Name: bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease
Uploaded: 2020-03-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease at JoVE.com

Denne undersøgelse er støttet af University of Central Florida College of Medicine start-up tilskud (til HN), University of Pittsburgh Medical Center Hillman Cancer Center start-up tilskud (til HL), USA NIH Grant #1P20CA210300-01 og vietnamesiske Sundhedsministeriet Grant #4694 / QD-BYT (til PTH). Vi takker Dr. Xue-zhong Yu på Medical University of South Carolina for at levere materialer til undersøgelsen.

De eksperimentelle procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of University of Central Florida.
1. GVHD Induktion
BEMÆRK: Allogen knoglemarvscelletransplantation (Trin 1.2) udføres inden for 24 timer efter bestråling. Alle procedurer, der er beskrevet nedenfor, udføres i et sterilt miljø. Udfør proceduren i en vævskultur hætte og bruge filtreret reagenser.
<ol><li>Dag 0: Forbered modtagermusene.<ol>
<li>Brug mus af vild hunn (W...

<ol>
	<li>Shlomchik, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).</li><li>Appelbaum, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+cell+transplantation+as+immunotherapy.">Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy.</a> Nature. 411, 385-389 (2001).</li><li>Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+graft-versus-host+disease+biology+and+therapy.">Advances in graft-versus-host disease biology and therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).</li><li>Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2010+report+from+the+Center+for+International+Blood+and+Marrow+Transplant+Research+(CIBMTR):+current+uses+and+outcomes+of+hematopoietic+cell+transplants+for+blood+and+bone+marrow+disorders.">2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders.</a> Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).</li><li>Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+graft-versus-host+disease:+advances+and+limitations.">Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations.</a> Disease Model &amp; Mechanism. 4, 318-333 (2011).</li><li>Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+for+Preclinical+Development+of+Allogeneic+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation.</a> ILAR Journal. , ily006 (2018).</li><li>Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+T+cell+subsets+in+lethal+graft-versus-host+disease+(GVHD)+directed+to+class+I+versus+class+II+H-2+differences.+II.+Protective+effects+of+L3T4++cells+in+anti-class+II+GVHD.">Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD.</a> Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).</li><li>Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosuppressor+and+allohelper+T+cells+in+acute+and+chronic+graft-vs-host+disease.+I.+Alloreactive+suppressor+cells+rather+than+killer+T+cells+appear+to+be+the+decisive+effector+cells+in+lethal+graft-vs.-host+disease.">Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).</li><li>Lu, Y., Waller, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomous+role+of+interferon-gamma+in+allogeneic+bone+marrow+transplant.">Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).</li><li>Abdollahi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+platelet-derived+growth+factor+signaling+attenuates+pulmonary+fibrosis.">Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li><li>Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+regulation+of+graft-versus-host+disease+and+graft-versus-leukemia.">Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia.</a> Blood. 119, 5088-5103 (2012).</li><li>Ullmann, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posaconazole+or+fluconazole+for+prophylaxis+in+severe+graft-versus-host+disease.">Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease.</a> New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).</li><li>Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+specific+cell+populations+by+complement+depletion.">Depletion of specific cell populations by complement depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li><li>Nguyen, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+alloantigen-activated+T+cells+after+hematopoietic+cell+transplantation.">Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Nguyen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+C3a+and+C5a+receptors+promote+GVHD+by+suppressing+mitophagy+in+recipient+dendritic+cells.">Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).</li><li>McNutt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Science. 342, 1417 (2013).</li><li>Negrin, R. S., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+using+bioluminescence:+a+tool+for+probing+graft-versus-host+disease.">In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).</li><li>Roy, D. C., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+vs+minor+histocompatibility+antigens.">Major vs minor histocompatibility antigens.</a> Blood. 129, 664-666 (2017).</li><li>Gendelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+conditioning+is+a+primary+determinant+in+modulating+the+effect+of+IL-7+on+murine+graft-versus-host+disease.">Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease.</a> Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HY-Specific+Induced+Regulatory+T+Cells+Display+High+Specificity+and+Efficacy+in+the+Prevention+of+Acute+Graft-versus-Host+Disease.">HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease.</a> Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).</li><li>Zeiser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+CD30+signaling+is+critical+for+adoptively+transferred+CD4+CD25++regulatory+T+cells+in+prevention+of+acute+graft-versus-host+disease.">Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 109, 2225-2233 (2007).</li><li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice.">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li></ol>

Brugen af stamceller, der passer til en bestemt person, er en effektiv tilgang til behandling af fremskreden og resistentkræftform 18. Små molekyle lægemidler, dog, har længe været et primært fokus for personlig kræftbehandling. På den anden side, i cellulære terapi en lang række interaktioner mellem donor og vært kan afgørende påvirke behandlingsresultaterne, såsom udviklingen af GVHD efter BMT1.
Major MHC-uoverensstemmende musemod...

Allogen hæmatopoietisk stamcelletransplantation (BMT) er en effektiv behandling til behandling af hæmatologiske maligniteter1,2 gennem graft-versus-leukæmi (GVL) effekt3. Men, donor lymfocytter altid montere uønskede immunologiske angreb mod recipientvæv, en proces kaldet graft-versus-host sygdom (GVHD)4.
Murinemodeller af GVHD er et effektivt værktøj til at studere gvhd-populationen og GVL-responsen5. Mus er en omkostningseffektiv forskning dyr model. De er små og effektivt dosering med molekyler og biologi i de tidlige faser af udviklingen6. Mus er ideelle forskningsdyr til genetisk manipulation undersøgelser, fordi de er genetisk veldefinerede, som er ideel til at studere biologiske veje og mekanismer6. Flere mus større histocompatibility kompleks (MHC) MHC-uoverensstemmende modeller af GVHD er blevet veletableret, såsom C57BL/6 (H2b) til BALB / c (H2d) og FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)5,7. Disse er særligt værdifulde modeller til at bestemme den rolle, som de enkelte celletyper, gener, og faktorer, der påvirker GVHD. Transplantation fra C57/BL/6 (H2b) forældredonorer til recipienter med mutationer i MHC I (B6.C-H2bm1) og/eller MHC II (B6.C-H2bm12) viste, at et misforhold i både MHC-klasse I og klasse II er et vigtigt krav for udviklingen af akut GVHD. Dette tyder på , at både CD4+ og CD8+ T-celler er nødvendige for sygdomsudvikling7,8. GVHD er også involveret i en inflammatorisk kaskade kendt som 'pro-inflammatorisk cytokin storm'9. Den mest almindelige konditioneringmetode i murinemodeller er total kropsbestråling (TBI) ved røntgen eller 137Cs. Dette fører til modtagerens knoglemarvsablation, hvilket giver donor stamcelleindpodning og forhindrer afvisning af transplantatet. Dette gøres ved at begrænse spredningen af recipient-T-celler som reaktion på donorceller. Derudover, genetiske forskelle spiller en vigtig rolle i sygdominduktion, som også afhænger af mindre MHC-mismatch10. Derfor varierer myeloablativ bestrålingsdosis i forskellige musestammer (f.eks. BALB/c→C57BL/6).
Aktivering af donor-T-celler ved værtsantigen, der præsenterer celler (APC'er), er afgørende for udviklingen af GVHD. Blandt De APC'er, dendritiske celler (DC' er) er de mest potente. De er arveligt i stand til at fremkalde GVHD på grund af deres overlegne antigen optagelse, udtryk for T-celle co-stimulerende molekyler, og produktion af pro-inflammatoriske cytokiner, der polariserer T-celler i patogene delmængder. DCs-modtagere er afgørende for at lette T-cellepriming og GVHD-induktion efter transplantation11,12. Dc er derfor blevet interessante mål i behandlingen af GVHD12.
TBI er nødvendig for at forbedre donorcelleindpodningen. På grund af TBI-effekten aktiveres recipient-DC'erne, og de overlever i kort tid efter transplantationen12. På trods af store fremskridt i brugen af bioluminescens eller fluorescens, oprettelse af en effektiv model til at studere den rolle, som modtageren DC'er i GVHD er stadig udfordrende.
Fordi donor T-celler er den drivende kraft for GVL aktivitet, behandlingsstrategier ved hjælp af immunsuppressive lægemidler såsom steroider til at undertrykke T-celle alloreaktivitet ofte forårsage tumor tilbagefald eller infektion13. Derfor kan målretning af recipient-DC'er give en alternativ tilgang til behandling af GVHD, samtidig med at GVL-effekten bevares, og infektionundgås.
Kort sagt, den nuværende undersøgelse giver en platform til at forstå, hvordan forskellige typer af signalering i modtageren DC'er regulerer GVHD udvikling og GVL effekt efter BMT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0 100ML</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A20 B-cell lymphoma</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>30954</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl CD4cre</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td></td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R (B220)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220 FITC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10452-85</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c- AF700</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>117319</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD25 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0041-86</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 eFluor&#174; 450 (Pacific Blue&#174; replacement)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>48-0042-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45.1 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0900-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD8a APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-0081-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-5958-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse MHC Class II-antibody APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5320-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TER-119 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Thy1.2</td>
			<td>Bio Excel</td>
			<td>BE0066</td>
			<td>BM generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6 fB-/- mice</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>564</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028</td>
			<td>Transplant recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Donors/Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0251-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5971-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Bilogicals R&#38;D system</td>
			<td>D17051</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352008</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB/NCrl</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>207</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysacharide (LPS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L4391-1MG</td>
			<td>DC mature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS column</td>
			<td>Mitenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Galaxy 170R incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Galaxy 170 R</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scienctific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TER119</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-RAD 320 Biological Irradiator</td>
			<td>Precision X-RAY</td>
			<td>X-RAD 320</td>
			<td>Total Body Irradiation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease

Allogen knoglemarvstransplantation (BMT) er en effektiv behandling for hæmatologiske maligniteter på grund af graft-versus-leukæmi (GVL) effekt til at udrydde tumorer. Men, dens anvendelse er begrænset af udviklingen af graft-versus-host sygdom (GVHD), en større komplikation af BMT. GVHD fremkaldes, når T-celler i donortransplantaterne genkenderalloantigen udtrykt af recipientceller og monterer uønskede immunologiske angreb mod raske væv fra recipienten. Således traditionelle behandlingsformer er designet til at undertrykke donor T-celle alloreaktivitet. Disse tilgange forringer imidlertid i væsentlig grad GVL-effekten, således at modtagerens overlevelse ikke forbedres. Det er derfor vigtigt at forstå virkningerne af terapeutiske tilgange på BMT, GVL og GVHD. På grund af den antigen-præsenterende og cytokin-udskillende kapacitet til at stimulere donor T-celler, modtager dendritiske celler (DC' er) spiller en væsentlig rolle i induktion af GVHD. Derfor bliver målretning af modtager-DC'er en potentiel tilgang til styring af GVHD. Dette arbejde giver en beskrivelse af en ny BMT-platform til at undersøge, hvordan vært DC'er regulere GVH og GVL svar efter transplantation. Også præsenteret er en effektiv BMT model til at studere biologi GVHD og GVL efter transplantation.

Den største MHC-uoverensstemmende B6 (H2kb)-BALB/C (H2kd)model svarede nøje til GVHD udvikling efter transplantationen (Figur 2). Alle seks kliniske GVHD-tegn, der tidligere blev fastslået af Cooke et al.16, forekom hos de recipienter, der blev transplanteret med WT-B6 T-celler, men ikke hos de recipienter, der blev transplanteret med BM alene (trin 1.5), som repræsenterede den GVHD-negative gruppe. Der er to ...

Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease at JoVE.com

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Graft-versus-host sygdom er en stor komplikation efter allogen knoglemarvstransplantation. Dendritiske celler spiller en afgørende rolle i patogenesen af graft-versus-host sygdom. Den nuværende artikel beskriver en ny knoglemarvstransplantation platform til at undersøge den rolle, dendritiske celler i udviklingen af graft-versus-host sygdom og graft-versus-leukæmi effekt.

Knoglemarvstransplantation platform til at undersøge den rolle, dendritiske celler i Graft-versus-Host Sygdom

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

Denne nye knoglemarvstransplantation protokol kan bruges til at undersøge, hvordan vært dendritiske celler regulerer graft-versus-host og graft-versus-leukæmi svar efter transplantation. Ex vivo celle regenereringer gør det muligt for denne protokol, der skal tilpasses til at teste den rolle, som andre immuncellepopulation såsom makrofag og neutrofiler blot ved at ændre kultur tilstand. Demonstration af proceduren med mig vil være lab manager Krystal Hossack og bachelor Sanjeev Gurshaney.For donor T-celle-forarmet C57BL/6 knoglemarvspræparat, høste lårbenet og skinnebenet i henhold til standardprotokoller fra aflivede donormus og overføre knoglerne til en 92 millimeter diameter Petri fad indeholdende 1% RPMI medium. Brug en saks, fjerne enderne fra hver knogle og fylde en tre milliliter sprøjte udstyret med en 26 gauge nål med frisk 1% RPMI medium. Sæt nålen i den ene ende af en knogle og tryk stemplet for at skylle knoglemarven ud af hulrummet og ind i en samling celle si.Når hele knoglemarven er indsamlet, skal knoglemarvsstykkerne belastes gennem et 75 mikrometermaskefilter, og enkeltcellesuspensionen overføres til et nyt 50 milliliterrør. Cellerne sedimenteres ved centrifugering og opsaltning af pellets ved 20 gange 10 til de seks celler pr. milliliterkoncentration i PBS suppleret med 0,5% BSA. Dernæst tilsættes 0,05 mikrogram THI1 antistof pr. en gange 10 til de seks celler for en 30-minutters inkubation ved fire grader Celsius.Ved inkubationens afslutning vaskes cellerne to gange med 10 milliliter iskold PBS, og pelletsuspendes igen ved en to gange 10 til de syv celler pr. milliliterkoncentration i 0,5 % BSA suppleret med 10 % ung kanintillæg og 2%DNAse i sterilt vand i en 45-minutters inkubation ved 37 grader Celsius. Ved inkubationens afslutning vaskes cellerne to gange med 15 milliliter frisk PBS pr. vask, og pelleten opsabruges igen i 20 milliliter PBS indeholdende 0,5 % BSA. Pool lymfeknuder og milten i en 40 mikrometer pore si og bruge en sprøjte stemplet til at macerate væv gennem filtrene til at frigive cellerne.Sænker sementet og stemplet med RPMI-medium suppleret med 1%FBS for at indsamle alle cellerne og sedimentcellerne ved centrifugering. Der tilsættes fem milliliter ACK lysis-buffer til cellepellet. Efter fem minutter ved stuetemperatur, stoppe reaktionen med fem milliliter medium suppleret med 1%FBS og pellet de hvide blodlegemer ved centrifugering.Pelletsuspendrer pelletet i fem milliliter MACS-buffer til optælling og fortynd cellerne til en koncentration på to gange 10 til de otte celler pr. milliliter i frisk MACS-buffer. Tilsæt passende koncentration af anti-erythroid, anti-granulocyt, anti-B-celle, og anti-NK-celle udtynding antistoffer pr. gange 10 til de seks celler for en 15-minutters inkubation ved fire grader Celsius. Ved inkubationens afslutning vaskes cellerne med 10 milliliter iskold MACS-buffer, og pelletsen skal opslæmmes én gang 10 til de otte celler pr. milliliterkoncentration i frisk MACS-buffer.Dernæst tilsættes 0,22 mikroliter anti-Biotin MicroBeads pr. en gange 10 til de seks celler med blanding til en 15-minutters inkubation ved fire grader Celsius. Ved inkubationens afslutning vaskes cellerne med 10 milliliter iskold MACS-buffer, og de ubundne berigede T-celler opsamler ved magnetisk perleadskillelse ved hjælp af MACSxpress-separator i henhold til standardpergærisolationsprotokoller. Ved afslutningen af adskillelsen sedimenteres T-cellerne ved centrifugering og resuspenderede pellet i fem milliliter frisk MACS-buffer til optælling.For at generere knoglemarvsbaserede dendritiske celler isoleres knoglemarven fra lårben af vild type eller faktor B knockoutmus som påvist og lyse de røde blodlegemer i fem milliliter ACK lysis buffer, hvilket stopper reaktionen med 10 milliliter RPMI suppleret med 1% FBS efter fem minutter. Efter opsamling af hele blodcellerne ved centrifugering, resuspend pellet i 10 milliliter kultur medium til en to gange 10 til den sjette celler pr milliliter koncentration og tilsæt 20 nanogram pr. milliliter GM-CSF til cellerne, før såning 10 milliliter celler på individuelle 100 af 15 millimeter Petri retter ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i seks dage. På dag seks aktiveres de knoglemarvbaserede dendritiske cellekulturer med 25 mikrogram pr. milliliter LPS pr. plade.Mindst 85% af de dyrkede knoglemarvsceller differentiere i dendritiske celler. T-celle renhed efter magnetisk perle berigelse er 90%Den største MHC uoverensstemmende C57BL/6 BALB / c model svarer nøje til GVHD udvikling efter transplantation. Sværhedsgradstoppen forekommer ca. 11 dage efter celleoverførsel efterfulgt af en reduktion i den kliniske score og restitution af kropsvægt op til dag 16.Modtagerne ens bukkede under for GVHD med 30 til 40 dage efterflyve. Interessant, transplantation med faktor B knockout dendritiske celler forbedrer modtagerens overlevelse og GVHD kliniske score. Luciferase-transduced A20 B-celle lymfom tillader overvågning af tumorvækst i levende dyr.I dette repræsentative eksperiment døde alle de vilde type BALB/c-modtagere, der modtog knoglemarv alene plus A20, af et tumornedfald. Wild type BALB/c modtagere transplanteret med knoglemarv-afledte ACC1-forarmet donor T-celler døde af GVHD. Desuden døde dyr, der modtog donor knoglemarv og ACC1-forarmet T-celler af både GVHD og tumor tilbagefald.For at generere nok knoglemarvscelle skal de indsamlede skinnebens- og lårbensknogler være helt fri for muskelvæv før knoglemarvskorrektionen. Negativ rensning af knoglemarvscellerne med biotinylase anti-CD3 og Anti-Biotin MicroBeads kan også pr. udført for at nedbryde lymfocytet fra knoglemarven.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induktion af graft-versus-host sygdom og<em&gt; In Vivo</em&gt; T Cell Monitoring Brug en MHC-matchet murin model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Differentiering funktionelle roller af genekspression fra immun og ikke-immun celler i Mouse Colitis af knoglemarvstransplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Metoder til undersøgelse af Regulatory rolle små RNA og Ribosomal Belægning af<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Generation og Identifikation af GM-CSF Afledt Alveolære-lignende makrofager og dendritiske celler fra mus Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescens-aktiveret cellesortering til oprensning af Plasmacytoide dendritiske celler fra knoglemarven i mus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Præcision-cut muselunge Skiver at visualisere Levende Pulmonal dendritiske celler

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

An In Vivo Mouse Model to Measure NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

En In Vivo musemodel foranstaltning naive CD4 T-celle aktivering, spredning og Th1 differentiering induceret af knoglemarv-afledte dendritiske celler

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Induktion af Intestinal Graft - versus host klovesyge og sin Mini-endoskopisk vurdering i levende mus

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Induktion og scoring af graft-versus-Host-sygdom i en xenogen Murinmodel og kvantificering af humane T-celler i muse væv ved hjælp af digital PCR

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...