 얼룩말 말살기의 심실 영역을 일렬로 세워 ependymoglial 세포에 플라스미드를 소개하는 데 사용됩니다. 이들 세포의 일부분은 줄기 세포 특성을 보여주고 제브라피시 뇌에서 새로운 뉴런을 생성한다. 그러므로, 그들의 행동을 공부하는 것은 신경 발생과 재생에 있는 그들의 역할을 결정하기 위하여 필수적입니다. 전기 개공을 통해 플라스미드를 도입하면 단일 에펜디모글리아 셀의 장기 라벨링 및 추적이 가능합니다. 또한 Cre recombinase 또는 Cas9와 같은 플라스미드는 단일 ependymoglial 세포로 전달될 수 있어 유전자 재조합 또는 유전자 편집을 가능하게 하고 제어된 천연 에서 세포의 자율 적인 유전자 기능을 평가할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 환경. 마지막으로, 이 상세한, 단계별 전기 천공 프로토콜은 다수의 단일 ependymoglial 세포에 플라스미드의 성공적인 도입을 얻기 위해 사용된다.

기재된 전기천공 방법은 플라스미드 DNA를 에펜디모글리아 세포내로 전달할 수 있으며, 이는 얼룩말 말살기 및 등쪽 에펜디알 세포층 바로 아래에 표면적으로 위치한다(도1A).
전기 천공의 결과가 양성인 경우, 표지된 단일 에펜디모글리아 세포(도 2A, B의적혈구)는 다른 에펜디모글리아 세포 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon at JoVE.com

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

여기서 제시된 것은 성체 제브라피쉬 텔렌세팔론에서 플라스미드 DNA 전달 및 에펜디모글리아 세포 라벨링을 위한 전기개공 방법이다. 이 프로토콜은 개별 ependymoglial 세포를 구상하고 추적하는 빠르고 효율적인 방법이며 광범위한 유전 조작에 전기 증시인을 적용할 수있는 새로운 가능성을 열어줍니다.

성체 얼룩말 기피 텔렌세팔론에서 플라스미드 DNA의 생체 내 전달을 위한 전기 개공 방법

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

이 프로토콜은 그들의 장기 적인 감시를 가능하게 하는 zebrafish telencephalon에 있는 개별 ependymoglial 세포의 표시를 허용합니다, 세포 자율적인 방식으로 특정 통로의 조작. 이 기술의 주요 장점은 세포 자율 방식으로 유전자 편집 및 신호 경로 조작뿐만 아니라 빠르고 효율적인 방법으로 단일 세포 라벨링을 허용한다는 것입니다. 이 방법은 기본적인 세포 생물학 질문, 예를 들어 세포 절제, 상피 항상성의 유지 및 세포 분열의 대칭에 관하여 조사를 허용합니다.먼저 바늘 을 당기는 장치를 사용하여 유리 모세 혈관을 준비하십시오. 마이크로 로더 팁을 사용하여 제조 된 유리 모세관을 플라스미드 용액 10 마이크로 리터로 채웁니다. 그런 다음 메뉴 변경 모세관"주사 장치에 바늘을 바늘 홀더에로드 할 수 있도록.그런 다음 주입 장치를 변경 모세관에서 주입 모드로 전환합니다. 그런 다음, 4배 배율의 스테레오현미경을 사용하고, 포셉을 찾아모세관의 끝만 자른다. 그런 다음 발 페달에 압력을 가하여 플라스미드 용액이 방해없이 바늘에서 쉽게 실행되는지 확인합니다.바늘이 준비되면 축산 탱크에서 제브라피시를 마취 용액용기로 옮기습니다. 아가미의 움직임이 가라앉을 때까지 몇 분 간 기다립니다. 스테레오 현미경 아래 미리 젖은 스폰지에 진정 된 물고기 등쪽을 누르고, 조심스럽게 석양 텍소의 경계 옆에, 텔렌스 팔론의 후면 측에서 물고기 두개골에 작은 구멍을 만들 수있는 40 밀리미터 절삭 가장자리와 0.5 밀리미터 두께와 스테인레스 스틸 해부 마이크로 나이프를 사용합니다.필요에 따라 물고기를 기울이고 유리 모세관의 끝을 올바른 각도로 두개골쪽으로 방향을 지정하여 구멍을 통해 모세관 팁의 침투를 용이하게합니다. 이어서, 매우 신중하게 등대 연골 세포 층을 통해 구멍에 모세관의 끝을 삽입하고, 텔렌세팔리 심실에 도달 할 때까지, 약 10 초 동안 발 페달에 압력을 적용하여 플라스미드 용액의 약 1 마이크로 리터를 전달합니다. 전달의 성공은 심실 전체에 녹색 액체의 확산을 관찰함으로써 확인할 수 있습니다.소량의 초음파 젤로 생선 텔뇌스팔론을 덮습니다. 플라스미드 주입 동물의 전기 포이팅을 위해 주사 설정에서 스폰지를 제거하고 전자 팁의 내부 면을 초음파 젤에 담급하십시오. 머리의 복부 측에 양극과 등쪽의 음극을 가진 물고기 머리를 전극 사이에 배치합니다.그런 다음, 여전히 물고기의 몸을 스폰지에 들고있는 동안, 전극을 부드럽고 정확하게 텔렌스팔론에 대고 발 페달로 전류를 관리하여 5 개의 펄스가 모두 끝날 때까지 전극을 제자리에 유지합니다. 전기포이션이 성공하면 플라스미드 표지된 단일 ependymoglial 세포가 비 플라스미드 라벨eemoglial 세포 사이에서 관찰될 수 있다. 전기 포기 과정의 효율에 따라, ependymoglial 세포의 더 높거나 낮은 수는 표지될 수 있습니다.그럼에도 불구하고, 입증된 프로토콜은 이전에 발표된 프로토콜보다 더 많은 수의 표지된 셀을 산출합니다. 라벨이 붙은 세포의 가장 높은 밀도는 주입된 플라스미드 액체가 반구 사이에 분포하는 방식으로 인해 두 반구의 내부 심실 측에서 주로 나타나는 경향이 있습니다. 이 비디오에서, 제브라피시 텔뇌스팔론의 한 반구는 무선 프로세스를 가진 ependymoglial 세포가 측에서 관찰될 때 마젠타에 있는 3D로 제시됩니다.핵을 라벨링하는 또 다른 플라스미드와의 공동 전기화를 통해, 에펜디모글리아세포의 세포 분열을 관찰할 수 있다. 실패한 전기기화는 매우 낮은 수 또는 에펜디모글리아질 세포에 표시되지 않습니다. 그러나 등쪽 연피 세포는 표지될 가능성이 가장 높습니다.그들의 소마는 cuboid에서 더 크고 ependymoglial 세포 층의 측면 보기에서 분명하게 무선 길쭉한 프로세스를 소유하지 않습니다. tdTomato-mem 표지된 세포는 ependymoglia의 층 위에 있는 가장 확률이 높은 ependymal 세포입니다. 대조적으로, 개별 에펜드미오글리올 세포에 플라스미드를 발현하는 tdTomato-mem의 도입은 초기 세포 라벨링 이외에 tdTomato-mem 발현을 초래한다.기억해야 할 가장 중요한 것은 모세관의 끝만 잘라내고 주입하는 동안 연피 층을 관통하여 액체가 심실 전체에 퍼지도록 하는 것입니다. 이 기술은 생체 내 이미징을 통해 단일 ependymoglial 세포의 장기 모니터링을 가능하게하고, 따라서 뇌 재생뿐만 아니라 생체 내 유전 링크에서 자신의 역할을 확립.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

겐타 마이신 유도 부상으로 성인 Zebrafish의에서 신장 재생

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

연구

발생학

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한<em&gt; 비켜에서</em&gt; 마이크로 전기

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

닭 오라클 Brainstem의 Ovo Electroporation에서

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

나노-중재 siRNA 유전자 입을 성인 Zebrafish 마음에

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

성인 Zebrafish 부상 모델 뼈 조직 재생에 Prednisolone의 효과 연구

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...