Name: bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease
Uploaded: 2020-03-17T12:00:00
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Cette étude est soutenue par l’Université de Central Florida College of Medicine subvention de démarrage (à HN), l’Université de Pittsburgh Medical Center Hillman Cancer Center start-up subvention (à HL), les États-Unis NIH Grant #1P20CA210300-01 et le ministère vietnamien de la Santé Grant #4694/QD-BYT (à PTH). Nous remercions le Dr Xue-zhong Yu de l’Université médicale de Caroline du Sud d’avoir fourni du matériel pour l’étude.

Les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Floride centrale.
1. Induction GVHD
REMARQUE : La transplantation de cellules de moelle osseuse allogeneic (BM) (étape 1.2) est effectuée dans les 24 h après l’irradiation. Toutes les procédures décrites ci-dessous sont effectuées dans un environnement stérile. Effectuez la procédure dans un capot de culture tissul...

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	<li>Shlomchik, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).</li><li>Appelbaum, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+cell+transplantation+as+immunotherapy.">Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy.</a> Nature. 411, 385-389 (2001).</li><li>Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+graft-versus-host+disease+biology+and+therapy.">Advances in graft-versus-host disease biology and therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).</li><li>Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. 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The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Nguyen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+C3a+and+C5a+receptors+promote+GVHD+by+suppressing+mitophagy+in+recipient+dendritic+cells.">Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).</li><li>McNutt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Science. 342, 1417 (2013).</li><li>Negrin, R. S., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+using+bioluminescence:+a+tool+for+probing+graft-versus-host+disease.">In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).</li><li>Roy, D. C., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+vs+minor+histocompatibility+antigens.">Major vs minor histocompatibility antigens.</a> Blood. 129, 664-666 (2017).</li><li>Gendelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+conditioning+is+a+primary+determinant+in+modulating+the+effect+of+IL-7+on+murine+graft-versus-host+disease.">Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease.</a> Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HY-Specific+Induced+Regulatory+T+Cells+Display+High+Specificity+and+Efficacy+in+the+Prevention+of+Acute+Graft-versus-Host+Disease.">HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease.</a> Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).</li><li>Zeiser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+CD30+signaling+is+critical+for+adoptively+transferred+CD4+CD25++regulatory+T+cells+in+prevention+of+acute+graft-versus-host+disease.">Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 109, 2225-2233 (2007).</li><li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice.">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li></ol>

L’utilisation de cellules souches pour convenir à une personne particulière est une approche efficace pour traiter les cancers avancés et résistants18. Les produits pharmaceutiques à petites molécules, cependant, sont longtemps restés un foyer principal de la thérapie personnalisée de cancer. D’autre part, dans la thérapie cellulaire une multitude d’interactions entre le donneur et l’hôte peut influencer de façon décisive les résultats du traitement, tels que le développemen...

La transplantation de cellules souches hématopoïétiques allogéniques (BMT) est une thérapie efficace pour traiter les malignités hématologiques1,2 par l’effet greffe-contre-leucémie (GVL)3. Cependant, les lymphocytes de donneur montent toujours des attaques immunologiques non désirées contre des tissus de destinataire, un processus appelé greffe-contre-hôte maladie (GVHD)4.
Les modèles murins de GVHD sont un outil efficace pour étudier la biologie de GVHD et la réponse GVL5. Les souris sont un modèle animal de recherche rentable. Ils sont petits et efficacement dosés avec des molécules et des produits biologiques aux premières phases du développement6. Les souris sont des animaux de recherche idéaux pour les études de manipulation génétique parce qu’ils sont génétiquement bien définis, ce qui est idéal pour étudier les voies biologiques et les mécanismes6. Plusieurs modèles de souris majeure histocompatibilité complexe (MHC) MHC-dépareillé modèles de GVHD ont été bien établis, tels que C57BL/6 (H2b) à BALB / c (H2d) et FVB (H2q) C57BL/6 (H2b)5,7. Ce sont des modèles particulièrement précieux pour déterminer le rôle des types de cellules, des gènes et des facteurs qui affectent la GVHD. La transplantation de C57/BL/6 (H2b) donneurs parentaux à des receveurs présentant des mutations dans le MHC I (B6.C-H2bm1) et/ou MHC II (B6.C-H2bm12) a révélé qu’un décalage dans la classe I et la classe II du MHC est une exigence importante pour le développement de GVHD aigus. Ceci suggère que les cellulesT de CD4et de CD8 sont exigées pour le développement de la maladie7,,8. GVHD est également impliqué dans une cascade inflammatoire connue sous le nom de «tempête de cytokine pro-inflammatoire»9. La méthode de conditionnement la plus courante dans les modèles murins est l’irradiation totale du corps (TBI) par rayon X ou 137Cs. Ceci mène à l’ablation de moelle d’os du destinataire, permettant ainsi l’engraftment de cellules souches de donneur et empêchant le rejet de la greffe. Ceci est fait en limitant la prolifération des lymphocytes T bénéficiaires en réponse aux cellules de donneur. En outre, les disparités génétiques jouent un rôle important dans l’induction de la maladie, qui dépend également de l’inadéquation mineure du MHC10. Par conséquent, la dose d’irradiation myéloablative varie selon différentes souches de souris (p. ex., BALB/c-C57BL/6).
L’activation des lymphocytes T donneurs par les cellules présentant des antigènes hôtes (APC) est essentielle pour le développement de la DGV. Parmi les APC, les cellules dendritiques (DCs) sont les plus puissantes. Ils sont héréditairement capables d’induire le GVHD en raison de leur absorption supérieure d’antigène, expression des molécules co-stimulatrices de lymphocytes T, et production de cytokines pro-inflammatoires qui polarisent les lymphocytes T en sous-ensembles pathogènes. Les CD bénéficiaires sont essentiels pour faciliter l’amorçage des lymphocytes T et l’induction de GVHD après la transplantation11,12. En conséquence, les CDC sont devenus des cibles intéressantes dans le traitement de GVHD12.
TBI est nécessaire pour améliorer l’engraftment cellulaire donneur. En raison de l’effet TBI, les CD destinataires sont activés et survivent pendant une courte période après la transplantation12. Malgré les progrès importants dans l’utilisation de la bioluminescence ou de la fluorescence, l’établissement d’un modèle efficace pour étudier le rôle des CD bénéficiaires dans le GVHD est toujours difficile.
Parce que les lymphocytes T donneurs sont la force motrice de l’activité GVL, les stratégies de traitement utilisant des médicaments immunosuppresseurs tels que les stéroïdes pour supprimer l’alloreactivité à cellule T causent souvent une rechute de tumeur ou une infection13. Par conséquent, le ciblage des CD destinataires peut fournir une approche alternative pour traiter le GVHD tout en préservant l’effet GVL et en évitant l’infection.
En bref, la présente étude fournit une plate-forme pour comprendre comment différents types de signalisation dans les CD destinataires régule le développement de GVHD et l’effet GVL après BMT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0 100ML</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A20 B-cell lymphoma</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>30954</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl CD4cre</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td></td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R (B220)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220 FITC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10452-85</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c- AF700</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>117319</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD25 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0041-86</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 eFluor&#174; 450 (Pacific Blue&#174; replacement)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>48-0042-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45.1 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0900-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD8a APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-0081-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-5958-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse MHC Class II-antibody APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5320-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TER-119 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Thy1.2</td>
			<td>Bio Excel</td>
			<td>BE0066</td>
			<td>BM generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6 fB-/- mice</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>564</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028</td>
			<td>Transplant recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Donors/Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0251-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5971-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Bilogicals R&#38;D system</td>
			<td>D17051</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352008</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB/NCrl</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>207</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysacharide (LPS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L4391-1MG</td>
			<td>DC mature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS column</td>
			<td>Mitenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Galaxy 170R incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Galaxy 170 R</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scienctific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TER119</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-RAD 320 Biological Irradiator</td>
			<td>Precision X-RAY</td>
			<td>X-RAD 320</td>
			<td>Total Body Irradiation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease

La transplantation allogeneic de moelle (BMT) est une thérapie efficace pour des malignités hématologiques due à l’effet de greffe-contre-leucémie (GVL) pour éradiquer des tumeurs. Cependant, son application est limitée par le développement de la maladie de greffe-contre-hôte (GVHD), une complication majeure de BMT. GVHD est évoqué quand les lymphocytes T dans les greffes de donneur reconnaissentalloantigen exprimées par les cellules de destinataire et montent des attaques immunologiques indésirables contre les tissus sains de destinataire. Ainsi, les thérapies traditionnelles sont conçues pour supprimer l’alloreactivité de T-cellule de donneur. Cependant, ces approches nuisent considérablement à l’effet GVL afin que la survie du receveur ne soit pas améliorée. Il est donc essentiel de comprendre les effets des approches thérapeutiques sur le BMT, le GVL et le GVHD. En raison des capacités de présentation et de sécrétion de cytokine de l’antigène pour stimuler les lymphocytes T donneurs, les cellules dendritiques du receveur jouent un rôle significatif dans l’induction de GVHD. Par conséquent, le ciblage des CD destinataire devient une approche potentielle pour contrôler GVHD. Ce travail fournit une description d’une nouvelle plate-forme BMT pour étudier comment les DCs hôtes régulent les réponses GVH et GVL après la transplantation. Un modèle BMT efficace pour étudier la biologie de la GVHD et du GVL après la transplantation est également présenté.

Le modèle B6 majeur dépareillé MHC (H2kb)-BALB/C (H2kd)correspondait étroitement au développement du GVHD après la transplantation(figure 2). Les six signes cliniques de GVHD établis précédemment par Cooke et coll.16 se sont produits dans les destinataires transplantés avec des lymphocytes T WT-B6 mais pas dans les destinataires transplantés avec BM seul (étape 1.5), qui représentaient le groupe GVHD-...

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Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

La maladie de greffe-contre-hôte est une complication principale après la transplantation allogeneic de moelle. Les cellules dendritiques jouent un rôle critique dans la pathogénie de la maladie de greffe-contre-hôte. L’article actuel décrit une nouvelle plate-forme de transplantation de moelle osseuse pour étudier le rôle des cellules dendritiques dans le développement de la maladie de greffe-contre-hôte et de l’effet de greffe-contre-leucémie.

Plate-forme de transplantation de moelle osseuse pour étudier le rôle des cellules dendritiques dans la maladie de greffe-contre-hôte

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

Ce nouveau protocole de greffe de moelle osseuse peut être utilisé pour étudier comment les cellules dendritiques de l’hôte régulent les réponses greffe contre hôte et greffe contre leucémie après la transplantation. Les régénérations cellulaires ex vivo permettent d’adapter ce protocole pour tester le rôle d’autres cellules immunitaires telles que le macrophage et les neutrophiles simplement en modifiant l’état de la culture. Krystal Hossack, directeur de laboratoire, et Sanjeev Gurshaney, premier cycle, feront la démonstration de la procédure avec moi.Pour la préparation de la moelle osseuse C57BL/6 appauvrie par les cellules T du donneur, récoltez le fémur et le tibia selon les protocoles standard des souris donneurs euthanasiées et transférez les os dans une boîte petri de 92 millimètres de diamètre contenant 1 % de milieu RPMI. À l’aide de ciseaux, retirer les extrémités de chaque os et remplir une seringue de trois millilitres munie d’une aiguille de calibre 26 avec un milieu RPMI frais de 1 %. Insérez l’aiguille dans une extrémité d’un os et pressez le piston pour rincer la moelle osseuse hors de la cavité et dans une passoire cellulaire de collecte.Lorsque toute la moelle osseuse a été recueillie, filtrer les morceaux de moelle osseuse à travers un filtre à mailles de 75 micromètres et transférer la suspension à cellule unique dans un nouveau tube de 50 millilitres. Sédimenter les cellules par centrifugation et résuspendre la pastille à une concentration de 20 fois 10 à six cellules par millilitre dans PBS complétée par 0,5%BSA. Ensuite, ajoutez 0,05 microgramme d’anticorps THI1 par une fois 10 aux six cellules pour une incubation de 30 minutes à quatre degrés Celsius.À la fin de l’incubation, laver les cellules deux fois avec 10 millilitres de PBS glacé et resuspendre la pastille à deux fois 10 à la concentration de sept cellules par millilitre en 0,5%BSA complété par 10% jeune complément lapin et 2%DNAse dans l’eau stérile pour une incubation de 45 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, lavez les cellules deux fois avec 15 millilitres de PBS frais par lavage et réutilisez la pastille en 20 millilitres de PBS contenant 0,5 % de BSA. Mettre en commun les ganglions lymphatiques et la rate dans une passoire pore de 40 micromètres et utiliser un piston à seringues pour macérer les tissus à travers les filtres pour libérer les cellules.Laver la passoire et le piston avec le milieu RPMI complété par 1%FBS pour recueillir toutes les cellules et sédimenter les cellules par centrifugation. Ajouter cinq millilitres de tampon de lyse ACK à la pastille cellulaire. Après cinq minutes à température ambiante, arrêter la réaction avec cinq millilitres de milieu complété par 1%FBS et pelleter les globules blancs par centrifugation.Resuspendez la pastille en cinq millilitres de tampon MACS pour compter et diluer les cellules à une concentration de deux fois 10 à huit cellules par millilitre dans le tampon MACS frais. Ajoutez la concentration appropriée d’anticorps anti-érythroïdes, anti granulocytes, anti-B et anti-NK-cellules appauvrissant par une fois 10 aux six cellules pour une incubation de 15 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, lavez les cellules avec 10 millilitres de tampon MACS froid de glace et résépendez la pastille à une fois 10 à la concentration de huit cellules par millilitre dans le tampon MACS frais.Ensuite, ajoutez 0,22 microlitres de microbilles anti-biotine par une fois 10 aux six cellules avec mélange pour une incubation de 15 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, lavez les cellules avec 10 millilitres de tampon MACS glacé et recueillez les cellules T enrichies non liées par séparation magnétique des perles à l’aide du séparateur MACSxpress selon les protocoles standard d’isolation des perles. À la fin de la séparation, sédimenter les cellules T par centrifugation et resuspendre la pastille en cinq millilitres de tampon MACS frais pour le comptage.Pour générer des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse, isolez la moelle osseuse des fémurs de type sauvage ou des souris knock-out du facteur B comme démontré et lyse les globules rouges en cinq millilitres de tampon de lyse ACK, arrêtant la réaction avec 10 millilitres de RPMI complétés par 1%FBS après cinq minutes. Après avoir recueilli les cellules sanguines entières par centrifugation, réutilisez la pastille en 10 millilitres de culture moyenne à deux fois 10 à la sixième cellule par millilitre de concentration et ajoutez 20 nanogrammes par millilitre de GM-CSF aux cellules avant d’ensemencer 10 millilitres de cellules sur des plats petri individuels de 100 x 15 millimètres à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant six jours. Le sixième jour, activez les cultures de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse avec 25 microgrammes par millilitre de LPS par plaque.Au moins 85% des cellules de moelle osseuse cultivés se différencient en cellules dendritiques. La pureté des cellules T après enrichissement de perle magnétique est de 90 %Le modèle C57BL/6 BALB/c dépareillé majeur du MHC correspond étroitement au développement de la GVHD après la transplantation. Le pic de gravité se produit environ 11 jours après le transfert cellulaire suivi d’une réduction des scores cliniques et de la récupération du poids corporel jusqu’au jour 16.Les destinataires ont uniformément succombé au GVHD par 30 à 40 jours posttransplant. Fait intéressant, la transplantation avec des cellules dendritiques de ko de facteur B améliore la survie du receveur et les scores cliniques de GVHD. Le lymphome à cellules B A20 induit par Luciferase permet de surveiller la croissance tumorale chez les animaux vivants.Dans cette expérience représentative, tous les destinataires sauvages de type BALB/c qui ont reçu la moelle seule plus A20 sont morts d’une rechute de tumeur. Les receveurs sauvages de type BALB/c transplantés avec des cellules T du donneur appauvries en ACC1 dérivées de la moelle osseuse sont morts de la GVHD. En outre, les animaux qui ont reçu la moelle osseuse du donneur et les cellules T appauvries de l’ACC1 sont morts de la GVHD et de la rechute de tumeur.Pour générer suffisamment de cellules de moelle osseuse, les os du tibia et du fémur recueillis doivent être complètement exempts de tissu musculaire avant la correction de la moelle osseuse. La purification négative des cellules de moelle osseuse avec biotinylase anti-CD3 et MicroBeads anti-biotine peut également par effectuée pour épuiser le lymphocyte de la moelle osseuse.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Recherche

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