Name: electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon
Uploaded: 2019-09-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon at JoVE.com

Speciellt tack till James Copti för redigering av manuskriptet. Vi erkänner också tacksamt finansiering till JN från den tyska Research Foundation (DFG) av SFB 870 och SPP "integrativ analys av Olfaction" och SPP 1738 "framväxande roller icke-kodning RNAs i nervsystemet utveckling, plasticitet & sjukdom", SPP1757 " Glial heterogenitet ", och Excellence strategi inom ramen för München cluster för system Neurology (EXC 2145 SyNergy-ID 390857198).

Alla djur som används i detta protokoll har hållits under standard uppfödningsförhållanden, och experiment har utförts i enlighet med riktlinjerna och föreskrifterna för EU och regeringen i Oberbayern (AZ 55,2-1-54-2532-0916).
1. beredning av plasmid blandning för elektroporation
<ol><li>Späd plasmiden av intresse i sterilt vatten och tillsätt snabbt grön fläck stamlösning [1 mg/mL]. Se till att den slutliga koncentrationen av Plasmiden är ∼ 1 μg/μL. Tillsätt fläcken vid...

<ol>
	<li>Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain.">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).</li><li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon:+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis.">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60 (3), 343-357 (2012).</li><li>Barbosa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain.">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 346 (6236), 789-793 (2015).</li><li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury.">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).</li><li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li><li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li><li>Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon.">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> Journal of Neurotrauma. , (2010).</li><li>Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+brain+injury+in+adult+zebrafish+stimulates+neurogenesis+and+long-distance+neuronal+integration.">Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration.</a> Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).</li><li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult.">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Development. 8 (3), (2013).</li><li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates.">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li><li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).</li><li>Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glia+and+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+central+nervous+system.">Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system.</a> Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).</li><li>Lyons, D. A., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+development+and+function+in+zebrafish.">Glial cell development and function in zebrafish.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).</li><li>Obermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Surface+Proteome+of+Adult+Neural+Stem+Cells+in+Zebrafish+Unveils+Long-Range+Cell-Cell+Connections+and+Age-Related+Changes+in+Responsiveness+to+IGF.">The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Kusumanto, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+in+vivo+transfer+of+plasmid+DNA+in+muscle:+comparison+of+electroporation+versus+ultrasound.">Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound.</a> Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).</li><li>Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gene+transfer+into+the+adult+zebrafish+brain+by+herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+electroporation:+methods+and+optogenetic+applications.">Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).</li><li>Van Tendeloo, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells:+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells.">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98 (1), 49-56 (2001).</li><li>Mars, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotransfection+and+lipofection+show+comparable+efficiency+for+in+vitro+gene+delivery+of+primary+human+myoblasts.">Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts.</a> The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).</li><li>Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+in+vivo+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+the+zebrafish+telencephalon.">Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon.</a> Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).</li><li>Di Giaimo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aryl+Hydrocarbon+Receptor+Pathway+Defines+the+Time+Frame+for+Restorative+Neurogenesis.">The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis.</a> Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).</li><li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+generation+of+customizable+gRNA+vectors+for+multiplex+CRISPR+approaches+through+string+assembly+gRNA+cloning+(STAgR).">One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR).</a> PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).</li><li>Barbosa, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , (2014).</li><li>Kelsh, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+pigmentation+mutations+and+the+processes+of+neural+crest+development.">Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development.</a> Development. 123, 369-389 (1996).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry.">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).</li><li>Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+formation+with+plasmid+DNA+increases+the+cytotoxicity+of+cationic+liposomes.">Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).</li><li>Chapouton, P., Godinho, L., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. 100, (2010).</li><li>Zhu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System.">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).</li></ol>

Detta elektroporation protokoll är en pålitlig in vivo metod för märkning enskilda ependymoglial celler. Protokollet kan behöva en ytterligare anpassning för att märka andra celltyper såsom nervceller eller oligodendrocyter. För att uppnå en lyckad märkning kan plasmider som innehåller olika projektansvariga användas. "Chicken-beta aktin promotor, eF1alpha, CMV och ubiquitin promotor" har tidigare använts för att driva uttrycket av olika transgener i ependymoglia och deras avkomman23</sup...

Zebrafish är utmärkta djurmodeller för att undersöka hjärnans förnyelse efter en knivhugg sårskada. I jämförelse med däggdjur, på den evolutionära stege, mindre utvecklade arter såsom zebrafiskar allmänhet visar högre priser av konstitutiva neurogenes och bredare områden av vuxna neurala stamceller bosättning, vilket leder till ständig generering av nya nervceller i hela de flesta hjärnområden i vuxenlivet. Denna funktion verkar korrelera med betydligt högre regenerativ kapacitet av zebrafisk i jämförelse med däggdjur1, som zebrafiskar har anmärkningsvärd potential att effektivt generera nya nervceller i de flesta hjärnskada modeller studerade2, 3,4,5,6,7,8. Här är zebrafiskar telencephalon studeras, eftersom det är ett hjärnområde med framstående neurogenes i vuxen ålder. Dessa zoner av vuxna neurogenes är homolog till neurogena zoner i den vuxna däggdjurs hjärnan9,10,11.
Rikliga neurogena områden i zebrafiskar telencephalon är närvarande på grund av förekomsten av radiella glia som celler eller ependymoglia celler. Ependymoglial celler fungerar som bosatta vuxna neurala stamceller och är ansvariga för generering av nya nervceller i både intakt och regenererande hjärnan3,5. Härstamning experiment har visat att ventrikulär ependymoglia reagera på skada, sedan förgöra och generera nya neuroblaster som migrerar till lesion plats5. På grund av den vrängs natur zebrafiskar telencephalon, ependymoglial celler linje ventrikulära ytan och bygga ventrala ventrikulära väggen. Den dorsala ventrikulära väggen bildas av en dorsala ependymceller cellskikt (figur 1a). Viktigt är att zebrafiskar ependymoglia förkroppsligar egenskaperna hos både radiella glia-och ependymalceller från däggdjur. Långa radiella processer är typiska för radiala glia-celler, medan cellulära förlängningar och täta korsningar (liksom deras ventrikulära positioner) är typiska egenskaper hos ependymala celler12,13,14. Därför är dessa celler kallas ependymoglial celler.
För att följa in vivo beteende av enskilda ependymoglial celler under förnyelse, de måste vara tillförlitligt märkta. Olika metoder för in vivo cell märkning för fluorescerande mikroskopi har beskrivits tidigare, såsom endogena reportrar eller lipofila färgämnen15. Dessa metoder, i motsats till elektroporation, kan kräva längre tidsperioder och ofta inte erbjuder möjligheten att Single cell märkning eller permanent långsiktig spårning. Elektroporation, men (förutom Single cell märkning), erbjuder möjligheten att införa nya DNA i värdcellen. Dessutom, jämfört med andra metoder för DNA-överföring i cellerna, har elektroporation visat sig vara en av de mest effektiva metoderna16,17,18,19.
Presenteras här är en elektroporation protokoll som har förfinats i syfte att märka enda ependymoglial celler i den vuxna zebrafiskar telencephalon. Detta protokoll medger märkning av enstaka ependymoglialceller för att följa dem över en långsiktig period20 eller för att manipulera specifika vägar i ett cell självständigt sätt21,22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>For coloring plasmid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>SignaGel, Parker laboratories INC.</td>
			<td>15-60</td>
			<td>Electrode Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>TetraTec APS 50, 10l-60l</td>
			<td></td>
			<td>Can be bought in the pet shops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX Tweezertrodes Electrodes</td>
			<td>Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0486</td>
			<td>1mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation device</td>
			<td>BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection device</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Wall Borosillicate Glass Capillary</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0766</td>
			<td>Model No: G100-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10056-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Joystick micromanipulator</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>MN - 151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Needle holder comes together with the injection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle pulling device</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>Model No: PC-10</td>
			<td>The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One International</td>
			<td>633161</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon

Electroporation är en transfektion metod där ett elektriskt fält appliceras på celler för att skapa tillfälliga porer i ett cellmembran och öka dess permeabilitet, vilket gör att olika molekyler som skall införas i cellen. I detta papper, är elektroporation används för att införa plasmider till ependymoglial celler, som linje ventrikulär zon av den vuxna zebrafiskar telencephalon. En bråkdel av dessa celler visar stamcells egenskaper och genererar nya nervceller i zebrafiskar hjärnan; Därför är det viktigt att studera deras beteende för att avgöra deras roller i neurogenes och regeneration. Införandet av plasmider via elektroporation möjliggör långsiktig märkning och spårning av en enda ependymoglial cell. Dessutom kan plasmider som CRE driver eller Cas9 levereras till en enda ependymoglial celler, vilket möjliggör genrekombination eller genredigering och ger en unik möjlighet att bedöma cellens autonoma genfunktion i en kontrollerad, Naturlig Miljö. Slutligen, denna detaljerade, steg-för-steg elektroporation protokoll används för att få framgångsrikt införande av plasmider i ett stort antal enda ependymoglial celler.

Den beskrivna elektroporation metod tillåter leverans av plasmid DNA i ependymoglial celler, som ligger ytligt i zebrafiskar telencephalon och strax under dorsala ependymceller cell lagret (figur 1a).
Om resultatet av elektroporation är positivt, märkt enda ependymoglial celler (röda blodkroppar i figur 2A, B) kan observeras bland andra ependymoglial celler (vit i figur ...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon at JoVE.com

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Presenteras här är en elektroporation metod för plasmid DNA leverans och ependymoglial cell märkning i den vuxna zebrafiskar telencephalon. Detta protokoll är en snabb och effektiv metod för att visualisera och spåra enskilda ependymoglial celler och öppnar upp nya möjligheter att tillämpa elektroporation till ett brett spektrum av genetiska manipulationer.

Elektroporation metod för in vivo leverans av plasmid DNA i den vuxna Zebrafish telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

Detta protokoll gör det möjligt att märka enskilda ependymoglialceller i zebrafisken telencephalon för att möjliggöra deras långsiktiga övervakning, samt manipulering av specifika vägar på ett cell-autonomt sätt. Den största fördelen med denna teknik är att den tillåter encellig märkning på snabbt och effektivt sätt, samt genredigering och signaleringsvägsmanipulation på cellens autonoma sätt. Denna metod möjliggör undersökning av grundläggande cellbiologi frågor, till exempel om celldelning, upprätthållandet av epitelial homeostas, och symmetrin i celldelning.Börja med att använda en nål-dra apparat för att förbereda glas kapillärer. Använd mikroladdarspetsar för att fylla en förberedd kapillär i glas med tio mikroliter av plasmidlösning. Tryck sedan på menybytes kapillär"på injektionsanordningen för att nålen ska kunna laddas i nålhållaren.Växla sedan injektionsenheten från byt kapillär till insprutningsläge. Sedan, med hjälp av en stereomikroskop med en fyra gånger förstoring, och Finden-forceps, skär bara spetsen av kapillären. Applicera sedan tryck på fotpedalen för att bekräfta att plasmidlösningarna lätt tar ur nålen utan hinder.När nålen är klar, överför en zebrafisk från djurhållningstanken till en behållare med anestesilösning. Och vänta några minuter tills gälarnas rörelser avtar. Tryck den sövda fisken ryggstöd sidan upp på en pre-wetted svamp under stereomikroskop, och använda en rostfri dissekera microknife med en 40 millimeters skäregg och en 0,5 millimeter tjocklek för att noggrant skapa ett litet hål i fisk skallen på den bakre sidan av telencephalon, precis intill gränsen av optik tectum.Luta fisken efter behov och orientera glaskafillären mot skallen i rätt vinkel för att underlätta penetrering av kapillärspetsen genom hålet. Sedan, mycket försiktigt in spetsen av kapillären i hålet genom dorsala ependymala cellskiktet, tills den når telencephalic ventrikel, och tillämpa tryck på fotpedalen i ca 10 sekunder för att leverera cirka 1 mikroliter av plasmidlösningen. Framgången för leveransen kan bekräftas genom att observera spridningen av den gröna vätskan i hela ventrikeln.Täck fisken telencephalon med en liten mängd ultraljud gel. För elektroporation av det plasmid injicerade djuret, avlägsna svampen från injektionsuppläggningen och sänk ner elektrotipsens inre sida i ultraljudsgel. Placera fiskhuvudet mellan elektroderna, med den positiva elektroden vid den ventrala sidan av huvudet och den negativa elektroden på ryggsidan.Sedan, medan du fortfarande håller fiskens kropp i svampen, tryck elektroderna försiktigt och exakt mot telencephalon och administrera strömmen med fotpedalen, hålla elektroderna på plats tills alla fem pulser är färdiga. Om elektroporationen lyckas, kan plasmid märkta enstaka ependymoglialceller observeras bland de icke-plasmid märkta ependymoglialcellerna. Beroende på elektroporationsprocessens effektivitet kan ett högre eller lägre antal ependymogliala celler märkas.Trots det ger det påvisade protokollet ett högre antal märkta celler än tidigare publicerade protokoll. Observera att den högsta tätheten av märkta celler tenderar att dyka upp mestadels vid den inre ventrikulära sidan av båda halvkloten på grund av det sätt på vilket den injicerade plasmid vätskan fördelar mellan halvkloten. I denna video presenteras en halvklot av zebrafisken telencephalon i 3D, där ependymoglialcellerna med radio-processer, är i magenta när observerats från sidan.Genom co-electroporation med en annan plasmid som etiketter kärnor, celldelning av ependymoglial celler kan observeras. Misslyckad elektroporation resulterar i mycket lågt antal eller inga märkta ependymoglialceller. Dorsala ependymalceller är dock de mest sannolika att märkas.Deras soma är större i cuboid och de äger inte radio-långsträckt bearbetar som tydligt från en sida beskådar av ependymoglialcelllagrar. tdTomato-mem märkta celler är troligen ependymal celler, som ligger ovanför lagret av ependymoglia. Däremot resulterar införandet av en tdTomato-mem uttrycker plasmid till enskilda ependmyoglial celler i tdTomato-mem uttryck utöver den inledande cellen märkning.De viktigaste sakerna att komma ihåg är att skära endast spetsen av kapillären och att tränga in i ependymalskiktet medan du injicerar så att vätskan sprider sig i hela ventrikeln. Denna teknik möjliggör långsiktig övervakning av enstaka ependymoglial celler genom in vivo imaging, och därför etablera sin roll i hjärnans regenerering samt deras stora in vivo genetiska länk.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Njure Regeneration i vuxen Zebrafish av Gentamicin inducerad skada

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analys av Zebrafish Larver skelettmuskulatur Integrity med Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Genöverföring till kyckling hörselorganet genom<em&gt; I Ovo</em&gt; Micro-elektroporering

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo avbildning av Transgena genuttryck i Individuell Retinal stamceller i chimär Zebrafish embryon att studera Cell Nonautonomous Influenser

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

I Ovo Electroporation i Chicken Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion och Immunofluorescerande färgning av svamp kropp och ljusmätare nervceller i vuxen Drosophila melanogaster hjärnor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Tillämpningen av RNAi och värme-chock-inducerad transkription faktorn uttryck att omprogrammera könsceller att nervceller i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Nanopartikel-medierad siRNA nedtystning i vuxen zebrafiskar hjärtat

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisera den noden och Notochordal plattan i Gastrulating musembryon som använder Scanning Electron Microscopy och hela Mount immunofluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Adult zebrafiskar skada modeller för att studera effekterna av prednisolon i regenererande benvävnad

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...