Mekanistisk Insight inn i utviklingen av TNBS-mediert intestinal fibrose og evaluere den hemmende effekten av Rapamycin

Denne protokollen viser svært sammenlignbar patofysiologi av Crohns fibrose hos mennesker og diskuterer også rapamycin-mediert hemmende effekter på intestinal fibrose. Den største fordelen med denne protokollen er at den beskriver intestinal fibroseutvikling på svært kort tid som varierer fra fire til åtte uker, noe som gir oss muligheten til å studere vevreparasjon og vevregenerering. Denne protokollen vil være nyttig for forskere som er i et rush for å få mekanismen for fibrose, og bidra til å finne en bedre teknologi for å forutsi intervensjon for Crohns tilknyttede tarmfibrose.

For å begynne denne prosedyren, barber voksne mus rundt nakkeområdet for å pre-sensibilisere dem til TNBS via dermal eksponering. Deretter suge en coton vattpinne med TNBS og bruke den til barbert område av musens nakke. Åtte dager etter sensibilisering, indusere kolitt ved intrarektal administrasjon en gang i uken, i seks uker.

For å gjøre dette, påfør fire milligram TNBS i 25% etanol ved hjelp av en 100 mikroliter klyster via en en en milliliter sprøyte festet til en stål gavage nål. Gi kontrollmus 100 mikroliter kun 25 % etanol. Etter bedøving av musene injiserer intraperitoneally enten rapamycin ved to milligram per kilo per dag, eller et kjøretøy, eller begge deler, hver ukedag i tre til seks uker til både kontroll og TNBS-behandlede mus.

Etter dette, bruk seks ukers TNBS postbehandlede mus tarmene for å analysere de ekstracellulære analysene. Først åpner du tykktarmen langsgående i iskald HBSS og vask tykktarmen i HBSS. Bruk steril saks, kutt tykktarmen i små biter som er omtrent fem centimeter i HBSS.

Overfør de små kolonvevsbitene til et konisk rør på 15 milliliter som inneholder 10 milliliter pre-fordøyelsesbuffer. Rist røret ved 100 RPM i en inkubator ved 37 grader Celsius i 20 minutter. Deretter passerer du suspensjonen gjennom en 40 mikrometercellesil, og kast det vedlagte kolonepitelet.

Samle gjenværende vev fra silen og fordøye dem videre i fordøyelsesbufferen som inneholder kollagnase Type IV og DNASE1 i 1X HBSS med 5% FBS i 20 minutter i en inkubator ved 37 grader Celsius mens risting ved 100 RPM. Etter dette, vortex fordøyd vev i ca 20 sekunder og passere den gjennom en 40 mikrometer celle sil for å få lamina propria fraksjoner. Sentrifuge lamina propria fraksjoner på 700 ganger G og fire grader Celsius å pellet ned cellene.

Deretter lager du 100 milliliter med både 30 % og 70 % med graderingsmedieløsninger med tetthet. Resuspend de oppnådde cellene i 10 milliliter av 30%-løsningen og overlegg dette på toppen av fem milliliter av 70% oppløsningen i et 15 milliliter rør. Sentrifuger gradienten i en pausefri stand ved 1000 ganger G og romtemperatur.

Samle den hvite ringfasen som inneholder lamina propria lymfocytter, som vil være mellom 30%og 70% gradient lag. Vask de oppnådde cellene ved å bruke dem i iskalde HBSS og sentrifugering ved 500 ganger G og 10 grader Celsius i 10 minutter. Deretter bruker cellene på igjen i FACS-bufferen.

Før antistofffarging, må du først blokkere celleoverflaten av lamina propria-cellene ved å inkubere dem med anti-mus CD16 med 32FC-blokkering på is i 15 minutter. Deretter inkubere cellene med anti-CX3CR1 PE antistoffer sammen med anti-PE mikroperler på is i 30 minutter for å fange de bundne cellene, og vask deretter cellene med FACS-buffer. Send antistoffet og perlebundne celler gjennom en magnetisk aktivert cellesorteringskolonne i et magnetfelt for å fjerne de ubundne cellene.

Vask cellene tre ganger med FACS-buffer. Etter dette fjerner du kolonnen fra magnetfeltet og skyver stempelet i kolonnen for å gi de perlebundne cellene. Først blokkere lamina propria celler med anti-mus CD16 av 32FC blokkering på is.

Stamme cellene ved å inkubere med anti-CD64, CD11c, CD11b, CX3CR1, Ly6C og MHC klasse II antistoffer Deretter sortere cellene ved hjelp av en FACS flyt cytometer som beskrevet i tekstprotokollen. Lyse de sorterte cellene for totalt RNA forberedelse og oppdage cytokin og fibrotiske markører. Analyser mRNA-uttrykk for fibrotiske markører og inflammatorisk cytokinanalyse fra isolerte enkeltcellesuspensjoner fra magnetisk rensing.

For å begynne celleoverflatefarging og analyse, gjenbruke mellom 500, 000 og 1 million isolerte lamina propria celler i 15 milliliter FACS buffer. Inkuber cellene med anti-CD16 med 32 antistoffer ved en fortynning på 1 til 50 på is i 10 minutter. Etter dette vasker du cellene med 500 mikroliter iskald FACS-buffer for å fjerne ubundne antistoffer.

Overflate flekkkoloniske encellede suspensjoner med fluorescerende merkede antistoffer ved en fortynning på 1 til 100 på is i 30 minutter. Vask de merkede cellene to ganger for å fjerne de ubundne antistoffene ved hjelp av 500 mikroliter iskald FACS-buffer for hver vask. Analyser deretter de merkede mononukleære cellene ved å strømme cytometer som beskrevet i tekstprotokollen.

For å begynne intracellulær cytokinfarging og analyse, bruk et løsningssett for fikseringspermeabilisering for å fikse og gjennomsyre de overflatebeisede cellene i henhold til produsentens instruksjoner. Gate lamina propria cellene som beskrevet i tekstprotokollen for å oppdage intracellulært nivå av IL-1 beta cytokin. Deretter vasker du cellene ved å legge til FACS-buffer og sentrifugering ved 200 ganger G og fire grader Celsius i fem minutter for å fjerne overflødig fikseringsbuffer.

Gjenta denne vasken én gang. For å bestemme alfa glatt muskel actin nivå, først permeabilize celler med fiksering permeabilisering løsning kit. Inkuber cellene med anti-alfa SMA Alexa Fluor 488 antistoffer ved en fortynning på 1 til 1000 på is i 30 minutter.

Vask deretter cellene ved å legge til FACS-buffer og sentrifugering ved 200 ganger G og fire grader Celsius i fem minutter for å fjerne overflødig fikseringsbuffer. Gjenta denne vasken én gang. Utfør FACS-analyse og gate cellene som beskrevet i tekstprotokollen.

I denne studien er TNBS kolittmusmodellen vedtatt for å studere og belyse de underliggende mekanismene for tarmfibrose. Etter seks uker med TNBS-behandling kan det ses at kolonlengden forkortet gradvis i løpet av TNBS-behandlingen fra omtrent fem centimeter i kontrollgruppen til omtrent tre centimeter i TNBS-gruppen. For å sikre at TNBS Crohns sykdomsmodell kan sammenlignes med den menneskelige Crohns fibrosemodell og ikke er en artefakt relatert til metodikken, analyseres de fibrotiske markørene på flere nivåer i en detaljert timecoursestudie.

Akkumulering av alfa glatt muskel handlingin positive celler og kollagen deponering i submucosal lag har blitt rapportert i de fleste av fibrose forekomster og anses som et kjennetegn for fibrotiske hendelser For å sammenligne TNBS fibrose med Crohns tilknyttede fibrose, uttrykket av fibrose markører og cytokiner analyseres i frisk vev biopsi fra ileum av pasienter med aktiv CD eller under remisjon. Bemerkelsesverdig, merket induksjon er sett av fortykning av alfa glatt muskel handlingi positive lag og økt kollagen deponering i aktive CD-seksjoner. Western blot analyse utføres for å bekrefte induksjon av alfa glatt muskel actin uttrykk i aktive CD-prøver.

I tillegg oppdages signifikant induksjon av fibrosemarkører ved qPCR-analyse. Effektene av rapamycin, en farmakologisk hemmer av M4-aktivitet evalueres deretter for å bestemme en mekanisme for å begrense TNBS fibrose. Mus behandles med både TNBS og rapamycin og nivåene av alfa glatt muskel actin og kollagen i kolon histologi analyseres.

Det er viktig å huske å inokulere samme mengde TNBS til hver mus og å behandle isolerte lamina propria celler så snart som mulig for å unngå celletap, samt for å opprettholde celle levedyktighet. Våre protokolldetaljer om TNBS fibrose og remisjon av fibrose samt den hemmende faktoren av rapamycin i fibrosedannelse. Andre forskere kan være interessert i å bruke denne teknikken for å finne et bedre legemiddelmål for fibrose og tykktarmskreft.

Husk at TNBS er en hudirriterende og laboratoriefrakker bør brukes under håndtering for å unngå hudkontakt.