Name: bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease
Uploaded: 2020-03-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease at JoVE.com

Diese Studie wird unterstützt durch das Start-up-Stipendium des University of Central Florida College of Medicine (an HN), das Start-up-Stipendium des University of Pittsburgh Medical Center Hillman Cancer Center (an HL), das United States NIH Grant #1P20CA210300-01 und das vietnamesische Gesundheitsministerium Grant #4694/QD-BYT (zu PTH). Wir danken Dr. Xue-zhong Yu von der Medical University of South Carolina für die Bereitstellung von Materialien für die Studie.

Die experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Central Florida genehmigt.
1. GVHD-Induktion
HINWEIS: Die allogene Knochenmark-Zelltransplantation (BM) (Schritt 1.2) erfolgt innerhalb von 24 h nach beeiritierter Bestrahlung. Alle unten beschriebenen Verfahren werden in einer sterilen Umgebung durchgeführt. Führen Sie das Verfahren in einer Gewebekulturhaube durch und verwenden Sie gefilterte Reagenzien.
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	<li>Shlomchik, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).</li><li>Appelbaum, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+cell+transplantation+as+immunotherapy.">Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy.</a> Nature. 411, 385-389 (2001).</li><li>Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+graft-versus-host+disease+biology+and+therapy.">Advances in graft-versus-host disease biology and therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).</li><li>Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posaconazole+or+fluconazole+for+prophylaxis+in+severe+graft-versus-host+disease.">Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease.</a> New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).</li><li>Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+specific+cell+populations+by+complement+depletion.">Depletion of specific cell populations by complement depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li><li>Nguyen, H. 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The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Nguyen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+C3a+and+C5a+receptors+promote+GVHD+by+suppressing+mitophagy+in+recipient+dendritic+cells.">Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).</li><li>McNutt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Science. 342, 1417 (2013).</li><li>Negrin, R. S., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+using+bioluminescence:+a+tool+for+probing+graft-versus-host+disease.">In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).</li><li>Roy, D. 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Die Verwendung von Stammzellen für eine bestimmte Person ist ein effektiver Ansatz zur Behandlung von fortgeschrittenen und resistenten Krebsarten18. Kleine Molekülpharmazeutika sind jedoch seit langem ein Hauptfokus der personalisierten Krebstherapie. Andererseits kann in der Zelltherapie eine Vielzahl von Wechselwirkungen zwischen Spender und Wirt die Behandlungsergebnisse entscheidend beeinflussen, wie z.B. die Entwicklung von GVHD nach BMT1.
<p class="jove_content...

Allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (BMT) ist eine wirksame Therapie zur Behandlung hämatologischer Malignome1,2 durch den Transplantat-versus-Leukämie-Effekt (GVL)3. Spenderlymphozyten führen jedoch immer unerwünschte immunologische Angriffe auf Empfängergewebe ein, ein Prozess, der als Transplantat-versus-Host-Krankheit (GVHD)4bezeichnet wird.
Murine Modelle von GVHD sind ein wirksames Werkzeug, um die Biologie der GVHD und die GVL-Antwort5zu studieren. Mäuse sind ein kostengünstiges Forschungstiermodell. Sie sind klein und effizient mit Molekülen und Biologika in frühen Phasen der Entwicklung6dosiert. Mäuse sind ideale Forschungstiere für genetische Manipulationsstudien, weil sie genetisch gut definiert sind, was ideal für die Untersuchung biologischer Pfade und Mechanismen ist6. Mehrere Maus-Haupt-Histokompatibilitätskomplex (MHC) MHC-unübereinstimmende Modelle von GVHD haben sich gut etabliert, wie C57BL/6 (H2b) zu BALB/c (H2d) und FVB (H2q)'C57BL/6 (H2b)5,7. Dies sind besonders wertvolle Modelle, um die Rolle einzelner Zelltypen, Gene und Faktoren zu bestimmen, die GVHD beeinflussen. Die Transplantation von C57/BL/6 (H2b) Elternspendern an Empfänger mit Mutationen in MHC I (B6.C-H2bm1) und/oder MHC II (B6.C-H2bm12) ergab, dass eine Diskrepanz sowohl in der MHC-Klasse I als auch in der Klasse II eine wichtige Voraussetzung für die Entwicklung von akutem GVHD ist. Dies deutet darauf hin, dass sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zellen für die Krankheitsentwicklung7,8benötigt werden. GVHD ist auch an einer entzündlichen Kaskade beteiligt, die als "pro-inflammatorischezytokine Sturm"9bekannt ist. Die häufigste Konditionierungsmethode in murinen Modellen ist die Ganzkörperbestrahlung (TBI) durch Röntgen oder 137Cs. Dies führt zur Knochenmarkablation des Empfängers, wodurch eine Spenderstammzelltransplantation ermöglicht und eine Abstoßung des Transplantats verhindert wird. Dies geschieht durch die Begrenzung der Proliferation von Empfänger-T-Zellen als Reaktion auf Spenderzellen. Darüber hinaus spielen genetische Disparitäten eine wichtige Rolle bei der Krankheitsinduktion, die auch von geringfügigen MHC-Mismatch10abhängt. Daher variiert die myeloablative Bestrahlungsdosis in verschiedenen Mausstämmen (z. B. BALB/c-C57BL/6).
Die Aktivierung von Spender-T-Zellen durch Wirtsantigen-präsentierende Zellen (APCs) ist für die GVHD-Entwicklung unerlässlich. Unter den APCs sind dendritische Zellen (DCs) die stärksten. Sie sind vererbbar in der Lage, GVHD aufgrund ihrer überlegenen Antigenaufnahme, expression ierung von T-Zell-Kostimulierenden Molekülen und der Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen, die T-Zellen zu pathogenen Teilmengen polarisieren, zu induzieren. Empfänger-DCs sind entscheidend für die Erleichterung der T-Zell-Grundierung und GVHD-Induktion nach der Transplantation11,12. Dementsprechend sind DCs zu interessanten Zielen bei der Behandlung von GVHD12geworden.
TBI ist erforderlich, um die Spenderzelltransplantation zu verbessern. Durch den TBI-Effekt werden Empfänger-DCs aktiviert und überleben nach der Transplantationkurzzeitig 12. Trotz erheblicher Fortschritte bei der Verwendung von Biolumineszenz oder Fluoreszenz ist die Etablierung eines effektiven Modells zur Untersuchung der Rolle von Empfänger-DCs bei der GVHD nach wie vor eine Herausforderung.
Da Spender-T-Zellen die treibende Kraft für GVL-Aktivität sind, Behandlungsstrategien mit immunsuppressiven Medikamenten wie Steroiden zur Unterdrückung der T-Zell-Alloreaktivität verursachen oft Tumorrückfall oder Infektion13. Daher kann die Ausrichtung auf Empfänger-DCs einen alternativen Ansatz zur Behandlung von GVHD bieten, während der GVL-Effekt erhalten und Infektionen vermieden werden.
Kurz gesagt, die aktuelle Studie bietet eine Plattform, um zu verstehen, wie verschiedene Arten der Signalisierung in Empfänger-DCs die GVHD-Entwicklung und den GVL-Effekt nach BMT regulieren.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0 100ML</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A20 B-cell lymphoma</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>30954</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl CD4cre</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td></td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R (B220)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220 FITC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10452-85</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c- AF700</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>117319</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD25 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0041-86</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 eFluor&#174; 450 (Pacific Blue&#174; replacement)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>48-0042-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45.1 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0900-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD8a APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-0081-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-5958-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse MHC Class II-antibody APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5320-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TER-119 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Thy1.2</td>
			<td>Bio Excel</td>
			<td>BE0066</td>
			<td>BM generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6 fB-/- mice</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>564</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028</td>
			<td>Transplant recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Donors/Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0251-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5971-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Bilogicals R&#38;D system</td>
			<td>D17051</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352008</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB/NCrl</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>207</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysacharide (LPS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L4391-1MG</td>
			<td>DC mature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS column</td>
			<td>Mitenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Galaxy 170R incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Galaxy 170 R</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scienctific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TER119</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-RAD 320 Biological Irradiator</td>
			<td>Precision X-RAY</td>
			<td>X-RAD 320</td>
			<td>Total Body Irradiation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease

Allogene Knochenmarktransplantation (BMT) ist eine wirksame Therapie bei hämatologischen Malignitäten aufgrund des Transplantat-versus-Leukämie-Effekts (GVL), um Tumore auszurotten. Jedoch, seine Anwendung ist durch die Entwicklung der Transplantat-versus-Host-Krankheit (GVHD), eine große Komplikation von BMT begrenzt. GVHD wird evoziert, wenn T-Zellen in den Spendertransplantaten alloantigen erkennen, das von Empfängerzellen exprimiert wird, und unerwünschte immunologische Angriffe auf gesunde Gewebe des Empfängers durchführen. So sind traditionelle Therapien entwickelt, um Spender T-Zell Alloreaktivität zu unterdrücken. Diese Ansätze beeinträchtigen jedoch den GVL-Effekt erheblich, so dass das Überleben des Empfängers nicht verbessert wird. Das Verständnis der Auswirkungen therapeutischer Ansätze auf BMT, GVL und GVHD ist daher von wesentlicher Bedeutung. Aufgrund der Antigen-präsentations- und Zytokin-Sekretionskapazitäten zur Stimulierung von Spender-T-Zellen spielen empfänger dendritische Zellen (DCs) eine wichtige Rolle bei der Induktion von GVHD. Daher wird die Ausrichtung von Empfänger-DCs zu einem potenziellen Ansatz für die Steuerung von GVHD. Diese Arbeit bietet eine Beschreibung einer neuartigen BMT-Plattform, um zu untersuchen, wie Host DCs GVH- und GVL-Antworten nach der Transplantation regulieren. Ebenfalls vorgestellt wird ein effektives BMT-Modell zur Untersuchung der Biologie von GVHD und GVL nach der Transplantation.

Das große MHC-Mismatched-B6-Modell (H2kb)-BALB/C (H2kd) entsprach eng der GVHD-Entwicklung nach der Transplantation (Abbildung 2). Alle sechs zuvor von Cooke et al.16 festgestellten GVHD-Symptome traten bei den mit WT-B6-T-Zellen transplantierten Empfängern auf, nicht jedoch bei den Empfängern, die mit BM allein transplantiert wurden (Schritt 1.5), die die GVHD-negative Gruppe darstellten. In diesem Modell gibt...

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Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Graft-versus-Host-Krankheit ist eine große Komplikation nach allogenen Knochenmarktransplantation. Dendritische Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Transplantat-versus-Host-Krankheit. Der aktuelle Artikel beschreibt eine neuartige Knochenmarktransplantationsplattform, um die Rolle dendritischer Zellen bei der Entwicklung von Transplantat-versus-Host-Krankheit und dem Transplantat-versus-Leukämie-Effekt zu untersuchen.

Knochenmarktransplantationsplattform zur Untersuchung der Rolle dendritischer Zellen bei Graft-versus-Host-Krankheit

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

Dieses neuartige Knochenmarktransplantationsprotokoll kann verwendet werden, um zu untersuchen, wie Gast dendritische Zellen Transplantat-versus-Host- und Transplantat-versus-Leukämie-Antworten nach der Transplantation regulieren. Ex-vivo-Zellregenerationen ermöglichen es, dieses Protokoll anzupassen, um die Rolle anderer Immunzellpopulationen wie Makrophagen und Neutrophilen einfach durch Modifizieren des Kulturzustands zu testen. Demonstrieren das Verfahren mit mir wird Laborleiter Krystal Hossack und Bachelor Sanjeev Gurshaney.Für spendertes T-Zell-erschöpftes C57BL/6 Knochenmarkpräparat, Ernten Sie den Oberschenkelknochen und die Tibia nach Standardprotokollen von eingeschläferten Spendermäusen und übertragen Sie die Knochen in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 92 Millimetern, die 1%RPMI-Medium enthält. Entfernen Sie mit einer Schere die Enden von jedem Knochen und füllen Sie eine Drei-Milliliter-Spritze, die mit einer 26-Spur-Nadel mit frischem 1%RPMI-Medium ausgestattet ist. Setzen Sie die Nadel in ein Ende eines Knochens ein und drücken Sie den Kolben, um das Knochenmark aus der Höhle und in ein Sammelzellsieb zu spülen.Wenn das gesamte Knochenmark gesammelt ist, belasten Sie die Knochenmarkstücke durch einen 75-Mikrometer-Netzfilter und übertragen Sie die einzellige Suspension in ein neues 50-Milliliter-Rohr. Sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet 20 mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter-Konzentration in PBS, ergänzt mit 0,5%BSA, wieder auf. Als nächstes fügen Sie 0,05 Mikrogramm THI1-Antikörper pro mal 10 zu den sechs Zellen für eine 30-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius hinzu.Am Ende der Inkubation die Zellen zweimal mit 10 Millilitereis iskaltes PBS waschen und das Pellet bei einer 2-fachen 10 bis sieben Milliliter-Konzentration in 0,5% BSA, ergänzt mit 10%jungkaninchenkomplementiert und 2%DNAse in sterilem Wasser, für eine 45-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius wieder aufsetzen. Am Ende der Inkubation die Zellen zweimal mit 15 Millilitern frischer PBS pro Waschgang waschen und das Pellet in 20 Milliliter PBS mit 0,5%BSA wieder aufhängen. Bündeln Sie die Lymphknoten und die Milz in einem 40 Mikrometer Porensieb und verwenden Sie einen Spritzenkolben, um das Gewebe durch die Filter zu mazerieren, um die Zellen freizusetzen.Waschen Sie das Sieb und den Kolben mit RPMI Medium, ergänzt mit 1%FBS, um alle Zellen zu sammeln und die Zellen durch Zentrifugation zu sedimentieren. Fügen Sie dem Zellpellet fünf Milliliter ACK-Lysepuffer hinzu. Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur, stoppen Sie die Reaktion mit fünf Milliliter Medium ergänzt mit 1%FBS und Pellet die weißen Blutkörperchen durch Zentrifugation.Setzen Sie das Pellet in fünf Milliliter MACS-Puffer zum Zählen aus und verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von zwei mal 10 bis zu den acht Zellen pro Milliliter in frischem MACS-Puffer. Fügen Sie die entsprechende Konzentration von Anti-Erythroid-, Anti-Granulozyten-, Anti-B-Zell- und Anti-NK-Zell-Depletionsantikörpern pro mal 10 zu den sechs Zellen für eine 15-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius hinzu. Am Ende der Inkubation die Zellen mit 10 Milliliterem eiskaltem MACS-Puffer waschen und das Pellet einmal 10 bis zu den acht Zellen pro Milliliter Konzentration in frischem MACS-Puffer wieder aufsetzen.Als nächstes fügen Sie 0,22 Mikroliter Anti-Biotin MicroBeads pro mal 10 zu den sechs Zellen hinzu, wobei Sie eine 15-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius mischen. Am Ende der Inkubation die Zellen mit 10 Milliliterem eiskaltem MACS-Puffer waschen und die ungebundenen angereicherten T-Zellen durch magnetische Perlentrennung mittels MACSxpress-Separator nach Standard-Perlenisolationsprotokollen sammeln. Am Ende der Trennung die T-Zellen durch Zentrifugation sedimentieren und das Pellet in fünf Millilitern frischen MACS-Puffers zum Zählen wieder aufsetzen.Um knochenmarkabgeleitete dendritische Zellen zu erzeugen, isolieren Sie das Knochenmark von den Oberschenkelknochen von Wildtyp- oder Faktor-B-Knockout-Mäusen, wie gezeigt, und lysieren die roten Blutkörperchen in fünf MilliliterACK-Lysepuffer, wodurch die Reaktion mit 10 Millilitern RPMI nach fünf Minuten mit 1%FBS ergänzt wird. Nach dem Sammeln der Vollblutzellen durch Zentrifugation, setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter Kulturmedium auf ein zwei mal 10 bis sechs milliliter Konzentration und fügen Sie 20 Nanogramm pro Milliliter GM-CSF zu den Zellen, bevor Sie 10 Milliliter Zellen auf einzelne 100 mal 15 Millimeter Petrischalen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für sechs Tage säen. Aktivieren Sie am sechsten Tag die aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellkulturen mit 25 Mikrogramm pro Milliliter LPS pro Platte.Mindestens 85% der kultivierten Knochenmarkzellen unterscheiden sich in dendritischen Zellen. Die T-Zell-Reinheit nach magnetischer Perlenanreicherung beträgt 90%Das große MHC-Modell C57BL/6 BALB/c entspricht eng der GVHD-Entwicklung nach der Transplantation. Der Höhepunkt der Schwere tritt etwa 11 Tage nach der Zellübertragung auf, gefolgt von einer Verringerung der klinischen Werte und der Körpergewichtsregeneration bis zum 16. Tag.Die Empfänger erlagen der GVHD nach der Transplantation 30 bis 40 Tage lang. Interessanterweise verbessert die Transplantation mit Faktor B Knockout dendritischen Zellen das Überleben der Empfänger und die klinischen GVHD-Werte. Luziferase-transduced A20 B-Zell-Lymphom ermöglicht die Überwachung des Tumorwachstums bei lebenden Tieren.In diesem repräsentativen Experiment starben alle Wild-Typ-BALB/c-Empfänger, die allein Knochenmark plus A20 erhielten, an einem Tumorrückfall. Wildtyp BALB/c-Empfänger, die mit knochenmark-abgeleiteten ACC1-depleted Spender-T-Zellen transplantiert wurden, starben an GVHD. Darüber hinaus starben Tiere, die Spenderknochenmark und ACC1-erschöpfte T-Zellen erhielten, an GVHD und Tumorrückfall.Um genügend Knochenmarkzellen zu erzeugen, müssen die gesammelten Tibia- und Oberschenkelknochen vor der Knochenmarkkorrektur vollständig frei von Muskelgewebe sein. Negative Reinigung der Knochenmarkzellen mit Biotinylase Anti-CD3 und Anti-Biotin MicroBeads kann auch pro durchgeführt, um die Lymphozyten aus dem Knochenmark zu erschöpfen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Erzeugung und Kennzeichnung von Murine Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen mit Qdot Nanokristalle für Tracking-Studien

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und<em&gt; In Vivo</em&gt; T-Zell-Überwachung mit einem MHC-matched Mausmodell

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Differenziert Functional Roles of Gene Expression von Immun-und Nicht-Immunzellen in Mouse Colitis von Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methoden, um die regulatorische Rolle kleiner RNAs und Ribosomal Belegung von Untersuchen<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Erzeugung und Identifizierung von GM-CSF Abgeleitet Alveolare ähnlichen Makrophagen und dendritische Zellen aus Knochenmark der Maus

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Precision-cut Maus Lung Slices Live-Pulmonary Dendritische Zellen sichtbar zu machen

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

An In Vivo Mouse Model to Measure NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Eine In Vivo Mausmodell Maßnahme naive CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch Knochenmark-abgeleitete Dendritische Zellen

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Induktion der intestinalen Graft - Versus - Host-Seuche und seiner Mini-endoskopische Beurteilung in Live Mäuse

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Induktion und Bewertung der Graft-Versus-Host-Krankheit in einem xenogenen Murine-Modell und Quantifizierung menschlicher T-Zellen in Mausgeweben mit digitaler PCR

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...