Name: electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon
Uploaded: 2019-09-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon at JoVE.com

Особая благодарность Джеймсу Копти за редактирование рукописи. Мы также с благодарностью признаем финансирование JN от Немецкого научно-исследовательского фонда (DFG) по SFB 870 и SPP "Интегративный анализ Olfaction" и SPP 1738 "Новые роли не кодирования РНК в развитии нервной системы, пластичность и болезни", SPP1757 " Глиальная неоднородность" и Стратегия превосходства в рамках Мюнхенского кластера системной неврологии (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198).

Все животные, используемые в этом протоколе, содержались в стандартных условиях, и эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами и правилами ЕС и правительства Верхней Баварии (55,2-1-54-2532-0916).
1. Подготовка плазмидной смеси для электропорации
<ol><li>Разб?...

<ol>
	<li>Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain.">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).</li><li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon:+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis.">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60 (3), 343-357 (2012).</li><li>Barbosa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain.">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 346 (6236), 789-793 (2015).</li><li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury.">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).</li><li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li><li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li><li>Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon.">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> Journal of Neurotrauma. , (2010).</li><li>Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+brain+injury+in+adult+zebrafish+stimulates+neurogenesis+and+long-distance+neuronal+integration.">Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration.</a> Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).</li><li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult.">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Development. 8 (3), (2013).</li><li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates.">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li><li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).</li><li>Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glia+and+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+central+nervous+system.">Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system.</a> Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).</li><li>Lyons, D. A., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+development+and+function+in+zebrafish.">Glial cell development and function in zebrafish.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).</li><li>Obermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Surface+Proteome+of+Adult+Neural+Stem+Cells+in+Zebrafish+Unveils+Long-Range+Cell-Cell+Connections+and+Age-Related+Changes+in+Responsiveness+to+IGF.">The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Kusumanto, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+in+vivo+transfer+of+plasmid+DNA+in+muscle:+comparison+of+electroporation+versus+ultrasound.">Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound.</a> Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).</li><li>Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gene+transfer+into+the+adult+zebrafish+brain+by+herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+electroporation:+methods+and+optogenetic+applications.">Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).</li><li>Van Tendeloo, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells:+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells.">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98 (1), 49-56 (2001).</li><li>Mars, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotransfection+and+lipofection+show+comparable+efficiency+for+in+vitro+gene+delivery+of+primary+human+myoblasts.">Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts.</a> The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).</li><li>Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+in+vivo+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+the+zebrafish+telencephalon.">Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon.</a> Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).</li><li>Di Giaimo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aryl+Hydrocarbon+Receptor+Pathway+Defines+the+Time+Frame+for+Restorative+Neurogenesis.">The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis.</a> Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).</li><li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+generation+of+customizable+gRNA+vectors+for+multiplex+CRISPR+approaches+through+string+assembly+gRNA+cloning+(STAgR).">One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR).</a> PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).</li><li>Barbosa, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , (2014).</li><li>Kelsh, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+pigmentation+mutations+and+the+processes+of+neural+crest+development.">Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development.</a> Development. 123, 369-389 (1996).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry.">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).</li><li>Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+formation+with+plasmid+DNA+increases+the+cytotoxicity+of+cationic+liposomes.">Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).</li><li>Chapouton, P., Godinho, L., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. 100, (2010).</li><li>Zhu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System.">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).</li></ol>

Этот протокол электропорации является надежным методом in vivo для маркировки отдельных эпиндимольных клеток. Протокол может потребоваться дальнейшая адаптация для обозначения других типов клеток, таких как нейроны или олигодендроциты. Для достижения успешной маркировки можно использ...

Зебрафиш являются отличными моделями животных для изучения регенерации мозга после травмы раны. По сравнению с млекопитающими, на эволюционной лестнице, менее развитые виды, такие как зебра, как правило, показывают более высокие показатели составного нейрогенеза и более широкие области взрослого нейронных стволовых клеток жительства, что приводит к постоянному генерации новых нейронов во всем большинство областей мозга во взрослой жизни. Эта особенность, как представляется, коррелируют со значительно более высокой регенеративной способности зебры по сравнению с млекопитающими1, как зебрацы имеют замечательный потенциал для эффективного создания новых нейронов в большинстве моделей травмы мозга изучены2, 3,4,5,6,7,8. Здесь изучается теленцефалон зебры, так как это область мозга с выдающимся нейрогенезом во взрослом возрасте. Эти зоны взрослого нейрогенеза гомологичны к нейрогенным зонам в взрослом мозге млекопитающих9,10,11.
Обильные нейрогенные области в теленефалион зебрафиш присутствуют из-за существования радиальной глии, как клетки или клетки эпиндимолии. Эпендимоглиальные клетки действуют как резиденты взрослых нервных стволовых клеток и несут ответственность за генерацию новых нейронов как в нетронутой и регенерирующей мозга3,5. Эксперименты по отслеживанию линии показали, что желудочковая эпендимолия реагирует на травмы, затем размножается и генерирует новые нейробласты, которые мигрируют на место поражения5. Из-за вечной природы теленефалиона зебры, эпендимолиальные клетки выстраиваются в линию поверхности желудочка и строят стенку желудочков. Стенка желудочковых суставов образуется слоем эпидимальных клеток(рисунок 1A). Важно отметить, что зебрафиш ependymoglia воплощают характеристики как млекопитающих радиальной глии и эпендимальных клеток. Длинные радиальные процессы являются типичной особенностью клеток радиальной глии, в то время как клеточные расширения и плотные соединения (а также их желудочковые положения) являются типичными особенностями эпендимальных клеток12,13,14. Таким образом, эти клетки называются эпедимолийными клетками.
Чтобы следить за поведением in vivo одиночных эпедимолиальных клеток во время регенерации, они должны быть надежно помечены. Различные методы in vivo маркировки клеток для флуоресцентной микроскопии были ранее описаны, такие как эндогенные репортеры или липофильные красители15. Эти методы, в отличие от электропорации, могут потребовать более длительных периодов времени и часто не дают возможности маркировки одной клетки или постоянного долгосрочного отслеживания. Электропорация, однако (кроме одноклеточной маркировки), предлагает возможность введения новой ДНК в клетку-хозяина. Кроме того, по сравнению с другими методами передачи ДНК в клетки, электропорация была продемонстрирована как один из самых эффективных методов16,17,18,19.
Представлен протокол электропорации, который был усовершенствован с целью маркировки отдельных эпеничных клеток во взрослом теленефалии зебры. Этот протокол позволяет маркировки одного эпенимолитальных клеток для того, чтобы следовать за ними в течение длительного периода20 или манипулировать конкретными путями в клеточной автономной манере21,22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>For coloring plasmid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>SignaGel, Parker laboratories INC.</td>
			<td>15-60</td>
			<td>Electrode Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>TetraTec APS 50, 10l-60l</td>
			<td></td>
			<td>Can be bought in the pet shops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX Tweezertrodes Electrodes</td>
			<td>Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0486</td>
			<td>1mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation device</td>
			<td>BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection device</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Wall Borosillicate Glass Capillary</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0766</td>
			<td>Model No: G100-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10056-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Joystick micromanipulator</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>MN - 151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Needle holder comes together with the injection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle pulling device</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>Model No: PC-10</td>
			<td>The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One International</td>
			<td>633161</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon

Электропорация является методом трансфекции, при котором электрическое поле применяется к клеткам для создания временных пор в клеточной мембране и повышения ее проницаемости, тем самым позволяя различным молекулам быть введены в клетку. В этой работе, электропорация используется для введения плазмиды эпиддийных клеток, которые выстраиваются в желудочковой зоне взрослого теленцефалона зебры. Часть этих клеток показывает свойства стволовых клеток и генерирует новые нейроны в мозге зебры; Поэтому, изучение их поведения имеет важное значение для определения их роли в нейрогенезе и регенерации. Внедрение плазмидов с помощью электропорации позволяет долгосрочно маркировать и отслеживать одну эпендимолиальную клетку. Кроме того, плазмиды, такие как рекомбиназа cre или Cas9, могут быть доставлены в одиночные эпендимолиальные клетки, что позволяет рекомбинации генов или редактирования генов и предоставляет уникальную возможность оценить функцию автономного гена клетки в контролируемой, естественной Среды. Наконец, этот подробный, пошаговой протокол электропорации используется для успешного внедрения плазмидов в большое количество одиночных эпиддимолиальных клеток.

Описанный метод электропорации позволяет доставлять плазмидную ДНК в эпендимолиальные клетки, которые расположены поверхностно в теленецефалии зебры и чуть ниже зеронного эпендимального клеточного слоя(рисунок 1A).
Е...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon at JoVE.com

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Здесь представлен метод электропорации для плазмидной доставки ДНК и эпендимолиальной маркировки клеток во взрослой теленцефалоне зебры. Этот протокол является быстрым и эффективным методом визуализации и отслеживания отдельных эпендимолиальных клеток и открывает новые возможности для применения электропорации к широкому спектру генетических манипуляций.

Электропорация Метод для In Vivo Доставка плазмидной ДНК в взрослых зебрафиш теленефалион

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

Этот протокол позволяет маркировать отдельные эпендимоглиальные клетки в теленцефалоне зебры, чтобы обеспечить их долгосрочный мониторинг, а также манипуляции конкретных путей в клеточно-автономной манере. Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет одноклеточной маркировки в быстрый и эффективный способ, а также редактирования генов и сигнализации пути манипуляции в клеточно-автономной манере. Этот метод позволяет изучат основные вопросы клеточной биологии, например, о делеминации клеток, поддержании эпителиального гомеостаза и симметрии деления клеток.Начните с использования иглы вытягивания аппарата для подготовки стеклянных капилляров. Используйте советы микрозагрузчиков, чтобы заполнить подготовленный стеклянный капилляр десятью микролитров плазмидного раствора. Затем нажмите меню изменить капилляр "на инъекционное устройство, чтобы игла, чтобы быть загружены в держатель иглы.Затем переключитесь с устройства впрыска с капилляра на режим впрыска. Затем, используя стереомикроскоп с четырехкратным увеличением, и Finden типсы, вырезать только кончик капилляра. Затем нанесите давление на педаль стопы, чтобы подтвердить, что плазмидные растворы легко выбегает из иглы без помех.Когда игла будет готова, перенесите зебру из резервуара для мужа в контейнер обезболивающего раствора. И подождите несколько минут, пока движение жабры утихнет. Нажмите на соленую рыбью спинную сторону вверх на предварительно смоченной губкой под стереомикроскопом, и используйте микронойф из нержавеющей стали с 40-миллиметровым передним краем и толщиной 0,5 миллиметра, чтобы тщательно создать небольшое отверстие в черепе рыбы на задней стороне теленцефалона, рядом с границей оптического тектума.Наклоните рыбу по мере необходимости и сориентировать кончик стеклянной капиллярной кости к черепу в правильном углу, чтобы облегчить проникновение капиллярного кончика через отверстие. Затем очень осторожно вставьте кончик капилляра в отверстие через спинной эпендимальный клеточный слой, пока он не достигнет теленцефалического желудочка, и нанесите давление на педаль стопы в течение примерно 10 секунд, чтобы доставить примерно 1 микролитер плазмидного раствора. Успех доставки может быть подтвержден путем наблюдения за распространением зеленой жидкости по всему желудочков.Обложка рыбы теленцефалон с небольшим количеством ультразвукового геля. Для электропорации плазмидного инъекционного животного снимите губку с инъекционной настройки и погрузите внутреннюю сторону электротипса в ультразвуковой гель. Располагайте головку рыбы между электродами, с положительным электродом на брюшной стороне головы и отрицательным электродом на спинной стороне.Затем, все еще держа тело рыбы в губке, нажмите электроды осторожно и точно против теленцефалона и управлять током с педалью ноги, удерживая электроды на месте, пока все пять импульсов не будут закончены. Если электропорация успешна, плазмид помечены одной эпендимоглиальных клеток можно наблюдать среди неплазмидных помечены эпендимоглиальных клеток. В зависимости от эффективности процесса электропорации, может быть помечено более высокое или меньшее количество эпендимоглиальных клеток.Тем не менее, продемонстрированый протокол дает большее количество помеченных ячеек, чем ранее опубликованные протоколы. Обратите внимание, что самая высокая плотность помеченных клеток, как правило, возникают в основном на внутренней желудочковой стороне обоих полушарий из-за того, как впрыскиваемая плазмидная жидкость распределяется между полушариями. В этом видео, одно полушарие теленцефалона зебры представлено в 3D, где эпендимоглиальные клетки с радио-процессами, находятся в пурпурном при наблюдении со стороны.Благодаря совместной электропорации с другой плазмидой, которая маркирует ядра, можно наблюдать деление клеток эпендимоглиальных клеток. Неудачное электропорация приводит к очень низкому количеству или без помеченных эпендимоглиальных клеток. Спинные эпендимальные клетки, однако, скорее всего, будут помечены.Их сома больше в кубоиды, и они не обладают радио-удлиненные процессы, как видно из стороны зрения эпендимоглиального слоя клеток. TdTomato-mem помечены клетки, скорее всего, эпендимальные клетки, которые расположены над слоем ependymoglia. В отличие от этого, введение tdTomato-mem, выражаюго плазмиду отдельным эпендмиоглиальным клеткам, приводит к выражению tdTomato-mem в дополнение к первоначальной маркировке клеток.Наиболее важные вещи, чтобы помнить, чтобы сократить только кончик капилляров и проникнуть в эпендимальный слой во время инъекций, так что жидкость распространяется по всему желудочка. Этот метод позволяет осуществлять долгосрочный мониторинг одиночных эпендимоглиальных клеток с помощью визуализации in vivo и, следовательно, устанавливать их роль в регенерации мозга, а также их обширную генетическую связь in vivo.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Почки Регенерация у взрослых данио рерио по гентамицина поражении

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Перенос генов в Куриный органа по Слуховые<em&gt; В Ово</em&gt; Micro-электропорации

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

В визуализации in vivo трансгенной экспрессии генов в Персональной Ретинального прародителей в химерных эмбрионов данио рерио по изучению мобильных неавтономных Влияния

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

В Ово Электропорация в курином слуховом мозге

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Рассечение и Immunofluorescent окрашивание гриб тело и фоторецепторных нейронов в мозге взрослого Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Применение РНК-интерференции и тепло шок индуцированной выражение фактор транскрипции для перепрограммирования клетки семенозачатка нейронов в C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Наночастицы опосредованной siRNA сайленсинга генов в сердце взрослого человека данио рерио

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Визуализация узлов и Notochordal пластины в Gastrulating эмбрионов мыши, используя растровая электронная микроскопия и вся гора иммунофлуоресценции

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Взрослый данио рерио травмы модели для изучения последствий преднизолона в регенерации костной ткани

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...