Name: electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon
Uploaded: 2019-09-13T15:00:00
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Agradecimentos especiais a James Copti para edição do manuscrito. Nós também reconhecemos com gratidão o financiamento para JN da Fundação alemã de pesquisa (DFG) pela SFB 870 e SPP "análise Integrativa de olfaction" e SPP 1738 "papéis emergentes de RNAs não codificantes no desenvolvimento do sistema nervoso, plasticidade & doença", SPP1757 " Heterogeneidade glial ", e estratégia de excelência no âmbito do cluster de Munique para Neurologia de sistemas (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).

Todos os animais utilizados neste protocolo foram mantidos condições de manejo padrão, e experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos de manuseio da UE e do governo da Alta Baviera (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. preparação da mistura plasmídeo para electroporação
<ol><li>Diluir o plasmídeo de interesse em água estéril e adicionar solução de estoque de mancha verde rápido [1 mg/mL]. Certifique-se de que a concentração final do plasmídeo é ~ 1 μg/μ...

<ol>
	<li>Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain.">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).</li><li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon:+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis.">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60 (3), 343-357 (2012).</li><li>Barbosa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain.">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 346 (6236), 789-793 (2015).</li><li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury.">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).</li><li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li><li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li><li>Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon.">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> Journal of Neurotrauma. , (2010).</li><li>Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+brain+injury+in+adult+zebrafish+stimulates+neurogenesis+and+long-distance+neuronal+integration.">Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration.</a> Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).</li><li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult.">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Development. 8 (3), (2013).</li><li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates.">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li><li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).</li><li>Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glia+and+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+central+nervous+system.">Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system.</a> Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).</li><li>Lyons, D. A., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+development+and+function+in+zebrafish.">Glial cell development and function in zebrafish.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).</li><li>Obermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Surface+Proteome+of+Adult+Neural+Stem+Cells+in+Zebrafish+Unveils+Long-Range+Cell-Cell+Connections+and+Age-Related+Changes+in+Responsiveness+to+IGF.">The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Kusumanto, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+in+vivo+transfer+of+plasmid+DNA+in+muscle:+comparison+of+electroporation+versus+ultrasound.">Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound.</a> Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).</li><li>Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gene+transfer+into+the+adult+zebrafish+brain+by+herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+electroporation:+methods+and+optogenetic+applications.">Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).</li><li>Van Tendeloo, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells:+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells.">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98 (1), 49-56 (2001).</li><li>Mars, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotransfection+and+lipofection+show+comparable+efficiency+for+in+vitro+gene+delivery+of+primary+human+myoblasts.">Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts.</a> The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).</li><li>Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+in+vivo+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+the+zebrafish+telencephalon.">Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon.</a> Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).</li><li>Di Giaimo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aryl+Hydrocarbon+Receptor+Pathway+Defines+the+Time+Frame+for+Restorative+Neurogenesis.">The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis.</a> Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).</li><li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+generation+of+customizable+gRNA+vectors+for+multiplex+CRISPR+approaches+through+string+assembly+gRNA+cloning+(STAgR).">One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR).</a> PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).</li><li>Barbosa, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , (2014).</li><li>Kelsh, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+pigmentation+mutations+and+the+processes+of+neural+crest+development.">Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development.</a> Development. 123, 369-389 (1996).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry.">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).</li><li>Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+formation+with+plasmid+DNA+increases+the+cytotoxicity+of+cationic+liposomes.">Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).</li><li>Chapouton, P., Godinho, L., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. 100, (2010).</li><li>Zhu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System.">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).</li></ol>

Este protocolo do Electroporation é um método in vivo de confiança de etiquetar pilhas ependymoglial individuais. O protocolo pode precisar de uma adaptação adicional para rotular outros tipos de células, como neurônios ou oligodendrócitos. Para conseguir a rotulagem bem sucedida, os plasmídeos que contêm promotores diferentes podem ser usados. O promotor da galinha-beta actina, o eF1alpha, o CMV e o promotor do ubiquitin foram usados previamente para conduzir a expressão de transgenes diferentes no ependymogl...

Zebrafish são excelentes modelos animais para examinar a regeneração cerebral após uma ferida de ferimento de facada. Em comparação com os mamíferos, na escada evolutiva, espécies menos evoluídas como o zebrafish geralmente apresentam taxas mais elevadas de neurogênese constitutiva e áreas mais amplas de residência neural adulta de células-tronco, levando à geração constante de novos neurônios ao longo a maioria das áreas cerebrais na vida adulta. Esta característica parece correlacionar com significativamente maior capacidade regenerativa de zebrafish em comparação com os mamíferos1, como zebrafish têm notável potencial para gerar eficientemente novos neurônios na maioria dos modelos de lesão cerebral estudados2, 3,4,5,6,7,8. Aqui, o telencéfalo zebrafish é estudado, uma vez que é uma área cerebral com neurogênese proeminente na idade adulta. Estas zonas da neurogênese adulta são homólogo às zonas neurogênica no cérebro mamífero adulto9,10,11.
As áreas neurogênica abundantes no telencéfalo do zebrafish estão atuais devido à existência do glia radial como pilhas ou pilhas do ependymoglia. As células ependymogliais atuam como células-tronco neurais adultas residentes e são responsáveis pela geração de novos neurônios no cérebro intacto e regenerador3,5. Experimentos de rastreamento de linhagem mostraram que a ependymoglia ventricular reage à lesão, então proliferam e geram novos neuroblastos que migram para o local da lesão5. Devido à natureza evertido do telencephalon do zebrafish, as pilhas de ependymoglial alinham a superfície ventricular e constroem a parede ventricular ventral. A parede ventricular dorsal é formada por uma camada de células ependímicas dorsais (Figura 1a). Importante, o zebrafish ependymoglia incorpora as características tanto da glia radial de mamíferos quanto das células ependímicas. Os processos radiais longos são uma característica típica das células da glia radial, enquanto as extensões celulares e as junções apertadas (bem como suas posições ventriculares) são características típicas das células ependímicas12,13,14. Conseqüentemente, estas pilhas são referidas como pilhas ependymoglial.
Para seguir o comportamento in vivo de células ependymogliais únicas durante a regeneração, eles precisam ser rotulados de forma confiável. Os vários métodos da rotulagem in vivo da pilha para a microscopia fluorescente foram descritos previamente, tais como repórteres endógenos ou tinturas lipofílico15. Estes métodos, em contraste com o electroporation, podem exigir uns períodos de tempo mais longos e frequentemente não oferecem a possibilidade da única rotulagem da pilha ou do traçado a longo prazo permanente. Electroporation, entretanto (além da única rotulagem da pilha), oferece a possibilidade de introduzir o ADN novo na pilha de anfitrião. Além disso, comparado a outros métodos de transferência de DNA para as células, a eletroporação demonstrou ser um dos métodos mais eficientes16,17,18,19.
É apresentado aqui um protocolo do Electroporation que seja refinado com a finalidade de etiquetar únicas pilhas ependymoglial no telencephalon adulto do zebrafish. Este protocolo permite a rotulagem de pilhas ependymoglial únicas a fim segui-los durante um período de longo prazo20 ou para manipular caminhos específicos em uma maneira pilha-autônoma21,22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>For coloring plasmid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>SignaGel, Parker laboratories INC.</td>
			<td>15-60</td>
			<td>Electrode Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>TetraTec APS 50, 10l-60l</td>
			<td></td>
			<td>Can be bought in the pet shops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX Tweezertrodes Electrodes</td>
			<td>Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0486</td>
			<td>1mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation device</td>
			<td>BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection device</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Wall Borosillicate Glass Capillary</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0766</td>
			<td>Model No: G100-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10056-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Joystick micromanipulator</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>MN - 151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Needle holder comes together with the injection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle pulling device</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>Model No: PC-10</td>
			<td>The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One International</td>
			<td>633161</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon

O electroporation é um método do transfection em que um campo elétrico é aplicado às pilhas para criar pores temporários em uma membrana de pilha e para aumentar sua permeabilidade, desse modo permitindo que as moléculas diferentes sejam introduzidas à pilha. Neste papel, o electroporation é usado para introduzir plasmídeos às pilhas ependymoglial, que alinham a zona ventricular do telencephalon adulto do zebrafish. Uma fração dessas células mostra Propriedades de células-tronco e gera novos neurônios no cérebro zebrafish; Portanto, estudar seu comportamento é essencial para determinar seus papéis na neurogênese e regeneração. A introdução de plasmídeos através do Electroporation permite a rotulagem e o seguimento a longo prazo de uma única pilha ependymoglial. Além disso, os plasmímids tais como o recombinase do CRE ou o Cas9 podem ser entregados às únicas pilhas ependymoglial, que permite a recombinação do gene ou a edição do gene e fornece uma oportunidade original de avaliar a função autônoma do gene da pilha em um controlado, natural Ambiente. Finalmente, este protocolo detalhado, passo a passo do Electroporation é usado para obter a introdução bem sucedida de plasmídeos em um grande número de únicas pilhas ependymoglial.

O método de eletroporação descrito permite a entrega do DNA plasmídeo em células ependimogliais, localizadas superficialmente no telencédigo zebrafish e logo abaixo da camada de células ependímicas dorsais (Figura 1a).
Se o resultado da eletroporação for positivo, rotulados células ependymogliais únicas (células vermelhas na Figura 2a, b) podem ser observadas entre outr...

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Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

É apresentado aqui um método do Electroporation para a entrega do ADN do plasmídeo e a rotulagem da pilha ependymoglial no telencephalon adulto do zebrafish. Este protocolo é um método rápido e eficiente para visualizar e traçar células ependymogliais individuais e abre novas possibilidades para aplicar a eletroporação a uma ampla gama de manipulações genéticas.

Método de Electroporation para in vivo entrega de DNA plasmídeo no adulto zebrafish Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

Este protocolo permite a rotulagem de células ependymoglial individuais no telencephalon de zebrafish para permitir seu monitoramento a longo prazo, bem como a manipulação de caminhos específicos de forma autônoma celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a rotulagem de células únicas de forma rápida e eficiente, bem como a edição de genes e a manipulação da via de sinalização de forma autônoma celular. Este método permite a investigação de questões básicas de biologia celular, por exemplo, sobre delaminação celular, manutenção da homeostase epitelial e a simetria da divisão celular.Comece usando um aparelho de puxar agulhas para preparar capilares de vidro. Use dicas de microcarregador para encher um capilar de vidro preparado com dez microliters de solução plasmida. Em seguida, pressione a mudança capilar do menu" no dispositivo de injeção para permitir que a agulha seja carregada no suporte da agulha.Em seguida, troque o dispositivo de injeção de mudar o modo capilar para injetar. Em seguida, usando um estereótipo com uma ampliação de quatro vezes, e fórceps Finden, corte apenas a ponta do capilar. Em seguida, aplique pressão no pedal do pé para confirmar que as soluções plasmidas correm facilmente para fora da agulha sem obstáculos.Quando a agulha estiver pronta, transfira um zebrafish do tanque de criação para um recipiente de solução anestésica. E espere alguns minutos até que o movimento das brânquias diminua. Pressione o lado dorsal do peixe sedado sobre uma esponja pré-molhada sob o estereóscópio, e use um microknife dissecando aço inoxidável com uma borda de corte de 40 milímetros e uma espessura de 0,5 milímetros para criar cuidadosamente um pequeno buraco no crânio do peixe no lado posterior do telencephalon, logo ao lado da borda do tectum óptico.Incline o peixe conforme necessário e oriente a ponta do capilar de vidro em direção ao crânio no ângulo correto para facilitar a penetração da ponta capilar através do orifício. Em seguida, insira cuidadosamente a ponta do capilar no orifício através da camada celular ependímal dorsal, até chegar ao ventrículo telenceálico, e aplique pressão no pedal do pé por cerca de 10 segundos para entregar aproximadamente 1 microliter da solução plasmida. O sucesso da entrega pode ser confirmado observando a propagação do líquido verde por todo o ventrículo.Cubra o telencephalon de peixe com uma pequena quantidade de gel de ultrassom. Para eletroporação do animal injetado plasmídeo, remova a esponja da configuração da injeção e mergulhe o lado interno das eletrofinas em gel de ultrassom. Posicione a cabeça do peixe entre os eletrodos, com o eletrodo positivo no lado ventral da cabeça e o eletrodo negativo no lado dorsal.Em seguida, enquanto ainda segura o corpo do peixe na esponja, pressione os eletrodos suavemente e precisamente contra o telencephalon e administre a corrente com o pedal do pé, segurando os eletrodos no lugar até que todos os cinco pulsos estejam terminados. Se a eletroporação for bem sucedida, plasmid rotulado células ependymoglial simples podem ser observados entre as células ependymoglial não plasmidas. Dependendo da eficiência do processo de eletroporação, pode-se rotular um número maior ou menor de células ependymoglial.No entanto, o protocolo demonstrado produz um número maior de células rotuladas do que os protocolos publicados anteriormente. Note que a maior densidade de células rotuladas tende a emergir principalmente no lado ventricular interno de ambos os hemisférios devido à forma como o líquido plasmídeo injetado se distribui entre os hemisférios. Neste vídeo, um hemisfério do telencephalon de zebrafish é apresentado em 3D, onde as células ependymoglial com radioprocessos, estão em magenta quando observadas do lado.Através da co-eletroporação com outro plasmídeo que rotula núcleos, pode-se observar a divisão celular das células ependymoglial. A eletroporação mal sucedida resulta em um número muito baixo ou sem células ependymoglial rotuladas. As células ependísicas dorsais, no entanto, são as mais propensas a serem rotuladas.Sua soma é maior em cuboide e eles não possuem processos radio alongados tão evidentes a partir de uma visão lateral da camada celular ependymoglial. as células rotuladas tdTomato-mem são provavelmente células ependímicas, que estão localizadas acima da camada de ependymoglia. Em contraste, a introdução de um tdTomato-mem expressando plasmídeos para células ependmyoglial individuais resulta na expressão tdTomato-mem, além da rotulagem celular inicial.As coisas mais importantes a se lembrar são cortar apenas a ponta do capilar e penetrar na camada ependímal enquanto injeta para que o líquido se espalhe por todo o ventrículo. Essa técnica permite o monitoramento a longo prazo de células ependymoglial únicas através de imagens in vivo e, portanto, estabelecendo seu papel na regeneração cerebral, bem como seu vasto elo genético in vivo.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

A transferência de genes para o frango auditivo órgão por<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-eletroporação

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Em Ovo Electroporation no Brainstem Auditivo da Galinha

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Aplicação de RNAi e calor-choque-induzida expressão de fator de transcrição para reprogramar as células germinativas de neurônios em c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

SiRNA Nanoparticle-mediada-silenciamento no coração de Zebrafish adulto

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Modelos de lesão adulto Zebrafish para estudar os efeitos de prednisolona na regeneração de tecido ósseo

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...