Name: electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon
Uploaded: 2019-09-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon at JoVE.com

James Copti'ye el yazmasının düzenlenmesi için özel teşekkürler. Ayrıca SFB 870 ve SPP "Integrative Analysis of Olfaction" ve SPP 1738 "Sinir sistemi gelişiminde kodlamayan RNA'ların ortaya çıkan rolleri" spp1757 tarafından Alman Araştırma vakfından (DFG) JN'ye yapılan finansmanı minnetle kabul ediyoruz. Glial heterojenlik", ve Mükemmellik Stratejisi Münih Küme Sistemleri Nöroloji (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) çerçevesinde.

Bu protokolde kullanılan tüm hayvanlar standart hayvancılık koşullarında muhafaza edilmiş ve deneyler AB ve Yukarı Bavyera Hükümeti'nin (AZ 55.2-1-54-2532-0916) kullanım yönergeleri ve yönetmeliklerine uygun olarak yapılmıştır.
1. Elektroporasyon için Plazmid Karışımı hazırlanması
<ol><li>Steril su ilgi plazmid seyreltmek ve hızlı yeşil leke stok çözeltisi ekleyin [1 mg/mL]. Plazmidin son konsantrasyonunun (1 μg/μL) olduğundan emin olun.</li>
	<li>Hazırlandı...

<ol>
	<li>Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain.">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).</li><li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon:+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis.">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60 (3), 343-357 (2012).</li><li>Barbosa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain.">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 346 (6236), 789-793 (2015).</li><li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury.">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).</li><li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li><li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li><li>Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon.">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> Journal of Neurotrauma. , (2010).</li><li>Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+brain+injury+in+adult+zebrafish+stimulates+neurogenesis+and+long-distance+neuronal+integration.">Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration.</a> Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).</li><li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult.">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Development. 8 (3), (2013).</li><li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates.">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li><li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).</li><li>Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glia+and+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+central+nervous+system.">Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system.</a> Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).</li><li>Lyons, D. A., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+development+and+function+in+zebrafish.">Glial cell development and function in zebrafish.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).</li><li>Obermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Surface+Proteome+of+Adult+Neural+Stem+Cells+in+Zebrafish+Unveils+Long-Range+Cell-Cell+Connections+and+Age-Related+Changes+in+Responsiveness+to+IGF.">The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Kusumanto, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+in+vivo+transfer+of+plasmid+DNA+in+muscle:+comparison+of+electroporation+versus+ultrasound.">Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound.</a> Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).</li><li>Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gene+transfer+into+the+adult+zebrafish+brain+by+herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+electroporation:+methods+and+optogenetic+applications.">Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).</li><li>Van Tendeloo, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells:+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells.">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98 (1), 49-56 (2001).</li><li>Mars, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotransfection+and+lipofection+show+comparable+efficiency+for+in+vitro+gene+delivery+of+primary+human+myoblasts.">Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts.</a> The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).</li><li>Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+in+vivo+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+the+zebrafish+telencephalon.">Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon.</a> Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).</li><li>Di Giaimo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aryl+Hydrocarbon+Receptor+Pathway+Defines+the+Time+Frame+for+Restorative+Neurogenesis.">The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis.</a> Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).</li><li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+generation+of+customizable+gRNA+vectors+for+multiplex+CRISPR+approaches+through+string+assembly+gRNA+cloning+(STAgR).">One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR).</a> PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).</li><li>Barbosa, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , (2014).</li><li>Kelsh, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+pigmentation+mutations+and+the+processes+of+neural+crest+development.">Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development.</a> Development. 123, 369-389 (1996).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry.">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).</li><li>Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+formation+with+plasmid+DNA+increases+the+cytotoxicity+of+cationic+liposomes.">Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).</li><li>Chapouton, P., Godinho, L., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. 100, (2010).</li><li>Zhu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System.">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).</li></ol>

Bu elektroporasyon protokolü tek tek ependymoglial hücreleri etiketleme güvenilir bir in vivo yöntemidir. Protokol nöronlar veya oligodendrocytes gibi diğer hücre tipleri etiketlemek için daha fazla adaptasyon gerekebilir. Başarılı etiketleme elde etmek için, farklı organizatörler içeren plazmidler kullanılabilir. Tavuk-beta aktin organizatörü, eF1alpha, CMV ve ubikitin organizatörü daha önce ependymoglia farklı transgenlerin ekspresyonu ve onların döl23sürücü için kull...

Zebra balığı bir bıçak yarası yaralanması sonra beyin rejenerasyon incelemek için mükemmel hayvan modelleri vardır. Memelilere kıyasla, evrim merdiveninde, zebra balığı gibi daha az gelişmiş türler genellikle daha yüksek kurucu nörogenez ve yetişkin nöral kök hücre ikamet alanlarının daha yüksek oranlarını göstererek, sürekli olarak yeni nöronların yetişkin hayatında en beyin alanları. Bu özellik memelilere göre zebra balığının önemli ölçüde daha yüksek rejeneratif kapasitesi ile ilişkili görünüyor1, zebra balığı verimli bir şekilde en beyin hasarı modellerinde yeni nöronlar oluşturmak için olağanüstü bir potansiyele sahip olduğu gibi2, 3,4,5,6,7,8. Burada, zebra balığı telensefalon çalışılır, yetişkinlikte belirgin nörogenezi olan bir beyin alanı olduğu için. Erişkin nörogenezin bu bölgeleri yetişkin memeli beyninde nörojenik bölgelere homolog vardır9,10,11.
Zebrabalığı telensefalon bol nörojenik alanlar hücreleri veya ependymoglia hücreleri gibi radyal glia varlığı nedeniyle mevcuttur. Ependymoglial hücreler yerleşik yetişkin nöral kök hücreleri olarak hareket ve bozulmamış ve yenileyici beyin hem de yeni nöronların nesil sorumludur3,5. Soy izleme deneyleri ventriküler ependymoglia yaralanmatepki göstermiştir, daha sonra çoğalır ve lezyon sitesine göç yeni nöroblastlar üretmek5. Zebrabalığı telensefalon everted doğası nedeniyle, ependymoglial hücreler ventriküler yüzey hattı ve ventral ventriküler duvar inşa. Dorsal ventriküler duvar dorsal ependimal hücre tabakası ile oluşur (Şekil 1A). Daha da önemlisi, zebra balığı ependymoglia hem memeli radyal glia ve ependymal hücrelerin özelliklerini somutlaştırmak. Uzun radyal süreçler radyal glia hücrelerinin tipik bir özelliğidir, hücresel uzantıları ve sıkı kavşaklar ise (yanı sıra ventriküler pozisyonlar) ependimal hücrelerin tipik özellikleri12,13,14. Bu nedenle, bu hücreler ependymoglial hücreler olarak adlandırılır.
Rejenerasyon sırasında tek ependymoglial hücrelerin in vivo davranışını takip etmek için, güvenilir bir şekilde etiketlenmiş olması gerekir. Floresan mikroskopi için in vivo hücre etiketleme çeşitli yöntemler daha önce tarif edilmiştir, endojen muhabirler veya lipophilic boyalar gibi15. Bu yöntemler, elektroporasyon aksine, daha uzun süre ler gerektirebilir ve genellikle tek hücre etiketleme veya kalıcı uzun vadeli izleme imkanı sunmuyoruz. Elektroporasyon, ancak (tek hücre etiketleme yanı sıra), konak hücreiçine yeni DNA girme imkanı sunuyor. Ayrıca, hücrelere DNA transferi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, elektroporasyon en verimli yöntemlerden biri olduğu gösterilmiştir16,17,18,19.
Burada sunulan yetişkin zebrabalığı telencephalon tek ependymoglial hücreleri etiketleme amacıyla rafine edilmiş bir elektroporasyon protokolüdür. Bu protokol, uzun vadeli bir süre20 onları takip etmek veya hücre özerk bir şekilde belirli yolları işlemek için tek ependymoglial hücrelerin etiketleme sağlar21,22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>For coloring plasmid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>SignaGel, Parker laboratories INC.</td>
			<td>15-60</td>
			<td>Electrode Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump</td>
			<td>TetraTec APS 50, 10l-60l</td>
			<td></td>
			<td>Can be bought in the pet shops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX Tweezertrodes Electrodes</td>
			<td>Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0486</td>
			<td>1mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation device</td>
			<td>BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection device</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Wall Borosillicate Glass Capillary</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0766</td>
			<td>Model No: G100-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10056-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Joystick micromanipulator</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>MN - 151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Needle holder comes together with the injection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle pulling device</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>Model No: PC-10</td>
			<td>The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One International</td>
			<td>633161</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation method for in vivo delivery of plasmid dna in the adult zebrafish telencephalon

Elektroporasyon, hücre zarında geçici gözenekler oluşturmak ve geçirgenliğini artırmak için hücrelere elektriksel bir alanın uygulandığı ve böylece hücreye farklı moleküllerin sokulmasını sağlayan bir transfeksiyon yöntemidir. Bu yazıda, elektroporasyon ependymoglial hücrelere plazmidler tanıtmak için kullanılır, hangi yetişkin zebrabalığı telencephalon ventriküler bölge hattı. Bu hücrelerin bir kısmı kök hücre özelliklerini gösterir ve zebra balığı beyninde yeni nöronlar üretir; bu nedenle, nörogenez ve rejenerasyon rollerini belirlemek için davranışlarını incelemek esastır. Plazmidlerin elektroporasyon yoluyla piyasaya sürülmesi, tek bir ependymoglial hücrenin uzun süreli etiketlemesini ve izlenmesini sağlar. Ayrıca, Cre rekombinaz veya Cas9 gibi plazmidler tek ependymoglial hücrelere teslim edilebilir, bu da gen rekombinasyonunu veya gen düzenlemesini sağlar ve hücrenin otonom gen fonksiyonunu kontrollü, doğal Ortam. Son olarak, bu ayrıntılı, adım adım elektroporasyon protokolü tek ependymoglial hücrelerin çok sayıda içine plazmidlerin başarılı giriş elde etmek için kullanılır.

Açıklanan elektroporasyon yöntemi, zebrabalığı telensefalonsunda yüzeysel olarak bulunan ve dorsal ependymal hücre tabakasının hemen altında bulunan plazmid DNA'sının ependymoglial hücrelere ulaştırılmasını sağlar (Şekil 1A).
Elektroporasyon sonucu pozitif ise, etiketli tek ependymoglial hücreler (Şekil 2A,B'dekikırmızı hücreler) diğer ependymoglial hücr...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon at JoVE.com

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Burada plazmid DNA dağıtımı ve yetişkin zebrabalığı telencephalon ependymoglial hücre etiketleme için bir elektroporasyon yöntemi dir. Bu protokol, tek tek ependymoglial hücreleri görselleştirmek ve izlemek için hızlı ve etkili bir yöntemdir ve çok çeşitli genetik manipülasyonlara elektroporasyon uygulamak için yeni olanaklar sunar.

Yetişkin Zebrafish Telencephalon Plazmid DNA In Vivo Teslim için Elektroporasyon Yöntemi

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

Bu protokol, zebra balığı telencephalon bireysel ependymoglial hücrelerin etiketleme onların uzun vadeli izleme sağlamak için izin verir, hem de bir hücre özerk bir şekilde belirli yolların manipülasyon. Bu tekniğin en büyük avantajı, tek hücreli etiketlemenin hızlı ve verimli bir şekilde etiketlemesine ve hücre özerk bir şekilde gen düzenleme ve sinyal yolu manipülasyonuna olanak sağlamasıdır. Bu yöntem, örneğin hücre delaminasyonu, epitel homeostazın bakımı ve hücre bölünmesinin simetrisi hakkında temel hücre biyolojisi sorularının araştırılmasını sağlar.Cam kılcal damarlar hazırlamak için bir iğne çekme cihazı kullanarak başlayın. Plazmid çözeltisi on mikrolitre ile hazırlanmış cam kılcal doldurmak için microloader ipuçları nı kullanın. Daha sonra iğnenin iğne tutucuya yüklenmesini sağlamak için enjeksiyon cihazındaki kılcal damarı değiştir"e basın.Ardından enjeksiyon cihazını kılcal damarı değiştirip enjekte etme moduna geçin. Daha sonra, dört kat büyütme ile bir stereomikroskop kullanarak, ve Finden forceps, kılcal sadece ucu kesti. Daha sonra plazmid çözeltilerinin iğneden sorunsuz bir şekilde çıktığını doğrulamak için ayak pedalına basınç uygulayın.İğne hazır olduğunda, bir zebra balığını hayvancılık tankından anestezik çözelti bir kapkabına aktarın. Solungaçların hareketi dinilene kadar birkaç dakika bekleyin. İzole edilmiş balık dorsal tarafını stereomikroskop altında önceden ıslak bir süngerin üzerine bastırın ve optik tektumun hemen yanındaki telencephalon'un arka tarafındaki balık kafatasında küçük bir delik oluşturmak için 40 milimetrelik kesme kenarı ve 0,5 milimetre kalınlığında paslanmaz çelik bir kesme mikrobıçağı kullanın.Balığı gerektiği gibi yatırın ve cam kılcal damarUcunu doğru açıyla kafatasına doğru yönlendirerek kılcal ucun delikten nüfuz etmesini kolaylaştırın. Daha sonra, çok dikkatli bir şekilde dorsal ependymal hücre tabakası ile deliğe kılcal damar ucu nu takın, telensefalik ventrikül ulaşana kadar, ve yaklaşık 10 saniye boyunca ayak pedalına basınç uygulayın plazmid çözeltisinin yaklaşık 1 mikrolitre teslim etmek için. Teslimat başarısı ventrikül boyunca yeşil sıvı nın yayılmasını gözlemleyerek teyit edilebilir.Ultrason jel küçük bir miktar ile balık telencephalon kapağı. Plazmid enjekte hayvan Elektroporasyon için, enjeksiyon kurulum dan sünger çıkarın ve ultrason jel içine elektrouçlarıiç tarafı batırın. Balığın kafasını elektrotlar arasına yerleştirin, başın ventral tarafındaki pozitif elektrot ve dorsal taraftaki negatif elektrot.Daha sonra, hala sünger balık vücudunu tutarken, telencephalon karşı hafifçe ve hassas elektrotlar basın ve ayak pedalı ile akım yönetmek, beş darbeler bitene kadar elektrotlar yerinde tutarak. Elektroporasyon başarılı olursa plazmid etiketli tek ependymoglial hücreler plazmid olmayan ependymoglial hücreler arasında görülebilir. Elektroporasyon sürecinin etkinliğine bağlı olarak, ependymoglial hücrelerin daha yüksek veya daha düşük sayıda etiketlenebilir.Bununla birlikte, gösterilen protokol, daha önce yayımlanmış protokollere göre daha fazla sayıda etiketli hücre verir. Etiketli hücrelerin en yüksek yoğunluğu enjekte plazmid sıvı hemisferler arasında dağıtır şekilde nedeniyle her iki yarımkürenin iç ventriküler tarafında çoğunlukla ortaya eğilimindedir unutmayın. Bu videoda, zebrabalığı telensefalon bir yarımkürede 3D olarak sunulmaktadır, radyo süreçleri ile ependymoglial hücreleri, yandan gözlendiğinde macenta bulunmaktadır.Çekirdekleri etiketleyen başka bir plazmid ile birlikte elektroporasyon sayesinde ependymoglial hücrelerin hücre bölünmesi görülebilir. Başarısız elektroporasyon çok düşük sayıda veya hiç etiketli ependymoglial hücreleri ile sonuçlanır. Dorsal ependymal hücreler, ancak, en etiketli olması muhtemeldir.Onların soma kübik daha büyük ve ependymoglial hücre tabakasının bir yan görünümünden belirgin olarak radyo uzatılmış süreçler sahip değildir. tdTomato-mem etiketli hücreler büyük olasılıkla ependymoglia tabakasının üzerinde bulunan ependymal hücrelerdir. Buna karşılık, bireysel ependmyoglial hücrelere plazmid ifade eden bir tdTomato-mem'in tanıtılması, ilk hücre etiketlemesine ek olarak tdTomato-mem ekspresyonuna neden olur.Hatırlanması gereken en önemli şey, kılcal damarın sadece ucunu kesmek ve ependymal tabakayı delmek ve böylece sıvı nın ventrikül boyunca yayılmasıdır. Bu teknik, in vivo görüntüleme yoluyla tek ependymoglial hücrelerin uzun süreli izlenmesini sağlar, ve bu nedenle beyin rejenerasyonu rollerini yanı sıra onların geniş in vivo genetik bağlantı kurulması.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Gentamisin Kaynaklı Sakatlık tarafından Yetişkin Zebra balığı Böbrek Rejenerasyon

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Tavuk İşitsel Organ gen Transferi tarafından<em&gt; Ovo olarak</em&gt; Mikro-elektroporasyon

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Tavuk İşitsel Beyinsapındaki Ovo Elektroporasyonunda

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Nanopartikül aracılı siRNA Gene susturmak yetişkin zebra balığı kalbinde

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Kemik doku Yenileyici prednizolon etkilerini incelemek için yetişkin zebra balığı yaralanma modelleri

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...