Mechanistisch inzicht in de ontwikkeling van TNBS-gemedieerde intestinale fibrose en evaluatie van de remmende effecten van Rapamycine

Dit protocol vertoont zeer vergelijkbare pathofysiologie van Crohns fibrose bij de mens en bespreekt ook de rapamycine-gemedieerde remmende effecten op darmfibrose. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het de ontwikkeling van darmfibrose beschrijft in een zeer korte tijd variërend van vier tot acht weken, wat ons de mogelijkheid geeft om weefselherstel en weefselregeneratie te bestuderen. Dit protocol zal nuttig zijn voor onderzoekers die in een haast om het verkrijgen van het mechanisme van fibrose, en helpen bij het vinden van een betere technologie om interventie te voorspellen voor geassocieerde darmfibrose Crohn's.

Om deze procedure te beginnen, scheert u volwassen muizen rond het nekgebied om ze via blootstelling aan de huid aan TNBS te presensibiliseren. Geniet vervolgens van een cotontenstaafje met TNBS en breng het aan op het geschoren gebied van de nek van de muis. Acht dagen na de sensibilisatie, induceren colitis door intrarectale toediening eenmaal per week, gedurende zes weken.

Om dit te doen, breng vier milligram TNBS in 25% ethanol met behulp van een 100 microliter klysma via een een milliliter spuit bevestigd aan een stalen gavage naald. Geef controlemuizen 100 microliter van 25% ethanol alleen. Na het verdoven van de muizen, intraperitoneally injecteren ofwel rapamycine op twee milligram per kilogram per dag, of een voertuig, of beide, elke weekdag gedurende drie tot zes weken om zowel de controle en TNBS-behandelde muizen.

Gebruik hierna zes weken TNBS post-behandelde muizendarmen voor het analyseren van de extracellulaire testen. Open eerst de dikke darm in de lengterichting in ijskoud HBSS en was de dikke darm in HBSS. Met behulp van steriele schaar, snijd de dikke darm in kleine stukjes die ongeveer vijf centimeter in HBSS.

Breng de kleine dikke darm weefsel stukken naar een 15 milliliter conische buis met 10 milliliter van pre-spijsvertering buffer. Schud de buis bij 100 RPM in een couveuse bij 37 graden Celsius gedurende 20 minuten. Vervolgens passeert u de suspensie door een celzeef van 40 micrometer en gooi het bijgevoegde darmeptheel weg.

Verzamel het resterende weefsel van de zeef en verteer ze verder in de spijsvertering buffer met collagenase Type IV en DNASE1 in 1X HBSS met 5%FBS gedurende 20 minuten in een incubator op 37 graden Celsius tijdens het schudden op 100 RPM. Na deze, vortex de verteerde weefsels voor ongeveer 20 seconden en passeren het door een 40 micrometer cel zeef te verkrijgen lamina propria fracties. Centrifuge de lamina propria fracties op 700 keer G en vier graden Celsius om pellet vaststelling van de cellen.

Maak vervolgens 100 milliliter van zowel 30% als 70% dichtheidgradiënt media-oplossingen. Resuspend de verkregen cellen in 10 milliliter van de 30%-oplossing en overlay dit op de top van vijf milliliter van de 70%-oplossing in een 15 milliliter buis. Centrifuge de helling in een pauze vrije staat op 1.000 keer G en kamertemperatuur.

Verzamel de witte ringfase met de lamina propria lymfocyten, die tussen de 30% en 70% gradiëntlagen zullen liggen. Was de verkregen cellen door ze opnieuw in te brengen in ijskoude HBSS en 10 minuten lang te centrifugeren bij 500 keer G en 10 graden Celsius. Dan resuspend de cellen in FACS buffer.

Voorafgaand aan antilichaam kleuring, eerst blokkeren het celoppervlak van de lamina propria cellen door ze uit te broeden met anti-muis CD16 door 32FC blokker op ijs gedurende 15 minuten. Volgende incubeer de cellen met anti-CX3CR1 PE antilichamen samen met anti-PE microbeads op ijs gedurende 30 minuten om de gebonden cellen vast te leggen, dan was de cellen met FACS buffer. Geef het antilichaam en de kraalgebonden cellen door een magnetische geactiveerde celsorteerkolom in een magnetisch veld om de niet-gebonden cellen te verwijderen.

Was de cellen drie keer met FACS buffer. Verwijder hierna de kolom uit het magnetisch veld en duw de zuiger in de kolom om de kraalgebonden cellen op te leveren. Ten eerste, blokkeer de lamina propria cellen met anti-muis CD16 door 32FC blokker op ijs.

Zeef de cellen door te broeden met anti-CD64, CD11c, CD11b, CX3CR1, Ly6C en MHC Klasse II antilichamen Sorteer vervolgens de cellen met behulp van een FACS flow cytometer zoals beschreven in het tekstprotocol. Lyse de gesorteerde cellen voor de totale RNA voorbereiding en detecteren cytokine en fibrotische markers. Analyseer mRNA expressie van fibrotische markers en inflammatoire cytokine analyse van geïsoleerde eencellige suspensies van magnetische zuivering.

Om te beginnen celoppervlak kleuring en analyse, resuspend tussen 500, 000 en 1 miljoen geïsoleerde lamina propria cellen in 15 milliliter facs buffer. Incubeer de cellen met anti-CD16 door 32 antilichamen bij een verdunning van 1 tot 50 op ijs gedurende 10 minuten. Daarna was je de cellen met 500 microliters ijskoude FACS-buffer om niet-gebonden antilichamen te verwijderen.

Oppervlaktevlek colonische eencellige suspensies met fluorescerende antilichamen bij een verdunning van 1 tot 100 op ijs gedurende 30 minuten. Was de gelabelde cellen twee keer om de niet-gebonden antilichamen te verwijderen met behulp van 500 microliters van ijskoude FACS buffer voor elke wasbeurt. Analyseer vervolgens de gelabelde mononucleaire cellen op basis van stroomcytometer zoals beschreven in het tekstprotocol.

Gebruik een fixatiepermeabilisatieoplossingskit om de met oppervlaktesntained cellen te herstellen en te permeabiliseren om de met oppervlaktesntained cellen te fixeren en te doorgronden volgens de instructies van de fabrikant. Poort de lamina propria cellen zoals beschreven in het tekstprotocol om het intracellulaire niveau van IL-1 beta cytokine te detecteren. Was vervolgens de cellen door facs-buffer toe te voegen en te centrifugeren op 200 keer G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten om overtollige fixatieve buffer te verwijderen.

Herhaal deze was eens. Om het alfagladde spieractin niveau te bepalen, doordringt u eerst cellen met de fixatiepermeabilisatieoplossingkit. Incubeer de cellen met anti-alfa SMA Alexa Fluor 488 antilichamen bij een verdunning van 1 tot 1000 op ijs gedurende 30 minuten.

Was vervolgens de cellen door het toevoegen van FACS buffer en centrifugeren op 200 keer G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten om overtollige fixatieve buffer te verwijderen. Herhaal deze was eens. Voer FACS-analyse uit en poort de cellen zoals beschreven in het tekstprotocol.

In deze studie wordt het TNBS colitis muismodel aangenomen om de onderliggende mechanismen van darmfibrose te bestuderen en toe te helderen. Na zes weken TNBS-behandeling kan worden vastgesteld dat de colonische lengte geleidelijk in de loop van de TNBS-behandeling werd verkort van ongeveer vijf centimeter in de controlegroep tot ongeveer drie centimeter in de TNBS-groep. Om ervoor te zorgen dat het ziektemodel van de TNBS Crohn vergelijkbaar is met het fibrosemodel van de menselijke Crohn en geen artefact is dat verband houdt met de methodologie, worden de fibrotische markers op meerdere niveaus geanalyseerd in een gedetailleerde tijdstudie.

Accumulatie van alfa gladde spieractin positieve cellen en collageen depositie binnen submucosale lagen zijn gemeld in de meeste van de fibrose incidenties en wordt beschouwd als een kenmerk voor fibrotische gebeurtenissen TNBS fibrose te vergelijken met crohn's geassocieerde fibrose, de expressie van fibrose markers en cytokines wordt geanalyseerd in verse weefselbiopsie van het ileum van patiënten met actieve CD of onder remissie. Opmerkelijk is dat de inductie van alfagladheid in positieve lagen en verhoogde collageendepositie in actieve cd-secties wordt gezien. Westerse vlekanalyse wordt uitgevoerd om de inductie van alfaglad spieractin expressie in actieve cd-monsters te bevestigen.

Bovendien wordt significante inductie van fibrosemarkers gedetecteerd door qPCR-analyse. De effecten van rapamycine, een farmacologische remmer van M4-activiteit worden vervolgens geëvalueerd om een mechanisme te bepalen om TNBS-fibrose te beperken. Muizen worden behandeld met zowel TNBS en rapamycine en de niveaus van alfa gladde spier actine en collageen in de colon histologie worden geanalyseerd.

Het is belangrijk om te onthouden om dezelfde hoeveelheid TNBS in te enten aan elke muis en om geïsoleerde lamina propria cellen zo snel mogelijk te verwerken om celverlies te voorkomen en om de levensvatbaarheid van de cel te behouden. Ons protocol details over TNBS fibrose en remissie van fibrose evenals de remmende factor van rapamycine in fibrose vorming. Andere onderzoeker kan geïnteresseerd zijn in het gebruik van deze techniek om een beter medicijn doel voor fibrose en darmkanker te vinden.

Houd er rekening mee dat TNBS een huidirriterende is en dat labjassen moeten worden gedragen tijdens het hanteren om huidcontact te voorkomen.