Name: bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease
Uploaded: 2020-03-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease at JoVE.com

ويدعم هذه الدراسة من جامعة وسط فلوريدا كلية الطب بدء المنحة (لHN), جامعة بيتسبرغ المركز الطبي هيلمان مركز السرطان بدء منحة (إلى HL), الولايات المتحدة المعاهد القومية للصحة منحة #1P20CA210300-01 ووزارة الصحة الفيتنامية منحة #4694/ QD-BYT (إلى PTH). نشكر الدكتور شيوي تشونغ يو في جامعة كارولينا الجنوبية الطبية لتوفير المواد اللازمة للدراسة.

تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية من قبل لجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية واستخدامها في جامعة وسط فلوريدا.
1. التعريفي GVHD
ملاحظة: يتم إجراء زرع الخلايا نخاع العظم الأوجيني (BM) (الخطوة 1.2) في غضون 24 ساعة بعد التشعيع. يتم تنفيذ جميع الإجراءات الموضحة أدناه في بي?...

<ol>
	<li>Shlomchik, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).</li><li>Appelbaum, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+cell+transplantation+as+immunotherapy.">Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy.</a> Nature. 411, 385-389 (2001).</li><li>Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+graft-versus-host+disease+biology+and+therapy.">Advances in graft-versus-host disease biology and therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).</li><li>Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2010+report+from+the+Center+for+International+Blood+and+Marrow+Transplant+Research+(CIBMTR):+current+uses+and+outcomes+of+hematopoietic+cell+transplants+for+blood+and+bone+marrow+disorders.">2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders.</a> Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).</li><li>Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+graft-versus-host+disease:+advances+and+limitations.">Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations.</a> Disease Model &amp; Mechanism. 4, 318-333 (2011).</li><li>Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+for+Preclinical+Development+of+Allogeneic+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation.</a> ILAR Journal. , ily006 (2018).</li><li>Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+T+cell+subsets+in+lethal+graft-versus-host+disease+(GVHD)+directed+to+class+I+versus+class+II+H-2+differences.+II.+Protective+effects+of+L3T4++cells+in+anti-class+II+GVHD.">Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD.</a> Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).</li><li>Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosuppressor+and+allohelper+T+cells+in+acute+and+chronic+graft-vs-host+disease.+I.+Alloreactive+suppressor+cells+rather+than+killer+T+cells+appear+to+be+the+decisive+effector+cells+in+lethal+graft-vs.-host+disease.">Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).</li><li>Lu, Y., Waller, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomous+role+of+interferon-gamma+in+allogeneic+bone+marrow+transplant.">Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).</li><li>Abdollahi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+platelet-derived+growth+factor+signaling+attenuates+pulmonary+fibrosis.">Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li><li>Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+regulation+of+graft-versus-host+disease+and+graft-versus-leukemia.">Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia.</a> Blood. 119, 5088-5103 (2012).</li><li>Ullmann, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posaconazole+or+fluconazole+for+prophylaxis+in+severe+graft-versus-host+disease.">Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease.</a> New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).</li><li>Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+specific+cell+populations+by+complement+depletion.">Depletion of specific cell populations by complement depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li><li>Nguyen, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+alloantigen-activated+T+cells+after+hematopoietic+cell+transplantation.">Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Nguyen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+C3a+and+C5a+receptors+promote+GVHD+by+suppressing+mitophagy+in+recipient+dendritic+cells.">Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).</li><li>McNutt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Science. 342, 1417 (2013).</li><li>Negrin, R. S., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+using+bioluminescence:+a+tool+for+probing+graft-versus-host+disease.">In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).</li><li>Roy, D. C., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+vs+minor+histocompatibility+antigens.">Major vs minor histocompatibility antigens.</a> Blood. 129, 664-666 (2017).</li><li>Gendelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+conditioning+is+a+primary+determinant+in+modulating+the+effect+of+IL-7+on+murine+graft-versus-host+disease.">Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease.</a> Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HY-Specific+Induced+Regulatory+T+Cells+Display+High+Specificity+and+Efficacy+in+the+Prevention+of+Acute+Graft-versus-Host+Disease.">HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease.</a> Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).</li><li>Zeiser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+CD30+signaling+is+critical+for+adoptively+transferred+CD4+CD25++regulatory+T+cells+in+prevention+of+acute+graft-versus-host+disease.">Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 109, 2225-2233 (2007).</li><li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice.">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li></ol>

استخدام الخلايا الجذعية لتناسب فرد معين هو نهج فعال لعلاج السرطانات المتقدمة والمقاومة18. المستحضرات الصيدلانية جزيء صغير، ومع ذلك، ظلت لفترة طويلة التركيز الرئيسي لعلاج السرطان شخصية. من ناحية أخرى ، في العلاج الخلوي يمكن أن تؤثر العديد من التفاعلات بين المانح والمضيف بشكل ...

زرع الخلايا الجذعية الدموية الأنجينية (BMT) هو علاج فعال لعلاج الأورام الخبيثة الدموية1،2 من خلال تأثير الكسب غير المشروع مقابل سرطان الدم (GVL)3. ومع ذلك ، فإن الخلايا اللمفاوية المانحة دائما ً ما تشن هجمات مناعية غير مرغوب فيها ضد الأنسجة المتلقية ، وهي عملية تسمى مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف (GVHD)4.
نماذج المورين من GVHD هي أداة فعالة لدراسة بيولوجيا GVHD واستجابة GVL5. الفئران هي نموذج الحيوان البحوث فعالة من حيث التكلفة. فهي صغيرة وفعالة مبوئيمع الجزيئات والبيولوجية في المراحل المبكرة من التنمية6. الفئران هي الحيوانات البحثية المثالية لدراسات التلاعب الجيني لأنها محددة وراثيا، وهو مثالي لدراسة المسارات البيولوجية والآليات6. وقد تم العديد من الفأرة الرئيسية المعقدة histocompatibility (MHC) نماذج غير متطابقة من GVHD راسخة، مثل C57BL/6 (H2ب)إلى BALB/c (H2د)وFVB (H2 q)→C57BL/6q(H2ب)5،,7. هذه هي نماذج قيمة بشكل خاص لتحديد دور أنواع الخلايا الفردية والجينات والعوامل التي تؤثر على GVHD. زرع من C57/BL/6 (H2ب)المتبرعين الوالدين إلى المتلقين مع الطفرات في MHC I (B6.C-H2bm1)و / أو MHC الثاني (B6.C-H2bm12)كشفت أن عدم التطابق في كل من الفئة MHC الأول والفئة الثانية هو شرط مهم لتطوير GVHD الحادة. وهذا يشير إلى أن كل من CD4+ وCD8+ الخلايا التائية مطلوبة لتطوير المرض7،8. وتشارك GVHD أيضا في سلسلة التهابية تعرف باسم 'عاصفة السيتوكين الموالية للالتهابات'9. طريقة التكييف الأكثر شيوعا في نماذج المورين هو تشعيع الجسم الكلي (TBI) عن طريق الأشعة السينية أو 137Cs. وهذا يؤدي إلى استئصال نخاع العظم للمتلقي، مما يسمح للمتبرع بتطعيم الخلايا الجذعية ومنع رفض الكسب غير المشروع. ويتم ذلك عن طريق الحد من انتشار الخلايا التائية المتلقية استجابة للخلايا المانحة. بالإضافة إلى ذلك ، تلعب التفاوتات الوراثية دورًا مهمًا في تحريض المرض ، والذي يعتمد أيضًا على MHC-mismatch81. لذلك ، تختلف جرعة التشعيع النقوي في سلالات الفئران المختلفة (على سبيل المثال ، BALB /c→ C57BL/6).
تنشيط الخلايا التائية المانحة من قبل مستضد المضيف الخلايا تقديم (APCs) أمر ضروري لتطوير GVHD. من بين APCs، الخلايا التشجرات (DCs) هي الأقوى. فهي قادرة على إحداث GVHD بشكل موروث بسبب الإنتضاد الأعلى، والتعبير عن جزيئات T-cell المشتركة المحفزة، وإنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات التي تستقطب الخلايا التائية إلى مجموعات فرعية مسببة للأمراض. البلدان النامية المتلقية حاسمة لتسهيل فتيلة الخلايا T والتعريفي GVHD بعد زرع11،12. وبناء على ذلك، أصبحت البلدان النامية أهدافا مثيرة للاهتمام في علاج GVHD12.
مطلوب TBI لتعزيز الترقيع الخلية المانحة. بسبب تأثير TBI ، يتم تنشيط البلدان النامية المتلقية والبقاء على قيد الحياة لفترة قصيرة بعد زرع12. وعلى الرغم من التقدم الكبير في استخدام الإضاءة الحيوية أو الفلور، فإن إنشاء نموذج فعال لدراسة دور البلدان النامية المتلقية في الـ GVHD لا يزال يشكل تحدياً.
لأن الخلايا التائية المانحة هي القوة الدافعة لنشاط GVL ، فإن استراتيجيات العلاج باستخدام الأدوية المثبطة للمناعة مثل المنشطات لقمع الخلايا التائية غالبًا ما تسبب انتكاسة الورم أو العدوى13. ولذلك، فإن استهداف البلدان النامية المتلقية قد يوفر نهجاً بديلاً لعلاج الـ GVHD مع الحفاظ على تأثير GVL وتجنب العدوى.
باختصار، توفر الدراسة الحالية منصة لفهم كيفية تنظيم أنواع مختلفة من الإشارات في البلدان النامية المتلقية لتطوير GVHD وتأثير GVL بعد BMT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0 100ML</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A20 B-cell lymphoma</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>30954</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl CD4cre</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td></td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R (B220)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220 FITC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10452-85</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c- AF700</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>117319</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD25 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0041-86</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 eFluor&#174; 450 (Pacific Blue&#174; replacement)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>48-0042-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45.1 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0900-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD8a APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-0081-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-5958-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse MHC Class II-antibody APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5320-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TER-119 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Thy1.2</td>
			<td>Bio Excel</td>
			<td>BE0066</td>
			<td>BM generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6 fB-/- mice</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>564</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028</td>
			<td>Transplant recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Donors/Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0251-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5971-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Bilogicals R&#38;D system</td>
			<td>D17051</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352008</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB/NCrl</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>207</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysacharide (LPS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L4391-1MG</td>
			<td>DC mature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS column</td>
			<td>Mitenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Galaxy 170R incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Galaxy 170 R</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scienctific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TER119</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-RAD 320 Biological Irradiator</td>
			<td>Precision X-RAY</td>
			<td>X-RAD 320</td>
			<td>Total Body Irradiation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease

زرع نخاع العظم الأوجيني (BMT) هو علاج فعال للأورام الدموية بسبب تأثير الكسب غير المشروع مقابل سرطان الدم (GVL) للقضاء على الأورام. ومع ذلك ، يقتصر تطبيقه على تطور مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف (GVHD) ، وهو أحد المضاعفات الرئيسية لـ BMT. يتم استحضار GVHD عندما الخلايا التائية في الطعوم المانحة الاعترافالوانتيجين التي تعبر عنها الخلايا المتلقية ويشن الهجمات المناعية غير المرغوب فيها ضد الأنسجة السليمة المتلقي. وهكذا، تم تصميم العلاجات التقليدية لقمع المتبرع T-خلية alloreactivity. ومع ذلك، فإن هذه النُهج تضعف إلى حد كبير تأثير GVL بحيث لا يتم تحسين بقاء المتلقي. وبالتالي فإن فهم آثار النهج العلاجية على BMT و GVL و GVHD أمر ضروري. بسبب قدرات التبذير وإفراز السيتوكين لتحفيز الخلايا التائية المانحة، تلعب الخلايا التطبيبة المتلقية (DCs) دورًا مهمًا في تحريض GVHD. ولذلك، يصبح استهداف البلدان النامية المتلقية نهجاً محتملاً للسيطرة على الـ GVHD. يقدم هذا العمل وصفاً لمنصة BMT جديدة للتحقيق في كيفية تنظيم البلدان النامية المضيفة لاستجابات GVH وGVL بعد الزرع. كما يقدم نموذج BMT فعال لدراسة بيولوجيا GVHD وGVL بعد الزرع.

نموذج MHC غير المتطابقة الرئيسية B6 (H2k b)-BALB/C (H2kd)يتوافق بشكل وثيق مع تطور GVHD بعد الزرعb(الشكل 2). حدثت جميع العلامات السريرية الست GVHD التي وضعها كوك وآخرون16 في المتلقين المزروعين بخلايا WT-B6 T ولكن ليس في المستلمين المزروعين بـ BM وحده (ال...

Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease at JoVE.com

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف هو أحد المضاعفات الرئيسية بعد زرع نخاع العظم اللوجيني. تلعب الخلايا التطبيبية دورًا حاسمًا في الإمراض لمرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف. المادة الحالية يصف جديدة زرع نخاع العظم منصة للتحقيق في دور الخلايا التشجرات في تطوير مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف وتأثير الكسب غير المشروع مقابل سرطان الدم.

منصة زرع نخاع العظم للتحقيق في دور الخلايا التطبيب في مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

يمكن استخدام بروتوكول زرع نخاع العظم الجديد هذا للتحقيق في كيفية تنظيم الخلايا الجذعية المضيفة استجابات الكسب غير المشروع مقابل المضيف والكسب غير الطعم مقابل سرطان الدم بعد الزرع. السابقين خلايا الجسم الحي تجديد يسمح هذا البروتوكول أن تتكيف لاختبار دور السكان الخلايا المناعية الأخرى مثل الضامة والعدلات ببساطة عن طريق تعديل حالة الثقافة. إظهار الإجراء معي سيكون مدير المختبر كريستال هوساك والجامعة الجامعية سانجيف Gurshaney.بالنسبة للمتبرعين T-cell المنضب C57BL/6 إعداد نخاع العظام، حصاد عظم الفخذ والساق وفقا للبروتوكولات القياسية من الفئران المانحة القتل الرحيم ونقل العظام في طبق بيتري قطره 92 ملليمتر يحتوي على 1٪ 1 في الدقيقة 1 المتوسطة. باستخدام مقص، وإزالة نهايات من كل العظام وملء حقنة ثلاثة ملليلتر مجهزة إبرة قياس 26 مع 1٪ 1٪ 1 متوسطة. أدخل الإبرة في نهاية واحدة من العظام والاكتئاب المكبس لطرد نخاع العظم من تجويف و في مصفاة خلية جمع.عندما تم جمع كل من نخاع العظام, سلالة قطع نخاع العظام من خلال مرشح شبكة 75 ميكرومتر ونقل تعليق خلية واحدة في أنبوب جديد 50 ملليلتر. رواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 20 مرات 10 إلى الخلايا الستة لكل ملليلتر تركيز في برنامج تلفزيوني تكملها 0.5٪ BSA. بعد ذلك، أضف 0.05 ميكروغرام من الأجسام المضادة THI1 لكل مرة واحدة 10 مرات إلى الخلايا الست لاحتضان لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا مرتين مع 10 ملليلتر من الثلج البارد PBS و resuspend بيليه في مرتين 10 إلى الخلايا السبع لكل ملليلتر التركيز في 0.5٪ BSA تكمل مع 10٪ الأرانب الشباب تكملة و 2٪ DNAse في الماء المعقم لاحتضان 45 دقيقة في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا مرتين مع 15 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الطازجة في غسل وإعادة تثبيت بيليه في 20 ملليلتر من برنامج تلفزيوني تحتوي على 0.5٪ BSA. تجمع الغدد الليمفاوية والطحال في مصفاة المسام 40 ميكرومتر واستخدام المكبس حقنة لmacerate الأنسجة من خلال المرشحات لإطلاق الخلايا.غسل المصفاة والمغطس مع متوسط RPMI تكملها 1٪ FBS لجمع كل من الخلايا ورواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي. إضافة خمسة ملليلترات من ACK lysis العازلة إلى بيليه الخلية. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ووقف رد الفعل مع خمسة ملليلتر من المتوسطة تكمل مع 1٪ FBS و بيليه خلايا الدم البيضاء عن طريق الطرد المركزي.Resuspend بيليه في خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت MACS لحساب وتمييع الخلايا إلى تركيز مرتين 10 إلى الخلايا الثماني لكل ملليلتر في عازلة MACS جديدة. إضافة التركيز المناسب من الأجسام المضادة للكرئي، المضادة للمحظورات، المضادة لخلايا، المضادة لخلايا، ومضادة لخلايا NK-الخلايا المضادة للاستنفاد في مرة واحدة 10 إلى الخلايا الست لاحتضان لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا مع 10 ملليلتر من الجليد الباردة MACS العازلة وإعادة تثبيت بيليه في مرة واحدة 10 إلى الخلايا ثمانية في تركيز مليلتر في عازلة ماك جديدة.بعد ذلك، أضف 0.22 ميكرولترات من مضادات البيوتين MicroBeads لكل مرة واحدة 10 مرات إلى الخلايا الست مع الاختلاط لاحتضان لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا مع 10 ملليلتر من الجليد الباردة MACS العازلة وجمع الخلايا التائية المخصب غير منضم عن طريق فصل الخرز المغناطيسي باستخدام فاصل MACSxpress وفقا لبروتوكولات عزل حبة القياسية. في نهاية الفصل، رواسب الخلايا التائية عن طريق الطرد المركزي وإعادة تثبيت بيليه في خمسة ملليلتر من عازلة MACS جديدة للعد.لتوليد الخلايا التشعبية المشتقة من نخاع العظام ، قم بعزل نخاع العظم من عظم الفخذ من النوع البري أو فئران الضربة القاضية العامل B كما هو موضح وتحلل خلايا الدم الحمراء في خمسة ملليلترات من ACK تحلل العازلة ، ووقف التفاعل مع 10 ملليلتر من RPMI تستكمل بنسبة 1 ٪ FBS بعد خمس دقائق. بعد جمع خلايا الدم كلها عن طريق الطرد المركزي، resuspend بيليه في 10 ملليلتر من متوسطة الثقافة إلى مرتين 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر التركيز وإضافة 20 نانوغرام لكل ملليلتر من GM-CSF إلى الخلايا قبل بذر 10 ملليلتر من الخلايا على الفردية 100 من 15 ملليمتر أطباق بيتري في 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون 5٪ لمدة ستة أيام. في اليوم السادس، قم بتنشيط ثقافات الخلايا المتسخة المشتقة من نخاع العظم مع 25 ميكروغرام لكل ملليلتر من LPS لكل لوحة.على الأقل 85٪ من خلايا نخاع العظام المستزرعة تفرق إلى خلايا تشعبية. نقاء T-cell بعد إثراء الخرز المغناطيسي هو 90٪ ويتطابق نموذج MHC الرئيسي غير المتطابق C57BL/6 BALB/c مع تطور GVHD بعد الزرع. ذروة شدة يحدث ما يقرب من 11 يوما بعد نقل الخلايا تليها انخفاض في الدرجات السريرية واستعادة وزن الجسم حتى اليوم 16.استسلم المستفيدون بشكل موحد إلى GVHD من قبل 30 إلى 40 يوما بعد الزراعة. ومن المثير للاهتمام، زرع مع عامل B خروج المغلوب الخلايا المتجرف يحسن البقاء على قيد الحياة المتلقي وعشرات السريرية GVHD. Luciferase-transe التي تسببها A20 B-الخلايا الليمفاوية يسمح رصد نمو الورم في الحيوانات الحية.في هذه التجربة التمثيلية ، توفي جميع متلقي النوع البري BALB / c الذين تلقوا نخاع العظم وحده بالإضافة إلى A20 من انتكاس الورم. توفي المتلقين من النوع البري BALB / c المزروعة مع الخلايا التائية المانحة المستخلصة من نخاع العظم من GVHD. بالإضافة إلى ذلك، الحيوانات التي تلقت نخاع العظام المانحة والخلايا التائية المنضب ACC1 توفي من كل من GVHD والانتكاس الورم.لتوليد ما يكفي من خلايا نخاع العظام، يجب أن تكون عظام الساق وعظم الفخذ التي تم جمعها خالية تماما من أنسجة العضلات قبل تصحيح نخاع العظم. يمكن التنقية السلبية لخلايا نخاع العظام مع biotinylase المضادة لـ CD3 ومضاد Biotin MicroBeads أيضا في إجراء لنضوب الخلايا الليمفاوية من نخاع العظام.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

جيل ووسمها الفئران خلايا نخاع العظام المستمدة من البلورات النانوية مع شجيري Qdot تتبع للدراسات

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

تحريض الطعم ضد المضيف المرض و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; مراقبة الخلايا T باستخدام نموذج MHC المطابقة الفئران

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

التفريق الأدوار الوظيفية في التعبير الجيني من الخلايا المناعية وغير المناعية في التهاب القولون الماوس عن طريق زرع نخاع العظم

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

طرق بالتحقيق في الدور التنظيمي للالرنا الصغيرة وخاص بالريبوسوم إشغال<em&gt; المتصورة المنجلية</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

جيل وتحديد GM-CSF المشتقة مثل السنخية الضامة والخلايا الجذعية من الفأر نخاع العظم

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

مضان تنشيط الفرز الخليوي لتنقية الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل من الفأر نخاع العظم

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

الرئة ماوس شرائح لتصور لايف الخلايا الجذعية الرئوي قطع الدقة

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

An In Vivo Mouse Model to Measure NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

نموذج ماوس في فيفو إلى تدبير السذاجة CD4 تي خلية التنشيط وانتشارها والتمايز Th1 الناجمة عن الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظام

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

التعريفي للابتزاز الأمعاء – مقابل – المضيف المرض وتقييمها بالمنظار ميني في الفئران حية

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

الحث والتهديف من مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف في نموذج المورين Xenogeneic والقياس الكمي للخلايا تي البشرية في أنسجة الماوس باستخدام PCR الرقمية

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...