Mekanistisk insikt i utvecklingen av TNBS-medierad intestinal fibros och utvärdering av de hämmande effekterna av rapamycin

Detta protokoll uppvisar mycket jämförbara Patofysiologi av Crohns fibros i mänskliga och även diskuterar de rapamycin-medierad hämmande effekter på intestinal fibros. Den största fördelen med detta protokoll är att det beskriver intestinal fibros utveckling på mycket kort tid varierar från fyra till åtta veckor, som ger oss möjlighet att studera vävnad reparation och vävnad regenerering. Detta protokoll kommer att vara till hjälp för forskare som har bråttom att få mekanismen för fibros, och hjälpa till att hitta en bättre teknik för att förutsäga ingripande för Crohns associerade intestinalfibros.

Till att börja detta förfarande, raka vuxna möss runt halsen området för att pre-sensibilisera dem till TNBS via dermal exponering. Blötlägg sedan en coton-svabb med TNBS och applicera den på det rakade området av musens hals. Åtta dagar efter sensibilisering, inducera kolit genom intrarectal administration en gång i veckan, i sex veckor.

För att göra detta, tillämpa fyra milligram TNBS i 25%etanol med hjälp av en 100 microliter enema via en milliliter spruta fäst vid en stål sondmatning nål. Ge kontrollmöss 100 mikroliter av endast 25%etanol. Efter att ha sövt mössen injicerar intraperitoneally antingen rapamycin på två milligram per kilo per dag, eller ett fordon, eller båda, varje vardag i tre till sex veckor till både kontroll och TNBS-behandlade möss.

Efter detta, använd sex veckors TNBS postbehandlade möss tarmar för att analysera de extracellulära analyserna. Öppna först tjocktarmen i längdled i iskall HBSS och tvätta tjocktarmen i HBSS. Skär med steril sax tjocktarmen i små bitar som är cirka fem centimeter i HBSS.

Överför de små kolonvävnadsbitarna till ett koniskt rör på 15 milliliter som innehåller 10 milliliter försmältningsbuffert. Skaka röret vid 100 RPM i en inkubator vid 37 grader Celsius i 20 minuter. Därefter passerar suspensionen genom en 40 mikrometer cell sil, och kassera den bifogade colonic epitel.

Samla den återstående vävnaden från silen och smälta dem ytterligare i digestionsbuffert som innehåller kollagenas Typ IV och DNASE1 i 1X HBSS med 5%FBS i 20 minuter i en inkubator vid 37 grader Celsius medan du skakar vid 100 RPM. Efter detta, vortexa de smälta vävnaderna i cirka 20 sekunder och passera den genom en 40 mikrometer cell sil för att erhålla lamina propria fraktioner. Centrifugera lamina propria fraktionerna vid 700 gånger G och fyra grader Celsius för att pelleta ner cellerna.

Sedan gör du 100 milliliter av både 30%och 70%densitet gradient medielösningar. Resuspend de erhållna cellerna i 10 milliliter av 30%-lösningen och överlagra detta ovanpå fem milliliter av 70%lösningen i en 15 milliliter tub. Centrifugera lutningen i ett breakfritt skick vid 1, 000 gånger G och rumstemperatur.

Samla den vita ringen fasen som innehåller lamina propria lymfocyter, som kommer att vara mellan 30%och 70%gradient skikt. Tvätta de erhållna cellerna genom att resuspending dem i iskall HBSS och centrifugering vid 500 gånger G och 10 grader Celsius i 10 minuter. Sedan återanvänder cellerna i FACS buffert.

Före antikroppsfärgning, först blockera cellytan av lamina propria cellerna genom att inkubera dem med anti-mus CD16 av 32FC blockerare på is i 15 minuter. Nästa inkubera cellerna med anti-CX3CR1 PE antikroppar tillsammans med anti-PE mikropärlor på is i 30 minuter för att fånga de bundna cellerna, sedan tvätta cellerna med FACS buffert. Passera antikroppen och pärla-bundna celler genom en magnetisk aktiverad cell sortering kolumn i ett magnetfält för att ta bort de obundna celler.

Tvätta cellerna tre gånger med FACS-buffert. Efter detta, ta bort kolonnen från magnetfältet och tryck kolven i kolonnen för att ge pärlbundna celler. Först blockera lamina propria celler med anti-mus CD16 av 32FC blockerare på is.

Sila cellerna genom att inkubera med anti-CD64, CD11c, CD11b, CX3CR1, Ly6C och MHC Klass II antikroppar Sortera sedan cellerna med hjälp av en FACS flödescytometer som beskrivs i textprotokollet. Lyse de sorterade cellerna för total RNA-beredning och detektera cytokin och fibrotiska markörer. Analysera mRNA uttryck av fibrotiska markörer och inflammatorisk cytokinanalys från isolerade single cell suspensioner från magnetisk rening.

För att börja cellytan färgning och analys, resuspend mellan 500, 000 och 1 miljon isolerade lamina propria celler i 15 milliliter av FACS buffert. Inkubera cellerna med anti-CD16 med 32 antikroppar vid en spädning av 1 till 50 på is i 10 minuter. Efter detta tvätta cellerna med 500 mikroliter av iskall FACS buffert för att avlägsna obundna antikroppar.

Ytfläck colonic single cell suspensions med fluorescerande-märkta antikroppar vid en spädning av 1 till 100 på is i 30 minuter. Tvätta de märkta cellerna två gånger för att avlägsna de obundna antikropparna med hjälp av 500 mikroliter iskall FACS buffert för varje tvätt. Analysera sedan de märkta mononukleära cellerna genom flödescytometer som skisseras i textprotokollet.

För att börja intracellulära cytokin färgning och analys, använd en fixering permeabilization lösning kit för att fastställa och permeabilisera de ytbestämda cellerna enligt tillverkarens anvisningar. Gate lamina propria cellerna som beskrivs i textprotokollet att upptäcka den intracellulära nivån av IL-1 beta cytokin. Därefter tvätta cellerna genom att lägga TILL FACS buffert och centrifugering vid 200 gånger G och fyra grader Celsius i fem minuter för att ta bort överskott fixativ buffert.

Upprepa denna tvätt en gång. För att bestämma alfa glatt muskulaturen aktin nivå, först permeabilize celler med fixeringspermeabilisering lösningssats. Inkubera cellerna med anti-alfa SMA Alexa Fluor 488 antikroppar vid en spädning av 1 till 1000 på is i 30 minuter.

Tvätta sedan cellerna genom att lägga till FACS buffert och centrifugering vid 200 gånger G och fyra grader Celsius i fem minuter för att ta bort överskott fixativ buffert. Upprepa denna tvätt en gång. Utför FACS-analys och grind cellerna som beskrivs i textprotokollet.

I denna studie TNBS kolit mus modellen antas för att studera och belysa de underliggande mekanismerna för intestinal fibros. Efter sex veckors TNBS-behandling kan man se att den koloniska längden förkortas successivt under loppet av TNBS behandling från cirka fem centimeter i kontrollgruppen till cirka tre centimeter i TNBS-gruppen. För att säkerställa att TNBS Crohns sjukdomsmodell är jämförbar med den mänskliga Crohns fibrosmodell och inte är en artefakt relaterad till metodiken, analyseras de fibrotiska markörerna på flera nivåer i en detaljerad tidsstudie.

Ackumulering av alfa glatt muskel aktin positiva celler och kollagen nedfall inom submucosal lager har rapporterats i de flesta av fibros incidensen och betraktas som ett kännetecken för fibrotiska händelser Att jämföra TNBS fibros med Crohns associerade fibros, är uttrycket av fibros markörer och cytokiner analyseras i färska vävnad biopsi från ileum av patienter med aktiv CD eller under eftergift. Anmärkningsvärt, märkt induktion ses av förtjockning av alfa glatt muskel aktin positiva lager och ökad kollagen nedfall i aktiva CD sektioner. Western blot analys utförs för att bekräfta induktion av alfa glatt muskel aktin uttryck i aktiva CD prover.

Dessutom upptäcks signifikant induktion av fibrosmarkörer genom qPCR-analys. Effekterna av rapamycin, en farmakologisk hämmare av M4 aktivitet utvärderas sedan för att bestämma en mekanism för att begränsa TNBS fibros. Möss behandlas med både TNBS och rapamycin och nivåerna av alfa glatta muskel aktin och kollagen i kolon histologi analyseras.

Det är viktigt att komma ihåg att inokulera samma mängd TNBS till varje mus och att bearbeta isolerade lamina propria celler så snart som möjligt för att undvika cellförlust samt att upprätthålla cellens livskraft. Våra protokoll detaljer om TNBS fibros och eftergift av fibros samt den hämmande faktorn av rapamycin i fibros bildas. Andra forskare kan vara intresserade av att använda denna teknik för att hitta ett bättre läkemedel mål för fibros och tjocktarmscancer.

Kom ihåg att TNBS är en hudirriterande och labbrockar ska bäras under hanteringen för att undvika hudkontakt.