Name: chronic salmonella infection induced intestinal fibrosis
Uploaded: 2019-09-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis at JoVE.com

Agradecemos a Ingrid Barta pelos serviços de histologia.

Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de cuidados com animais da Universidade da Colúmbia Britânica.
1. preparação de culturas de Salmonella typhimurium ΔAroA para gavagem oral de camundongos
<ol><li>De um estoque congelado de glicerol de S. Typhimurium ΔAroA, prepare uma placa de raia usando o agar LB contendo 100 μg/mL de estreptomicina com um laço de inocular estéril. Incubar durante a noite a 37 ° c. As placas de raia podem ser armazenada...

<ol>
	<li>Danese, S., Fiocchi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulcerative+colitis.">Ulcerative colitis.</a> New England Journal of Medicine. 365 (18), 1713-1725 (2011).</li><li>Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crohn's+disease.">Crohn's disease.</a> The Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).</li><li>Knights, D., Lassen, K. G., Xavier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+inflammatory+bowel+disease+pathogenesis:+linking+host+genetics+and+the+microbiome.">Advances in inflammatory bowel disease pathogenesis: linking host genetics and the microbiome.</a> Gut. 62 (10), 1505-1510 (2013).</li><li>Xavier, R. J., Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+pathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease.">Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).</li><li>Cho, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+and+immunopathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease.">The genetics and immunopathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (6), 458-466 (2008).</li><li>Ogura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+frameshift+mutation+in+NOD2+associated+with+susceptibility+to+Crohn's+disease.">A frameshift mutation in NOD2 associated with susceptibility to Crohn's disease.</a> Nature. 411 (6837), 603-606 (2001).</li><li>Jostins, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-microbe+interactions+have+shaped+the+genetic+architecture+of+inflammatory+bowel+disease.">Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).</li><li>Rivas, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+resequencing+of+GWAS+loci+identifies+independent+rare+variants+associated+with+inflammatory+bowel+disease.">Deep resequencing of GWAS loci identifies independent rare variants associated with inflammatory bowel disease.</a> Nature Genetics. 43 (11), 1066-1073 (2011).</li><li>Rioux, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+identifies+new+susceptibility+loci+for+Crohn+disease+and+implicates+autophagy+in+disease+pathogenesis.">Genome-wide association study identifies new susceptibility loci for Crohn disease and implicates autophagy in disease pathogenesis.</a> Nature Genetics. 39 (5), 596-604 (2007).</li><li>Uhlig, H. H., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+intestinal+inflammation+as+tools+to+understand+the+pathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease.">Mouse models of intestinal inflammation as tools to understand the pathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> European Journal of Immunology. 39 (8), 2021-2026 (2009).</li><li>Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+the+microbiota+on+the+pathogenesis+of+IBD:+lessons+from+mouse+infection+models.">The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).</li><li>Grassl, G. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+enteric+Salmonella+infections.">Pathogenesis of enteric Salmonella infections.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24 (1), 22-26 (2008).</li><li>Barthel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+of+mice+with+streptomycin+provides+a+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+colitis+model+that+allows+analysis+of+both+pathogen+and+host.">Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host.</a> Infection and Immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).</li><li>Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K., Vallance, B. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Enteric+Salmonella+Infection+in+Mice+Leads+to+Severe+and+Persistent+Intestinal+Fibrosis.">Chronic Enteric Salmonella Infection in Mice Leads to Severe and Persistent Intestinal Fibrosis.</a> Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).</li><li>Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aromatic-dependent+Salmonella+typhimurium+are+non-virulent+and+effective+as+live+vaccines.">Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines.</a> Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).</li><li>Valdez, Y., Ferreira, R. B., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+Salmonella+virulence+and+host+resistance.">Molecular mechanisms of Salmonella virulence and host resistance.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 337, 93-127 (2009).</li><li>Valdez, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nramp1+drives+an+accelerated+inflammatory+response+during+Salmonella-induced+colitis+in+mice.">Nramp1 drives an accelerated inflammatory response during Salmonella-induced colitis in mice.</a> Cellular Microbiology. 11 (2), 351-362 (2009).</li><li>Lo, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+receptor+RORalpha+and+group+3+innate+lymphoid+cells+drive+fibrosis+in+a+mouse+model+of+Crohn's+disease.">The orphan nuclear receptor RORalpha and group 3 innate lymphoid cells drive fibrosis in a mouse model of Crohn's disease.</a> Science Immunology. 1 (3), eaaf8864 (2016).</li><li>Burke, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrogenesis+in+Crohn's+disease.">Fibrogenesis in Crohn's disease.</a> American Journal of Gastroenterology. 102 (2), 439-448 (2007).</li><li>Hogan, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+and+regeneration+of+the+respiratory+system:+complexity,+plasticity,+and+mechanisms+of+lung+stem+cell+function.">Repair and regeneration of the respiratory system: complexity, plasticity, and mechanisms of lung stem cell function.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 123-138 (2014).</li><li>Fiocchi, C., Lund, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Themes+in+fibrosis+and+gastrointestinal+inflammation.">Themes in fibrosis and gastrointestinal inflammation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (5), G677-G683 (2011).</li><li>Rieder, F., Fiocchi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+fibrosis+in+IBD&#8212;a+dynamic,+multifactorial+process.">Intestinal fibrosis in IBD&#8212;a dynamic, multifactorial process.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 6 (4), 228-235 (2009).</li><li>Bouguen, G., Peyrin-Biroulet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery+for+adult+Crohn's+disease:+what+is+the+actual+risk?.">Surgery for adult Crohn's disease: what is the actual risk?.</a> Gut. 60 (9), 1178-1181 (2011).</li><li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+fibrosis.">Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.</a> The Journal of Pathology. 214 (2), 199-210 (2008).</li><li>Junqueira, L. C., Bignolas, G., Brentani, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picrosirius+staining+plus+polarization+microscopy,+a+specific+method+for+collagen+detection+in+tissue+sections.">Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections.</a> Histochem J. 11 (4), 447-455 (1979).</li><li>Lo, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-22+Preserves+Gut+Epithelial+Integrity+and+Promotes+Disease+Remission+during+Chronic+Salmonella+Infection.">IL-22 Preserves Gut Epithelial Integrity and Promotes Disease Remission during Chronic Salmonella Infection.</a> Journal of Immunology. 202 (3), 956-965 (2019).</li><li>Fichtner-Feigl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+IL-13+triggers+TGF-beta1-dependent+tissue+fibrosis+in+chronic+2,4,6-trinitrobenzene+sulfonic+acid+colitis.">Induction of IL-13 triggers TGF-beta1-dependent tissue fibrosis in chronic 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid colitis.</a> Journal of Immunology. 178 (9), 5859-5870 (2007).</li><li>Fichtner-Feigl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-13+signaling+via+IL-13R+alpha2+induces+major+downstream+fibrogenic+factors+mediating+fibrosis+in+chronic+TNBS+colitis.">IL-13 signaling via IL-13R alpha2 induces major downstream fibrogenic factors mediating fibrosis in chronic TNBS colitis.</a> Gastroenterology. 135 (6), e2001-e2007 (2013).</li><li>Johnson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+fibrosis+is+reduced+by+early+elimination+of+inflammation+in+a+mouse+model+of+IBD:+impact+of+a+&amp;#34;Top-Down&amp;#34;+approach+to+intestinal+fibrosis+in+mice.">Intestinal fibrosis is reduced by early elimination of inflammation in a mouse model of IBD: impact of a &amp;#34;Top-Down&amp;#34; approach to intestinal fibrosis in mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 18 (3), 460-471 (2012).</li><li>Darfeuille-Michaud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+adherent-invasive+Escherichia+coli+associated+with+ileal+mucosa+in+Crohn's+disease.">High prevalence of adherent-invasive Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn's disease.</a> Gastroenterology. 127 (2), 412-421 (2004).</li><li>Small, C. L., Reid-Yu, S. A., McPhee, J. B., Coombes, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+infection+with+Crohn's+disease-associated+adherent-invasive+Escherichia+coli+leads+to+chronic+inflammation+and+intestinal+fibrosis.">Persistent infection with Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli leads to chronic inflammation and intestinal fibrosis.</a> Nature Communications. 4, 1957 (2013).</li><li>Imai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellin-mediated+activation+of+IL-33-ST2+signaling+by+a+pathobiont+promotes+intestinal+fibrosis.">Flagellin-mediated activation of IL-33-ST2 signaling by a pathobiont promotes intestinal fibrosis.</a> Mucosal Immunology. , (2019).</li></ol>

Nossa compreensão da patogénese de IBD foi aumentada extremamente por modelos do rato da inflamação intestinal. Embora tais modelos individuais não Recapitulem todas as características da doença humana complexa e multifatorial, têm sido úteis na identificação de características-chave da progressão da doença. As estenoses fibrotic associadas com o IBD remanesce uma necessidade clínica não atendidas principal porque os tratamentos atuais são ineficazes em inverter o desenvolvimento da doença. Além disso,...

A colite ulcerosa (UC) e a doença de Crohn (DC) são as duas principais formas de DII e são caracterizadas como distúrbios inflamatórios crônicos e recidivantes do trato gastrointestinal 1,2. Estes distúrbios têm um grande impacto na qualidade de vida dos pacientes. Os sintomas de DII incluem dor abdominal, diarreia, náuseas, perda de peso, febre e fadiga3. Estudos recentes identificaram fatores genéticos e ambientais que contribuem para a patogênese da doença; Pensa-se que tais fatores de risco contribuem para a ruptura da barreira epitelial, resultando na translocação ou Superamostragem de antígenos luminais4. Como consequência, isso inicia uma resposta inflamatória aberrante à flora comensal mediada pelas células imunológicas intestinais4. As características das complicações associadas ao IBD podem estender-se a sítios além do trato gastrointestinal que afetam váriosórgãos, incluindoarticulações, pele e fígado1,2. As características da UC incluem inflamação severa e difusa tipicamente localizada no cólon1. A patologia da doença afeta a mucosa e a submucosa do intestino, resultando em ulcerações mucosas superficiais1. Por outro lado, a DC pode afetar qualquer parte do trato gastrointestinal, embora a evidência de doença seja comumente encontrada no cólon e no íleo distal2. Além disso, a inflamação em CD é transmural, afetando todas as camadas da parede intestinal2.
Vários genes de suscetibilidade ao IBD que foram identificados indicariam que a desregulação da barreira epitelial ou imunidade são contribuintes críticos para a progressão da doença5. As mutações no domínio 2 do oligomerização do nucleotide (NOD2) expressada por monócitos foram encontradas para ser associadas com a susceptibilidade aumentada ao CD; Isto destaca uma ligação entre a deteção imune inata alterada de componentes bacterianos e a doença6. Os estudos mais recentes da associação do genoma-largo (GWAS) revelaram as vias adicionais envolvidas potencial na patogénese de IBD que incluem variações genéticas em: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R caminhos dependentes ligada à imunidade adaptativa , MUC1, MUC19, e PTGER4 na manutenção da barreira intestinal, e autofagia mediada por ATG16L7,8,9. Embora estes estudos de genética de base populacional tenham melhorado a nossa compreensão do IBD, os alelos de susceptibilidade sozinhos são provavelmente insuficientes para iniciar e sustentar a doença crónica3. Outros fatores não genéticos, incluindo alterações na composição do microbioma intestinal e redução da diversidade, têm sido associados à inflamação intestinal. No entanto, não está claro se a disbiose intestinal precede ou é a consequência de respostas imunes disreguladas3. Embora a etiologia do IBD permaneça obscura, nossa compreensão da patogénese da doença foi aumentada por modelos experimentais do rato da inflamação intestinal10,11. Esses modelos individualmente não representam plenamente a complexidade da doença humana, mas são valiosos para elucidar as vias fisiopatológicas que podem ser relevantes para o DII e para a validação de estratégias terapêuticas tentativas10, o 11. Tais modelos de mouse tipicamente dependem do início da inflamação por indução química ou infecção, transferência de células imunes, ou manipulação genética. Além disso, essas estratégias geralmente envolvem perturbações na integridade epitelial ou modulação da imunidade inata ou adaptativa.
Salmonella enterica Sorovares são patógenos intestinais que podem infectar humanos e camundongos. Após a ingestão, Salmonella pode colonizar o intestino por invasão direta de epithelia, células M, ou antígeno apresentando células12. Camundongos infectados por via oral com S. Typhimurium conduz à colonização primeiramente de locais sistemáticos tais como o spleen e os nós de linfa mesentérica com abundância relativamente baixa no intervalo do soldado12. No entanto, o pré-tratamento de camundongos com estreptomicina aumenta a eficiência da colonização de Salmonella do intestino diminuindo os efeitos protetores do hospedeiro da microbiota normal13. As características patológicas deste modelo incluem o rompimento ou o ulceração da barreira epithelial, do recrutamento do granulocyte, e do edema severo13. Alternativamente, a infecção com a vacina grau S. O mutante de typhimurium δaroa conduz à colonização crônica do ceco e dos dois pontos que persiste até o dia 40 após a infecção14. O S. A estirpe de typhimurium ΔAroA tem um defeito na biossíntese de aminoácidos aromáticos; Isto rende a estirpe do mutante avirulent e pode ser utilizado como uma vacina altamente eficaz15. A infecção oral nos ratos conduz a uma resposta inflamatório associada Th1-e Th17-cytokine, a remodelação extensiva do tecido, e ao depósito do colagénio. A patologia tecidual está associada a níveis elevados de fator pró-fibrótico, como TGF-β1, CTGF e IGF14. A cicatriz fibrótica transmural relatada neste modelo é reminiscente das formações de estenose observadas frequentemente em IBD. A indução de fibrose por Salmonella requer virulência codificada pelas ilhas de patogenicidade de Salmonella (SPI)-1 e 2 12. É importante, este S. O modelo de infecção por tymphimurium ΔAroA é um sistema útil para o estudo de respostas fibróticas em camundongos mutantes mantidos em um fundo C57/Bl6. A cepa C57/Bl6 é extremamente sensível a S. Infecção de typhiumurim SL1344 devido a uma mutação da perda--função no gene que codifica a proteína de macrófago resistência-associada natural (nramp)-116,17. Nós encontramos que as pilhas lymphoid inata Il-17a e rorα-dependentes são contribuintes importantes à patogénese neste modelo18.
Uma complicação importante do CD é o depósito disregulado e excessivo da matriz extracelular (ECM) que inclui o colagénio2,19. Embora o trato gastrointestinal tenha uma capacidade relativamente alta de regeneração, a cicatrização fibrótica pode surgir devido a respostas decicatrização deferidas não resolvidasque estão associadas à inflamação crônica e severa20,21. Em CD, isso resulta em efeitos deletérios na arquitetura tecidual, levando a comprometimento significativode órgãos21,22. A natureza transmural da inflamação observada em CD, em última análise, precede o espessamento da parede intestinal associada à estenose sintomática ou à formação de estenoses21. Cerca de um terço dos pacientes com CD necessitam de ressecção intestinal para esta complicação22. Não existem terapias antifibróticas efetivas no IBD, dado que o uso de imunossupressores como a azatioprina ou antitnfα biológica não tem impacto ou apenas reduziu modestamente a exigência de intervenções cirúrgicas19,20 . Quando a fibrose for pensada ser a conseqüência da inflamação crônica, as pilhas da origem mesenquimais tais como fibroblasto e pericitos são pensadas para ser as fontes celulares preliminares do ECM em cicatrizes fibrótica21,24. Crônica S. A infecção por ΔAroA de typhimurium é um modelo robusto do rato da fibrose intestinal que pode oferecer introspecções na patogénese de características CD-like.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 ml round bottom safe lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-Orifice Pipet Tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>2707134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL megablock plates</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1972.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gavage needles</td>
			<td>FST</td>
			<td>18061-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer mill</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>MM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chronic salmonella infection induced intestinal fibrosis

A fibrose tecidual caracterizada pelo acúmulo patológico de matriz extracelular, como o colágeno, é o desfecho de inflamação persistente e reparo disregulado. Na doença inflamatória intestinal (DII), a fibrose leva a formações críticas recorrentes para as quais não há nenhuma terapia eficaz além da ressecção cirúrgica. Devido ao seu início tardio, os processos que impulsionam a fibrose são menos estudados e em grande parte desconhecidos. Conseqüentemente, as complicações fibrótica representam um desafio principal no IBD. Neste protocolo, um modelo in vivo robusto de fibrose intestinal é descrito em que o pré-tratamento com estreptomicina de camundongos C57Bl/6 seguidos por gavagem oral com o mutante de Salmonella typhimurium ΔAroA de grau vacinal leva à colonização persistente do patógeno e fibrose do cálio. Metodologias para a preparação de S. O δaroa de typhimurium para a inoculação, quantificando cargas do micróbio patogénico no ceco e no spleen, e avaliando a deposição do colagénio em tecidos intestinais é explicado. Este modelo de doença experimental é útil para examinar os fatores hospedeiros que aumentam ou exacerbam a fibrose intestinal semelhante a um CD.

Tratamento com estreptomicina seguido de infecção oral por S. O δaroa de typhimurium conduz à inflamação e à fibrose intestinais robustas especialmente no ceco (Figura 1). Os fardos patogénicos típicos de 108 a 109 UFC por 1 g de ceco e 104 CFU por 1 g de baço podem ser recuperados de animais infectados (Figura 2). A avaliação da fibrose em secções cecais coradas de picrosirius indica fibrose de pico 21 dia...

Watch this Scientific Journal Video about Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis at JoVE.com

Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis

Este protocolo descreve um modelo do rato da fibrose intestinal conduzida salmonela que se assemelha a características patológicas chaves de Crohn ' doença de s que inclui a inflamação e a fibrose transmural. Este método pode ser usado para avaliar os fatores hospedeiros que alteram os desfechos fibróticos usando camundongos mutantes mantidos em um fundo genético C57Bl/6.

Infecção crônica por Salmonella induzida por fibrose intestinal

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and ...

A fibrose tecidual é a principal forma de os órgãos falharem ao longo do tempo, em resposta à inflamação crônica ou ao envelhecimento. E na verdade, eu diria que se você não morrer de um agente infeccioso ou câncer, você provavelmente morrerá de fibrose de órgãos à medida que envelhece. Infelizmente, não há muitos modelos de ratos ótimos para imitar fibrose de tecido humano.Então o que desenvolvemos é um modelo de camundongo da doença de Crohn, que é uma doença humana que causa fibrose do intestino e é em grande parte intratável. Na verdade, a única maneira de tratá-lo é através da remoção cirúrgica do tecido fibroso e re-ligação do intestino. A vantagem do nosso modelo é que ele é totalmente penetrante em todas as cepas de camundongos e imita muito de perto a doença de Crohn humana e a fibrose persiste por mais de um mês, que é realmente um modelo robusto.A parte mais desafiadora deste procedimento é o manuseio dos camundongos e, especialmente, o gavage oral, uma vez que requer muita prática de certificação especial. Ao realizar este procedimento pela primeira vez, deve-se estar ciente de que trabalhar com Salmonella requer precauções de segurança adequadas e técnica estéril. O descarte de resíduos e bactérias deve ser planejado antes do experimento.A demonstração visual deste procedimento é muito importante porque envolve o manuseio de Salmonella que requer precauções especiais de segurança, bem como técnica estéril adequada. Para iniciar este procedimento, estabeleça uma placa com ágar LB contendo Estreptomicina a uma concentração de 100 microgramas por mililitro. Usando um laço inoculante estéril, listrar a placa com um estoque de glicerol congelado de S typhimurium delta arrow a.Incubar durante a noite a 37 graus Celsius. As placas de raia podem ser armazenadas a quatro graus Celsius por até uma semana. Um dia antes da infecção, dissolva 0,5 gramas de Estreptomicina em 2,5 mililitros de água para preparar o antibiótico.O filtro esteriliza a solução de estreptomicina. Em seguida, use uma agulha de gavage de 22 bitolas com uma seringa de um mililitro para gavage oralmente os ratos com 100 microliters da solução de estreptomicina. Em seguida, adicione três mililitros de caldo LB contendo Estreptomicina a uma concentração de 50 microgramas por mililitro a um tubo de cultura.Usando um laço de inoculação, inocular o caldo LB com uma única colônia. Incubar a cultura aerobicamente durante a noite a 37 graus Celsius com agitação a 200 rpm. No dia da infecção, realize duas diluições consecutivas de uma a 10 culturas salmonela durante a noite com PBS estéril para preparar a dose final de infecção.Isso resulta em um 100 microliter inóculo contendo aproximadamente três milhões de unidades formadoras de colônias. Depois disso, use uma agulha de gavage de 22 bitolas com uma seringa mililitro para gavage cada rato com 100 microliters da Salmonella preparada. Primeiro, defina dois microtubos de fundo redondos de bloqueio seguro mililitros, adicione um mililitro de PBS estéril e uma conta de aço inoxidável autoclavada em cada tubo.Pré-pesar os tubos antes da coleta de tecidos. Depois de eutanásia de camundongos, ressecize seus tecidos cecal e esplênicos, certificando-se de coletar tecidos de animais individuais em tubos separados. Pesar cada tubo para determinar os pesos teciduais.Use um aparelho de moinho de mistura para homogeneizar os tecidos a 30 hertz por 15 minutos. Em seguida, transfira 900 microliters de PBS para cada poço de um mega bloco de 96 poços de dois mililitros. Pipeta 100 microliters de tecido homogeneiza no primeiro poço, e mistura bem.Realize diluições seriais adicionando 100 microlitadores aos poços subsequentes, até que seja obtida uma diluição de 10 para a sexta diluição negativa. Placa 10 microliters de cada diluição em triplicados em ágar LB que contém Estreptomicina. Em seguida, conte as unidades de formação da colônia média e determine a colônia formando unidades por grama de tecido conforme descrito no protocolo de texto.Abra fiji, que é um software de imagem de código aberto e arraste e solte o arquivo de imagem tif na barra de ferramentas. Na barra de menu, selecione Imagem, Tipo, pilha RGB para dividir a imagem em canais vermelho, verde e azul. Deslize a barra horizontal na parte inferior do painel para definir o canal para verde.Ferramenta de imagem aberta, ajuste, limiar. Ajuste os limites mínimos e máximos para eliminar quaisquer sinais de fundo. Uma vez definido o limiar desejado, feche a ferramenta limiar e vá para Analisar, definir medidas, verificar área, fração de área, limite para limiar e etiqueta exibir.Obtenha a seleção de tecidos com as seleções à mão livre ou a ferramenta seleções de polígonos e meça a área percentual positiva para colágeno clicando em Analisar, Medir. Em seguida, normalize a área absoluta positiva para a coloração de colágeno na área do tecido. Tratamento de estreptomicina seguido de infecção oral com seta delta de s typhimurium a leva a inflamação intestinal robusta e fibrose, especialmente no ceco.Cargas típicas de patógenos de 100 milhões a um bilhão de unidades formadoras de colônias podem ser recuperadas por grama de ceco de animais infectados, enquanto 10 mil unidades formadoras de colônias podem normalmente ser recuperadas por grama de baço. A avaliação da fibrose nas seções de cecal manchadas vermelhas do picrosirius indica pico de fibrose 21 dias após a infecção, enquanto grande parte da patologia é resolvida até o dia 42 pós-infecção. A preparação completa dos materiais é essencial, pois este experimento requer vários dias para ser configurado.A preparação das placas LB e Salmonella e Estreptomicina devem ser todas feitas asepticamente. Antes do experimento, certifique-se de que o experimentador esteja familiarizado com o protocolo animal, bem como com os riscos de segurança. Ao avaliar a carga de colágeno, o experimentador pode optar por realizar outros ensaios biológicos, como sequenciamento de RNA para avaliar perfis de expressão genética ou citometria de fluxo para avaliar subconjuntos de células imunes ou um tecido ELISA para avaliar perfis de citocinas.Então nosso modelo é particularmente bom em imitar uma doença humana chamada doença de Crohn onde você tem fibrose do intestino, que é em grande parte intratável e a única maneira de tratá-lo é remover uma parte do intestino e costurá-la novamente e esperar que ele não volte. Nosso modelo é muito robusto e já mostramos que direcionar células linfoides inatas tipo três, um fator de transcrição chamado alfa cru, ou interleucina 17 ameniza a doença e previne a fibrose. Nosso modelo é particularmente bom em identificar os fatores que jogam na patogênese da doença de Crohn e fibrose intestinal e já estamos no caminho para identificar uma série de metas que poderiam ser tratadas terapeuticamente para aliviar a doença inflamatória intestinal.Nosso modelo já entrou no mesmo acesso ILC3 ou alfa NIL17 pode estar em jogo em outras doenças fibrosas e isso inclui coisas como psoríase, esclerose múltipla, fibrose pulmonar idiopática. Portanto, é possível que direcionar esses mesmos fatores possa aliviar a fibrose nessas doenças também. Embora o fluxo mutante de Salmonella não seja virulento, é importante seguir os protocolos de segurança padrão de risco biológico dados pela instalação.Além disso, uma vez que vapores de formaldeído são conhecidos por serem cancerígenos, é importante trabalhar atrás de um capô de fumaça durante a etapa de fixação.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Crônica de Longo Prazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infecção das vias aéreas em ratos

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Imunologia e Infecção

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Um modelo de rato para induzida por patógeno inflamação crônica no local e sistêmica Sites

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

Um protocolo para infectar<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Com<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantificação de citosólico vs vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; Em macrófagos primários por Permeabilização Diferencial

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

Um Multimodal abordagem de imagem baseado em Micro-CT e fluorescência Molecular tomografia para avaliação Longitudinal de fibrose pulmonar induzida por bleomicina em ratos

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Usando organóides intestinais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos para estudar e modificar a proteção de células epiteliais contra Salmonella e outros patógenos

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin

Visão mecanicista do desenvolvimento da fibrose intestinal mediada por TNBS e avaliação dos efeitos inibitórios da rapamicina

Significant studies have been carried out to understand effective management of intestinal fibrosis. However, the lack of better knowledge of fibrosis has ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Um modelo de inoculação retardada da infecção crônica de pseudomonas aeruginosa ferida

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

Systematic Scoring Analysis for Intestinal Inflammation in a Murine Dextran Sodium Sulfate-Induced Colitis Model

Análise sistemática de pontuação para inflamação intestinal em um modelo de colite induzida por sulfato de sódio murine dextran

Murine colitis models are tools that are extensively employed in studies focused on understanding the pathobiology of inflammatory intestinal disorders. ...