이 프로토콜은 인간에 있는 Crohn의 섬유증의 높게 비교가능한 병리생리학을 전시하고 또한 장 섬유증에 있는 rapamycin 매개억제 효력을 토론합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 4 주에서 8 주까지 다양한 매우 짧은 시간에 장 섬유증 개발을 설명한다는 것입니다. 이 프로토콜은 섬유증의 기계장치를 얻기 위하여 서두르는 연구원에게 도움이 될 것입니다, Crohn의 관련인된 장 섬유증을 위한 내정간섭을 예측하기 위하여 더 나은 기술을 찾는 것을 돕습니다.
이 절차를 시작하려면 진피 노출을 통해 TNBS에 미리 민감하게 하기 위해 목 부위 주위에 성인 마우스를 면도하십시오. 그런 다음 TNBS로 코튼 면봉을 담그고 마우스 목의 면도 부위에 바하십시오. 8 일 후 감질, 6 주 동안, 주 1 회 내 장 내 관리에 의해 대장염을 유도.
이렇게 하려면 강철 게이지 바늘에 부착 된 1 밀리리터 주사기를 통해 100 마이크로 리터 관종을 사용하여 25 % 에탄올에 4 밀리그램의 TNBS를 적용하십시오. 제어 마우스에게 25%에탄올만 100마이크로리터를 준다. 마우스를 마취한 후, 하루에 킬로그램당 2밀리그램또는 차량 또는 둘 다 평일마다 대조군과 TNBS 처리된 마우스에 라파마이신을 주입한다.
그 후, 세포 외 분석 분석을 위해 6 주 TNBS 후 처리 된 마우스 내장을 사용. 첫째, 얼음 차가운 HBSS에서 세로로 결장치를 열고 HBSS에서 결장세척을 합니다. 멸균 가위를 사용하여 결장을 HBSS에서 약 5센티미터의 작은 조각으로 자른다.
작은 결장 조직 조각을 10 밀리리터의 소화 전 완충제가 들어 있는 15밀리리터 원내 튜브로 옮기다. 인큐베이터에서 100 RPM에서 20분 동안 37도의 인큐베이터에서 튜브를 흔들어 보냅니다. 다음으로, 40 마이크로미터 세포 여과기를 통해 서스펜션을 통과하고 부착된 대장 상피를 폐기한다.
스트레이너에서 남은 조직을 수집하고 1X HBSS에서 콜라게나아제 타입 IV및 DNASE1을 함유한 소화 완충제에서 100 RPM에서 흔들리는 동안 37°C에서 인큐베이터에서 20분 동안 5%FBS를 함유하여 소화합니다. 그 후 소화된 조직을 약 20초 동안 소용돌이치게 하고 40마이크로미터 세포 여과기를 통과하여 라미나 프로프리아 분획을 얻습니다. 라미나 프로프리아 분획을 700배, 섭씨 4도에서 원심분리하여 세포를 아래로 배출합니다.
그런 다음 30%와 70%의 밀도 그라데이션 미디어 솔루션으로 100밀리리터를 만듭니다. 30% 용액의 10 밀리리터에서 얻은 세포를 다시 중단하고 15 밀리리터 튜브에서 70%의 용액 5개 위에 오버레이합니다. 1, 000배 G 및 실온에서 휴식 없는 상태에서 그라데이션을 원심분리합니다.
30%와 70%의 그라데이션 층 사이에 있는 라미나 프로프리아 림프구를 포함하는 백색 고리 상을 수집합니다. 얻어진 세포를 얼음차가운 HBSS로 재연하고 10분 동안 500배 G와 10°C에서 원심분리하여 세척합니다. 그런 다음 FACS 버퍼에서 셀을 다시 일시 중지합니다.
항체 염색 전에, 먼저 15 분 동안 얼음에 32FC 차단제에 의해 항 마우스 CD16로 배양하여 라미나 프로프리아 세포의 세포 표면을 차단한다. 다음으로 항체-CX3CR1 PE 항체와 얼음에 대한 항 PE 마이크로비드를 30분 동안 배양한 다음 FACS 버퍼로 세포를 세척합니다. 자기장에서 자기 활성화 된 세포 정렬 컬럼을 통해 항체 및 비드 바운드 세포를 전달하여 결합되지 않은 세포를 제거합니다.
FACS 버퍼로 셀을 세 번 씻으시면 됩니다. 이 후 자기장에서 컬럼을 제거하고 컬럼의 플런저를 밀어 비드 바운드 셀을 산출합니다. 먼저, 얼음에 32FC 차단제에 의해 항 마우스 CD16로 라미나 프로프리아 세포를 차단한다.
항 CD64, CD11c, CD11b, CX3CR1, Ly6C 및 MHC 클래스 II 항체로 배양하여 세포를 변형한 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 FACS 흐름 사이토미터를 사용하여 세포를 정렬합니다. 총 RNA 준비를 위해 정렬 된 세포를 lyse하고 사이토카인 및 섬유성 마커를 감지합니다. 자기 정화로부터 분리된 단세포 현탁액으로부터 섬유성 마커 및 염증성 사이토카인 분석의 mRNA 발현을 분석한다.
세포 표면 염색 및 분석을 시작하려면 FACS 버퍼의 15 밀리리터에서 500, 000 및 1백만 개의 격리된 라미나 프로프리아 세포를 다시 중단합니다. 10 분 동안 얼음에 1 ~ 50의 희석에서 32 항체에 의해 항 CD16로 세포를 배양한다. 그 후, 500 마이크로리터의 얼음 차가운 FACS 버퍼로 세포를 세척하여 언바운드 항체를 제거하십시오.
30 분 동안 얼음에 1 ~ 100의 희석에서 형광 표지 항체를 가진 표면 얼룩 결장 단세포 현탁액. 각 세척에 대해 500 마이크로리터의 얼음 차가운 FACS 버퍼를 사용하여 불바운드 항체를 제거하기 위해 표지된 세포를 두 번 세척하십시오. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 혈류 세포계에 의해 표지된 단핵 세포를 분석합니다.
세포 내 사이토카인 염색 및 분석을 시작하려면 고정 투과성 솔루션 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 표면 염색 된 세포를 수정하고 투과화하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 라미나 프로프리아 세포를 게이트하여 IL-1 베타 사이토카인의 세포 내 수준을 검출한다. 다음으로, FACS 버퍼를 추가하고 원심분리를 5분 동안 200배 G와 섭씨 4도로 추가하여 세포를 세척하여 과도한 고정 버퍼를 제거합니다.
이 세척을 한 번 반복합니다. 알파 부드러운 근육 액틴 수준을 결정하기 위해 먼저 고정 투과화 솔루션 키트로 세포를 투과화합니다. 항 알파 SMA 알렉사 플루오 488 항체로 세포를 30 분 동안 얼음에 1 - 1000의 희석으로 배양합니다.
그런 다음 FACS 버퍼를 추가하고 원심분리를 200배 G와 섭씨 4도에서 5분간 추가하여 셀을 세척하여 과도한 고정 버퍼를 제거합니다. 이 세척을 한 번 반복합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 FACS 분석을 수행하고 셀의 게이트를 게이트합니다.
이 연구에서 TNBS 대장염 마우스 모델은 장 섬유증의 기본 메커니즘을 연구하고 해명하기 위해 채택됩니다. 6주 간의 TNBS 치료 후, TNBS 처리 과정에서 대장 길이가 TNBS 군에서 약 5cm에서 TNBS 군에서 약 3cm로 점진적으로 단축되는 것을 볼 수 있다. TNBS Crohn의 질병 모형이 인간 크론의 섬유증 모형에 필적하고 방법론과 관련있는 유물이 아니라는 것을 확인하기 위하여, 섬유성 마커는 상세한 타임코스 연구 결과에서 다중 수준에서 분석됩니다.
알파 평활근 활성증 양성 세포 및 아점막 층 내의 콜라겐 증착의 축적은 대부분의 섬유증 발생률에서 보고되었으며, 크론의 관련 섬유증과 TNBS 섬유증을 비교하기 위한 섬유증의 특징으로 간주되며, 섬유증 마커 및 사이토카인의 발현은 활성 환자의 ile또는 환자의 염하에서 생생증으로 분석된다. 놀랍게도, 현저한 유도는 활성 CD 섹션에서 알파 평활근 액틴 양성층및 증가된 콜라겐 증착의 두껍게 하는 것을 볼 수 있다. 서양 블롯 분석은 활성 CD 샘플에서 알파 스무스 근육 액틴 발현의 유도를 확인하기 위해 수행된다.
또한, 섬유증 마커의 유의한 유도는 qPCR 분석에 의해 검출된다. 라파마이신의 효과, M4 활성의 약리 억제제는 TNBS 섬유증을 제한하는 메커니즘을 결정하기 위해 평가된다. 마우스는 TNBS와 라파마이신으로 치료되며 결장 내의 알파 스무스 근육 액틴 및 콜라겐 의 수준을 분석한다.
각 마우스에 동일한 양의 TNBS를 접종하고 세포 손실을 방지하고 세포 생존가능성을 유지하기 위해 가능한 한 빨리 격리된 lamina propria 세포를 처리하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. TNBS 섬유증및 섬유증의 면제에 대한 우리의 프로토콜 세부 사항뿐만 아니라 섬유증 형성에서 라파마이신의 억제 인자. 그밖 연구원은 섬유증과 결장암을 위한 더 나은 약 표적을 찾아기 위하여 이 기술을 사용하여에 흥미있을 지도 모릅니다.
TNBS는 피부 자극제이며 피부 접촉을 피하기 위해 취급 하는 동안 실험실 코트를 착용해야 한다는 것을 기억하십시오.
