Name: electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon
Uploaded: 2019-09-13T15:00:00
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Un agradecimiento especial a James Copti por editar el manuscrito. También agradecemos la financiación a JN de la Fundación Alemana de Investigación (DFG) por el SFB 870 y SPP "Análisis Integrativo de Olfacción" y SPP 1738 "Funciones emergentes de ARN no codificantes en el desarrollo del sistema nervioso, plasticidad y enfermedad", SPP1757 " Heterogeneidad glial", y Estrategia de Excelencia en el marco del Clúster de Neurología de Sistemas de Múnich (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).

Todos los animales utilizados en este protocolo se mantuvieron en condiciones estándar de cría, y los experimentos se han realizado de acuerdo con las directrices y reglamentos de manipulación de la UE y el Gobierno de Alta Baviera (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. Preparación de la mezcla de plásmido para la electroporación
<ol><li>Diluir el plásmido de interés en agua estéril y añadir solución de tinción verde rápida [1 mg/ml]. Asegúrese de que la concentración final del plásmid...

<ol>
	<li>Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain.">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).</li><li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon:+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis.">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60 (3), 343-357 (2012).</li><li>Barbosa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain.">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 346 (6236), 789-793 (2015).</li><li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury.">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).</li><li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li><li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li><li>Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon.">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> Journal of Neurotrauma. , (2010).</li><li>Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+brain+injury+in+adult+zebrafish+stimulates+neurogenesis+and+long-distance+neuronal+integration.">Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration.</a> Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).</li><li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult.">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Development. 8 (3), (2013).</li><li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates.">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li><li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).</li><li>Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glia+and+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+central+nervous+system.">Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system.</a> Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).</li><li>Lyons, D. A., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+development+and+function+in+zebrafish.">Glial cell development and function in zebrafish.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).</li><li>Obermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Surface+Proteome+of+Adult+Neural+Stem+Cells+in+Zebrafish+Unveils+Long-Range+Cell-Cell+Connections+and+Age-Related+Changes+in+Responsiveness+to+IGF.">The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Kusumanto, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+in+vivo+transfer+of+plasmid+DNA+in+muscle:+comparison+of+electroporation+versus+ultrasound.">Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound.</a> Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).</li><li>Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gene+transfer+into+the+adult+zebrafish+brain+by+herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+electroporation:+methods+and+optogenetic+applications.">Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).</li><li>Van Tendeloo, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells:+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells.">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98 (1), 49-56 (2001).</li><li>Mars, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotransfection+and+lipofection+show+comparable+efficiency+for+in+vitro+gene+delivery+of+primary+human+myoblasts.">Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts.</a> The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).</li><li>Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+in+vivo+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+the+zebrafish+telencephalon.">Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon.</a> Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).</li><li>Di Giaimo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aryl+Hydrocarbon+Receptor+Pathway+Defines+the+Time+Frame+for+Restorative+Neurogenesis.">The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis.</a> Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).</li><li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+generation+of+customizable+gRNA+vectors+for+multiplex+CRISPR+approaches+through+string+assembly+gRNA+cloning+(STAgR).">One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR).</a> PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).</li><li>Barbosa, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , (2014).</li><li>Kelsh, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+pigmentation+mutations+and+the+processes+of+neural+crest+development.">Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development.</a> Development. 123, 369-389 (1996).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry.">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).</li><li>Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+formation+with+plasmid+DNA+increases+the+cytotoxicity+of+cationic+liposomes.">Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).</li><li>Chapouton, P., Godinho, L., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. 100, (2010).</li><li>Zhu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System.">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).</li></ol>

Este protocolo de electroporación es un método in vivo fiable de etiquetado de células epentimoglial individuales. El protocolo puede necesitar una adaptación adicional para etiquetar otros tipos de células como neuronas u oligodendrocitos. Para lograr un etiquetado exitoso, se pueden utilizar plásmidos que contengan diferentes promotores. Promotor de actina de pollo-beta, eF1alpha, CMV y promotor de ubiquitina se han utilizado previamente para impulsar la expresión de diferentes transgenes en ependymoglia y su pr...

Zebrafish son excelentes modelos animales para examinar la regeneración cerebral después de una lesión en la herida de puñalada. En comparación con los mamíferos, en la escala evolutiva, las especies menos evolucionadas como el pez cebra generalmente muestran tasas más altas de neurogénesis constitutiva y áreas más amplias de residencia de células madre neurales adultas, lo que conduce a la generación constante de nuevas neuronas a lo largo de la mayoría de las áreas cerebrales en la vida adulta. Esta característica parece correlacionarse con una capacidad regenerativa significativamente mayor del pez cebra en comparación con los mamíferos1, ya que los peces cebra tienen un potencial notable para generar eficientemente nuevas neuronas en la mayoría de los modelos de lesiones cerebrales estudiados2, 3,4,5,6,7,8. Aquí se estudia el telencéfalo de pez cebra, ya que es un área cerebral con neurogénesis prominente en la edad adulta. Estas zonas de neurogénesis adulta son homoólogas a zonas neurogénicas en el cerebro adulto demamíferos9,10,11.
Abundantes áreas neurogénicas en el telencéfalo de pez cebra están presentes debido a la existencia de glia radial como células o células de ependymoglia. Las células ependymoglial actúan como células madre neurales adultas residentes y son responsables de la generación de nuevas neuronas en el cerebro intacto y regenerador3,5. Los experimentos de rastreo de linaje han demostrado que la ependymoglia ventricular reacciona a la lesión, luego proliferan y generan nuevos neuroblastos que migran al sitio de la lesión5. Debido a la naturaleza evertida del telencéfalo de pez cebra, las células epentimoglial eslacionan la superficie ventricular y construyen la pared ventricular ventral. La pared ventricular dorsal está formada por una capa de células ependitas dorsales(Figura 1A). Es importante destacar que la epentioglia del pez cebra encarna las características tanto de la glia radial de mamíferos como de las células epentimales. Los procesos radiales largos son una característica típica de las células glia radiales, mientras que las extensiones celulares y las uniones estrechas (así como sus posiciones ventriculares) son características típicas de las células epentimales12,13,14. Por lo tanto, estas células se conocen como células epenymoglial.
Para seguir el comportamiento in vivo de células ependymoglial individuales durante la regeneración, deben etiquetarse de forma fiable. Se han descrito previamente varios métodos de etiquetado de células in vivo para microscopía fluorescente, como reporteros endógenos o colorantes lipofílicos15. Estos métodos, a diferencia de la electroporación, pueden requerir períodos de tiempo más largos y a menudo no ofrecen la posibilidad de etiquetado de una sola célula o rastreo permanente a largo plazo. La electroporación, sin embargo (además del etiquetado de una sola célula), ofrece la posibilidad de introducir nuevo ADN en la célula huésped. Además, en comparación con otros métodos de transferencia de ADN a las células, se ha demostrado que la electroporación es uno de los métodos más eficientes16,17,18,19.
Aquí se presenta un protocolo de electroporación que se ha refinado con el fin de etiquetar células ependymoglial únicas en el telencéfalo adulto de pez cebra. Este protocolo permite el etiquetado de células epentimogliales individuales con el fin de seguirlas a largo plazo20 o manipular vías específicas de manera autónoma celular21,22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>For coloring plasmid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>SignaGel, Parker laboratories INC.</td>
			<td>15-60</td>
			<td>Electrode Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>TetraTec APS 50, 10l-60l</td>
			<td></td>
			<td>Can be bought in the pet shops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX Tweezertrodes Electrodes</td>
			<td>Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0486</td>
			<td>1mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation device</td>
			<td>BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection device</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Wall Borosillicate Glass Capillary</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0766</td>
			<td>Model No: G100-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10056-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Joystick micromanipulator</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>MN - 151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Needle holder comes together with the injection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle pulling device</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>Model No: PC-10</td>
			<td>The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One International</td>
			<td>633161</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon

La electroporación es un método de transfección en el que se aplica un campo eléctrico a las células para crear poros temporales en una membrana celular y aumentar su permeabilidad, permitiendo así introducir diferentes moléculas en la célula. En este artículo, la electroporación se utiliza para introducir plásmidos a las células ependigliales, que recubren la zona ventricular del telencéfalo adulto del pez cebra. Una fracción de estas células muestra propiedades de células madre y genera nuevas neuronas en el cerebro del pez cebra; por lo tanto, estudiar su comportamiento es esencial para determinar sus funciones en la neurogénesis y la regeneración. La introducción de plásmidos a través de la electroporación permite el etiquetado y seguimiento a largo plazo de una sola célula ependymoglial. Además, los plásmidos como Cre recombinase o Cas9 pueden ser entregados a células ependymoglial únicas, lo que permite la recombinación genética o la edición genética y proporciona una oportunidad única para evaluar la función génica autónoma de la célula en un control natural Ambiente. Por último, este protocolo de electroporación detallado paso a paso se utiliza para obtener una introducción exitosa de plásmidos en un gran número de células ependimarinas individuales.

El método de electroporación descrito permite la entrega de ADN plásmido en células ependymoglial, que se encuentran superficialmente en el telencéfalo de pez cebra y justo debajo de la capa de células epentimales dorsales(Figura 1A).
Si el resultado de la electroporación es positivo, se pueden observar células ependymoglial (células rojas en la Figura 2A,B)entre otras cél...

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Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Aquí se presenta un método de electroporación para la entrega de ADN plásmido y el etiquetado de células ependimarinas en el telencéfalo adulto de pez cebra. Este protocolo es un método rápido y eficiente para visualizar y rastrear células ependymoglial individuales y abre nuevas posibilidades para aplicar la electroporación a una amplia gama de manipulaciones genéticas.

Método de electroporación para la entrega in Vivo de ADN plásmido en el telencéfalo adulto de pez cebra

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

Este protocolo permite el etiquetado de células ependigliales individuales en el telencefallo del pez cebra para permitir su seguimiento a largo plazo, así como la manipulación de vías específicas de manera autónoma de las células. La principal ventaja de esta técnica es que permite el etiquetado de una sola célula de manera rápida y eficiente, así como la edición de genes y la manipulación de la vía de señalización de forma autónoma de las células. Este método permite la investigación de preguntas básicas de biología celular, por ejemplo, sobre la delaminación celular, el mantenimiento de la homeostasis epitelial y la simetría de la división celular.Comience por usar un aparato de tracción de agujas para preparar capilares de vidrio. Utilice puntas de microcargador para llenar un capilar de vidrio preparado con diez microlitros de solución de plásmido. A continuación, pulse el menú cambiar capilar"en el dispositivo de inyección para permitir que la aguja se cargue en el soporte de la aguja.A continuación, cambie el dispositivo de inyección de cambiar el capilar al modo de inyección. Luego, usando un estereomicroscopio con un aumento cuatro veces, y fórceps Finden, corta solo la punta del capilar. A continuación, aplique presión sobre el pedal para confirmar que las soluciones de plásmido salen fácilmente de la aguja sin obstáculos.Cuando la aguja esté lista, transfiera un pez cebra del tanque de cría a un recipiente de solución anestésica. Y espera unos minutos hasta que el movimiento de las branquias desaparezca. Presione el lado dorsal del pez sedado hacia arriba sobre una esponja pre-humedecida debajo del estereomicroscopio, y utilice una microknife diseccionante de acero inoxidable con un filo de corte de 40 milímetros y un grosor de 0,5 milímetros para crear cuidadosamente un pequeño agujero en el cráneo del pez en el lado posterior del telencéfalo, justo al lado del borde del tectum óptico.Incline el pez según sea necesario y oriente la punta del capilar de vidrio hacia el cráneo en el ángulo correcto para facilitar la penetración de la punta capilar a través del agujero. A continuación, inserte muy cuidadosamente la punta del capilar en el orificio a través de la capa celular ependimal dorsal, hasta que llegue al ventrículo telencéfalo, y aplique presión al pedal durante unos 10 segundos para entregar aproximadamente 1 microlitro de la solución de plásmido. El éxito de la entrega se puede confirmar observando la propagación del líquido verde a lo largo del ventrículo.Cubra el telencéfalo de pescado con una pequeña cantidad de gel de ultrasonido. Para la electroporación del animal inyectado plásmido, retire la esponja de la configuración de la inyección y sumerja el lado interno de las puntas electromagnida en gel de ultrasonido. Coloque la cabeza del pez entre los electrodos, con el electrodo positivo en el lado ventral de la cabeza y el electrodo negativo en el lado dorsal.Luego, mientras mantiene el cuerpo del pez en la esponja, presione los electrodos suavemente y con precisión contra el telencéfalo y administre la corriente con el pedal, sosteniendo los electrodos en su lugar hasta que los cinco pulsos estén terminados. Si la electroporación es exitosa, se puede observar un plásmido etiquetado con células ependipogliales individuales entre las células ependigliales no plásmidas etiquetadas. Dependiendo de la eficiencia del proceso de electroporación, se puede etiquetar un número mayor o menor de células ependipogliales.Sin embargo, el protocolo demostrado produce un mayor número de celdas etiquetadas que los protocolos publicados anteriormente. Tenga en cuenta que la mayor densidad de células etiquetadas tiende a emerger principalmente en el lado ventricular interno de ambos hemisferios debido a la forma en que el líquido plásmido inyectado distribuye entre los hemisferios. En este video, un hemisferio del tetófalo del pez cebra se presenta en 3D, donde las células ependimogliales con procesos radioeléctricos, se encuentran en magenta cuando se observan desde el lado.A través de la co-electroporación con otro plásmido que etiqueta los núcleos, se puede observar la división celular de las células ependimogliales. La electroporación sin éxito da como resultado un número muy bajo o ninguna célula ependiglial etiquetada. Las células ependimales dorsales, sin embargo, son las más propensas a ser etiquetadas.Su soma es más grande en cuboide y no poseen procesos radio-alargados como se evidencia desde una vista lateral de la capa celular ependimoglial. Las células etiquetadas tdTomato-mem son probablemente células ependimales, que se encuentran por encima de la capa de ependymoglia. Por el contrario, la introducción de un plásmido-mem que expresa plásmido a células ependmyoglial individuales da como resultado la expresión tdTomato-mem además del etiquetado celular inicial.Lo más importante a recordar es cortar sólo la punta del capilar y penetrar la capa ependimal durante la inyección para que el líquido se propague por todo el ventrículo. Esta técnica permite el monitoreo a largo plazo de células ependimogliales individuales a través de imágenes in vivo, y por lo tanto establecer su papel en la regeneración cerebral, así como su vasto vínculo genético in vivo.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

La regeneración renal en adultos de pez cebra por gentamicina lesión inducida

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

La transferencia de genes en el pollo auditiva de órgano de<em&gt; En Ovo</em&gt; Micro-electroporación

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

En vivo de imágenes de transgénicos de la Expresión Génica en el Estimado de retina progenitores en embriones de pez cebra quiméricos para estudiar celulares Influencias no autónomos

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

En Ovo electroporación en el tronco encefálico auditivo del pollo

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Aplicación de RNAi y expresión del Factor de transcripción inducida por choque térmico para reprogramar las células de germen para las neuronas en C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Nanopartícula mediada por siRNA silenciamiento génico en corazón de pez cebra adulto

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Pez cebra adulto lesión modelos para estudiar los efectos de la prednisolona en regeneración de tejido óseo

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...