Name: bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease
Uploaded: 2020-03-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי אוניברסיטת מרכז פלורידה המכללה לרפואה סטארט-up מענק (כדי HN), אוניברסיטת פיטסבורג מרכז רפואי הילמן מרכז הסרטן להתחיל מענק (כדי HL), ארצות הברית NIH מענק #1P20CA210300-01 ו-ויאטנמית משרד מענק בריאות #4694/QD-BYT (כדי PTH). אנו מודים ד ר Xue-zhong יו באוניברסיטת הרפואית של דרום קרוליינה עבור מתן חומרים למחקר.

ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש באוניברסיטת מרכז פלורידה.
1. האינדוקציה GVHD
הערה: מח עצם Allogeneic (BM) השתלת תא (שלב 1.2) מבוצעת בתוך 24 שעות לאחר ההקרנה. כל ההליכים המתוארים להלן מתבצעים בסביבה סטרילית. לבצע את ההליך במכסה התרבו...

<ol>
	<li>Shlomchik, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).</li><li>Appelbaum, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+cell+transplantation+as+immunotherapy.">Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy.</a> Nature. 411, 385-389 (2001).</li><li>Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+graft-versus-host+disease+biology+and+therapy.">Advances in graft-versus-host disease biology and therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).</li><li>Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2010+report+from+the+Center+for+International+Blood+and+Marrow+Transplant+Research+(CIBMTR):+current+uses+and+outcomes+of+hematopoietic+cell+transplants+for+blood+and+bone+marrow+disorders.">2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders.</a> Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).</li><li>Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+graft-versus-host+disease:+advances+and+limitations.">Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations.</a> Disease Model &amp; Mechanism. 4, 318-333 (2011).</li><li>Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+for+Preclinical+Development+of+Allogeneic+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation.</a> ILAR Journal. , ily006 (2018).</li><li>Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+T+cell+subsets+in+lethal+graft-versus-host+disease+(GVHD)+directed+to+class+I+versus+class+II+H-2+differences.+II.+Protective+effects+of+L3T4++cells+in+anti-class+II+GVHD.">Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD.</a> Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).</li><li>Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosuppressor+and+allohelper+T+cells+in+acute+and+chronic+graft-vs-host+disease.+I.+Alloreactive+suppressor+cells+rather+than+killer+T+cells+appear+to+be+the+decisive+effector+cells+in+lethal+graft-vs.-host+disease.">Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).</li><li>Lu, Y., Waller, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomous+role+of+interferon-gamma+in+allogeneic+bone+marrow+transplant.">Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).</li><li>Abdollahi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+platelet-derived+growth+factor+signaling+attenuates+pulmonary+fibrosis.">Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li><li>Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+regulation+of+graft-versus-host+disease+and+graft-versus-leukemia.">Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia.</a> Blood. 119, 5088-5103 (2012).</li><li>Ullmann, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posaconazole+or+fluconazole+for+prophylaxis+in+severe+graft-versus-host+disease.">Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease.</a> New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).</li><li>Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+specific+cell+populations+by+complement+depletion.">Depletion of specific cell populations by complement depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li><li>Nguyen, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+alloantigen-activated+T+cells+after+hematopoietic+cell+transplantation.">Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Nguyen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+C3a+and+C5a+receptors+promote+GVHD+by+suppressing+mitophagy+in+recipient+dendritic+cells.">Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).</li><li>McNutt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Science. 342, 1417 (2013).</li><li>Negrin, R. S., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+using+bioluminescence:+a+tool+for+probing+graft-versus-host+disease.">In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).</li><li>Roy, D. C., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+vs+minor+histocompatibility+antigens.">Major vs minor histocompatibility antigens.</a> Blood. 129, 664-666 (2017).</li><li>Gendelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+conditioning+is+a+primary+determinant+in+modulating+the+effect+of+IL-7+on+murine+graft-versus-host+disease.">Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease.</a> Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HY-Specific+Induced+Regulatory+T+Cells+Display+High+Specificity+and+Efficacy+in+the+Prevention+of+Acute+Graft-versus-Host+Disease.">HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease.</a> Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).</li><li>Zeiser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+CD30+signaling+is+critical+for+adoptively+transferred+CD4+CD25++regulatory+T+cells+in+prevention+of+acute+graft-versus-host+disease.">Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 109, 2225-2233 (2007).</li><li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice.">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li></ol>

השימוש בתאי גזע להתאים אדם מסוים היא גישה יעילה לטיפול בסרטן מתקדם ועמיד18. תרופות מולקולה קטנה, עם זאת, נותרו זמן רב המוקד העיקרי של טיפול בסרטן אישית. מצד שני, בטיפול הסלולר המון אינטראקציות בין התורמים והמארחים יכולים להשפיע באופן מוחלט על תוצאות הטיפול, כגון פיתוח של GVHD לאח?...

שיטת השתלת תא גזע המטמית (bmt) היא טיפול יעיל לטיפול בממאירות המטולוגית1,2 דרך השתל-נגד לוקמיה (gvl) אפקט3. עם זאת, לימפוציטים התורם תמיד לטעון התקפות אימונולוגיים לא רצויים נגד רקמות הנמען, תהליך הנקרא השתל-מול-מארחים מחלה (GVHD)4.
מודלים murine של GVHD הם כלי יעיל כדי ללמוד את הביולוגיה של GVHD ואת תגובת GVHD5. עכברים הם מודל חסכוני בחיות מחקר. הם קטנים וביעילות עם מולקולות ומוצרים ביולוגיים בשלבים מוקדמים של פיתוח6. עכברים הם חיות מחקר אידיאלי למחקרים גנטיים מניפולציה כי הם מוגדרים היטב גנטית, אשר אידיאלי עבור לימוד מסלולים ביולוגיים ומנגנונים6. מספר העכבר הגדול ביותר מורכב היסטולתאימות (mhc) mhc-מודלים לא תואמים של gvhd הוקמה היטב, כגון C57BL/6 (h2ב) כדי balb/c (h2d) ו fvb (h2q) → C57BL/6 (h2ב)5,7. אלה הם דגמים יקרי ערך במיוחד כדי לקבוע את התפקיד של סוגי תאים בודדים, גנים, וגורמים המשפיעים על GVHD. השתלת מ C57/BL/6 (H2ב) תורמים הורים לנמענים עם מוטציות ב mhc I (B6. c-H2bm1) ו/או Mhc II (B6. c-H2bm12) חשף כי אי התאמה הן בכיתה mhc i ו-class ii היא דרישה חשובה להתפתחות של gvhd חריפה. זה מרמז כי הן CD4+ ו CD8+ T-תאים נדרשים להתפתחות המחלה7,8. Gvhd הוא גם מעורב במפל דלקתי המכונה "הפרו-דלקת ציטוקינים" סערה9. שיטת המיזוג הנפוצה ביותר במודלים murine היא הקרנה מוחלטת של הגוף (TBI) על ידי X-ray או 137Cs. הדבר מוביל לאבלציה של המטופל, ובכך מאפשר לתאי גזע של תורם להתחשבן ולמנוע דחייה של השתל. פעולה זו מתבצעת על-ידי הגבלת ההתפשטות של תאי T של הנמען בתגובה לתאי תורם. בנוסף, הפערים הגנטיים ממלאים תפקיד חשוב באינדוקציה למחלות, שתלויה גם באי-התאמה משנית של MHC10. לכן, מינון myeloablative הקרנה משתנה בזנים שונים של העכבר (g., BALB/c → C57BL/6).
הפעלת תאים T-בתאי התורם על ידי מארח אנטיגן הצגת תאים (APCs) חיוני עבור פיתוח GVHD. בין ה-APCs, התאים הדנדריטים (DCs) הם החזקים ביותר. הם בעלי יכולת לספק GVHD בשל ספיגת אנטיגן מעולה שלהם, ביטוי של T-cell שיתוף מולקולות, והפקה של ציטוקינים pro-דלקתיים המיקטט T-תאים לתוך מערכות המשנה הפתוגניים. בקרי תחום של נמענים הם קריטיים להקלה על הטרמה של תא T והשראה לאחר השתלת11,12. בהתאם לכך, DCs הפכו למטרות מעניינות בטיפול ב-GVHD12.
נדרש TBI כדי להגביר את התיאום של תא התורם. עקב האפקט TBI, Dc DCs מופעלים ולשרוד זמן קצר לאחר ההשתלה12. למרות הפיתוחים העיקריים בשימוש בביולומינציה או בזריחה, הקמת מודל אפקטיבי לחקר התפקיד של בקרי התחום של הנמענים ב-GVHD עדיין מאתגרת.
מכיוון T-cell התורם הם כוח המניע של פעילות GVL, אסטרטגיות טיפול באמצעות תרופות מדכאים חיסוני כגון סטרואידים כדי לדכא את הפעילות alloreactivity לעתים קרובות לגרום להישנות הגידול או זיהום13. לכן, בקרי תחום של נמענים עלולים לספק גישה חלופית לטיפול ב-GVHD תוך שמירה על האפקט של GVHD והימנעות מהידבקות.
בקצרה, המחקר הנוכחי מספק פלטפורמה כדי להבין כיצד סוגים שונים של איתות בקרי Dc של נמענים מסדיר פיתוח GVHD והאפקט GVHD לאחר BMT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0 100ML</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A20 B-cell lymphoma</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>30954</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl CD4cre</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td></td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R (B220)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220 FITC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10452-85</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c- AF700</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>117319</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD25 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0041-86</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 eFluor&#174; 450 (Pacific Blue&#174; replacement)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>48-0042-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45.1 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0900-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD8a APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-0081-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-5958-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse MHC Class II-antibody APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5320-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TER-119 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Thy1.2</td>
			<td>Bio Excel</td>
			<td>BE0066</td>
			<td>BM generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6 fB-/- mice</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>564</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028</td>
			<td>Transplant recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Donors/Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0251-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5971-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Bilogicals R&#38;D system</td>
			<td>D17051</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352008</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB/NCrl</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>207</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysacharide (LPS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L4391-1MG</td>
			<td>DC mature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS column</td>
			<td>Mitenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Galaxy 170R incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Galaxy 170 R</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scienctific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TER119</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-RAD 320 Biological Irradiator</td>
			<td>Precision X-RAY</td>
			<td>X-RAD 320</td>
			<td>Total Body Irradiation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease

השתלת מח עצם אלוגנאית (BMT) הוא טיפול יעיל עבור ממאירות המטולוגית בשל השפעת השתל נגד לוקמיה (GVL) האפקט לבער גידולים. עם זאת, היישום שלו מוגבל על ידי פיתוח של השתל-מול-מארחים מחלה (GVHD), סיבוך גדול של BMT. GVHD היא עוררה כאשר T-תאים ב שתלי התורם העצמית המתבטאת באמצעות התאים הנמען ולטעון התקפות אימונולוגיים לא רצויים נגד רקמות בריאות הנמען. לפיכך, טיפולים מסורתיים נועדו לדכא את כל פעילות ה-T-cell של התורם. עם זאת, גישות אלה פוגעות באופן משמעותי באפקט GVL כך שהישרדותו של הנמען אינה משופרת. הבנת ההשפעות של גישות טיפוליות על BMT, GVL, ו-GVL, כך חיוני. בגלל האנטיגן-הצגת ו cy, הפרשה יכולות לעורר את התורמים T-תאים, תאים דנדריטים הנמען (DCs) לשחק תפקיד משמעותי אינדוקציה של GVHD. משום כך, מיקוד בקרי תחום של נמענים הופך לגישה פוטנציאלית לשליטה ב-GVHD. עבודה זו מספקת תיאור של פלטפורמת BMT הרומן לחקור כיצד DCs מארחים להסדיר את התגובות גבול ו GVL לאחר ההשתלה. הציג גם מודל BMT יעיל ללמוד את הביולוגיה של GVHD ו GVHD לאחר ההשתלה.

ה-MHC הגדול-לא תואם B6 (H2kb)-balb/C (H2kd) מודל התכתב היטב לפיתוח gvhd לאחר ההשתלה (איור 2). כל ששת הסימנים הקליניים GVHD שנקבעו בעבר על ידי קוק ואח '16 אירע הנמענים המושתלים עם WT-B6 T-תאים, אבל לא הנמענים מושתלים עם BM לבד (שלב 1.5), אשר ייצגו את הקבוצה gvhd-?...

Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease at JoVE.com

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

שתל-מול-מארח מחלה הוא סיבוך גדול לאחר השתלת מח עצם allogeneic. תאים דנדריטים לשחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של השתל-מול-מארח המחלה. המאמר הנוכחי מתאר פלטפורמת השתלת מח עצם רומן כדי לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים בפיתוח של מחלת השתל מול מארח את השתל-נגד לוקמיה אפקט.

עצם השתלת מח פלטפורמת לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים במחלה שתל-מול מארח

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

פרוטוקול השתלת מח עצם חדשני זה יכול לשמש כדי לחקור כיצד תאים דנדריטיים מארחים מווסתים תגובות השתל-לעומת-מארח-נגד לוקמיה לאחר ההשתלה. התחדשות תאי ה-Ex vivo מאפשרת להתאים פרוטוקול זה כדי לבדוק את תפקידה של אוכלוסיית תאים חיסוניים אחרים כגון מקרופאג' ונויטרופילים פשוט על ידי שינוי מצב התרבות. הדגמת ההליך איתי תהיה מנהל המעבדה קריסטל הוסק ותחתון סנג'יב גורשאני.לתורם T-cell מדולדל C57BL/6 הכנת מח עצם, לקצור את עצם הירך ואת השוקה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים מעכברים תורמים המתת דם ולהעביר את העצמות לתוך צלחת פטרי בקוטר 92 מילימטר המכיל 1%RPMI בינוני. באמצעות מספריים, להסיר את הקצוות מכל עצם ולמלא מזרק שלושה מיליליטר מצויד מחט 26 מד עם טרי 1% RPMI בינוני. הכנס את המחט לקצה אחד של עצם אחת ודכא את הבוכנה כדי לשטוף את מח העצם מתוך החלל לתוך מסננת תא איסוף.כאשר כל מח העצם נאסף, מסננים את חתיכות מח העצם דרך מסנן רשת 75 מיקרומטר ומעבירים את המתלה החד-תאי לצינור חדש של 50 מיליליטר. להרוס את התאים על ידי צנטריפוגה ולתלות מחדש את גלולה ב 20 פעמים 10 לשישה תאים לריכוז מיליליטר ב PBS בתוספת 0.5%BSA. לאחר מכן, להוסיף 0.05 מיקרוגרם של נוגדן THI1 לכל אחד פעמים 10 לשישה תאים עבור דגירה של 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר של קרח קר PBS ו resuspend את גלולה בשתי פעמים 10 לריכוז שבעה תאים למיליליטר ב 0.5% BSA בתוספת 10% ארנב צעיר להשלים ו 2% DNAse במים סטריליים עבור דגירה של 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם 15 מיליליטר של PBS טרי לכל לשטוף מחדש את גלולה ב 20 מיליליטר של PBS המכיל 0.5%BSA. בריכת בלוטות הלימפה ואת הטחול מסננת נקבוביות 40 מיקרומטר ולהשתמש בוכנה מזרק כדי macerate את הרקמות דרך המסננים כדי לשחרר את התאים.לשטוף את מסננת ובוכנה עם מדיום RPMI בתוספת 1%FBS כדי לאסוף את כל התאים ולשקע את התאים על ידי צנטריפוגה. הוסף חמישה מיליליטר של מאגר תזה ACK לכדור התא. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, לעצור את התגובה עם חמישה מיליליטר של בינוני בתוספת 1% FBS ו גלולה תאי הדם הלבנים על ידי צנטריפוגה.תן שימוש חוזר את גלולה בחמישה מיליליטר של מאגר MACS לספירה ולדלל את התאים לריכוז של פעמיים 10 לשמונה תאים למיליליטר במאגר MACS טרי. הוסף את הריכוז המתאים של נוגדנים נגד אריתויד, אנטי גרנולוציטים, אנטי B-cell, ונוגדני דלדול נגד תאי NK לכל אחד פעמים 10 לשש התאים לדגירה של 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של חיץ MACS קר כקרח ו להשתמש מחדש את גלולה באחת פעמים 10 לריכוז שמונה תאים למיליליטר במאגר MACS טרי.לאחר מכן, להוסיף 0.22 microliters של MicroBeads אנטי ביוטין לכל אחד פעמים 10 לשישה תאים עם ערבוב עבור דגירה של 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של חיץ MACS קר כקרח ולאסוף את תאי T מועשרים לא מאוגדים על ידי הפרדת חרוזים מגנטית באמצעות מפריד MACSxpress על פי פרוטוקולי בידוד חרוזים סטנדרטיים. בסוף ההפרדה, מים את תאי T על ידי צנטריפוגה לשימוש חוזר את גלולה בחמישה מיליליטר של מאגר MACS טרי לספירה.כדי ליצור תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם, בודדו את מח העצם מעצם הירך של עכברי נוקאאוט מסוג פראי או גורם B כפי שהוכח ו-lyse תאי הדם האדומים בחמישה מיליליטר של חיץ תמיסת ACK, עצירת התגובה עם 10 מיליליטר של RPMI בתוספת 1%FBS לאחר חמש דקות. לאחר איסוף כל תאי הדם על ידי צנטריפוגה, תוסיפו את גלולת הכדור ב-10 מיליליטר של תרבות בינונית עד פי שניים מ-10 לתאים השישיים לריכוז מיליליטר ותוסיפו 20 ננוגרם למיליליטר של GM-CSF לתאים לפני שתזרעו 10 מיליליטר תאים על 100 בודדים על ידי 15 מילימטר מנות פטרי ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך שישה ימים. ביום השישי, הפעל את תרבות התאים הדנידריטיים המופקים ממח העצם עם 25 מיקרוגרם למיליליטר של LPS לכל צלחת.לפחות 85% מתאי מח העצם התרבותיים מתבדלים לתאים דנדריטיים. טוהר תאי T לאחר העשרת חרוזים מגנטיים הוא 90%הדגם העיקרי של C57BL/6 BALB/c לא תואם באופן הדוק להתפתחות GVHD לאחר ההשתלה. שיא החומרה מתרחש כ -11 ימים לאחר העברת התא ואחריו ירידה הציונים הקליניים והתאוששות משקל הגוף עד היום 16.הנמענים נכנעו באופן אחיד ל-GVHD ב-30 עד 40 יום לאחר ההמשגבה. מעניין, השתלה עם פקטור B נוקאאוט תאים דנדריטיים משפר את הישרדות המטופל ציונים קליניים GVHD. לימפומה A20 B-cell מתומרת לוציפראז מאפשר ניטור של גידול גידול בבעלי חיים חיים.בניסוי מייצג זה, כל מקבלי BALB/c מסוג הבר שקיבלו מח עצם לבד בתוספת A20 מתו מהתדרדרות הגידול. נמעני BALB/c פראיים שהושתלו בתאי T של תורמים מרוקנים במח העצם, שמקורם במח העצם, מתו מ-GVHD. בנוסף, בעלי חיים שקיבלו מח עצם תורם ותאי T מדולדלים ACC1 מתו הן GVHD והן מהתדרדרות הגידול.כדי ליצור מספיק תא מח עצם, השוקה שנאסף ועצמות עצם הירך חייב להיות חופשי לחלוטין של רקמת שריר לפני תיקון מח העצם. טיהור שלילי של תאי מח העצם עם ביוטינילאז אנטי CD3 ו MicroBeads אנטי ביוטין יכול גם לכל מבוצע כדי לרוקן את הלימפוציטים ממח העצם.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

הדור וסימון של Murine מח עצם הנגזרות תאים דנדריטים עם nanocrystals Qdot ללימודי מעקב

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

אינדוקציה של מחלת שתל נגד מארח ו<em&gt; In Vivo</em&gt; ניטור תא T תוך שימוש במודל Murine MHC התאמה

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

הבחנת תפקידים פונקציונליים של ביטוי גנים מתאים חיסוניים וללא חיסון בקוליטיס המאוס על ידי השתלת מח עצם

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

שיטות כדי לחקור את תפקיד הרגולציה של RNA הקטן וריבוזומלי תפוסה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

דור וזיהוי GM-CSF נגזר מכתשיים דמוי מאקרופאגים דנדריטים תאי עכבר מח עצם

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Precision-לחתוך פרוסות ריאת עכבר לדמיין תאי דנדריטים ריאה חיים

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

An In Vivo Mouse Model to Measure NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

מודל העכבר In Vivo הפעלת תא T CD4 תמים מידה, התפשטות של בידול Th1 הנגרם על ידי תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

אינדוקציה של מעיים שתל – מול – מארח מחלות והערכה מיני-אנדוסקופית שלה בעכברים בשידור חי

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

אינדוקציה והבקיע של מחלת השתל מול מארחים ב מודל Murine מורה Xenoic ו כימות האדם תאים T ברקמות העכבר באמצעות PCR דיגיטלי

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...