Name: bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease
Uploaded: 2020-03-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease at JoVE.com

Questo studio è supportato dalla sovvenzione per la start-up dell'Università della Florida College of Medicine (a HN), dalla sovvenzione start-up Hillman Cancer Center dell'Università di Pittsburgh Medical Center (a HL), dal NIH Grant #1P20CA210300-01 degli Stati Uniti e dal Ministero vietnamita di Health Grant #4694/QD-BYT (a PTH). Ringraziamo il Dr. Xue-zhong Yu presso la Medical University of South Carolina per aver fornito materiali per lo studio.

Le procedure sperimentali sono state approvate dal Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università della Florida centrale.
1. Induzione GVHD
NOTA: Il trapianto di cellule ossee allogeniche (BM) (passaggio 1.2) viene eseguito entro 24 ore dopo l'irradiazione. Tutte le procedure descritte di seguito vengono eseguite in un ambiente sterile. Eseguire la procedura in una cappa di coltura tissutale e utilizzare reagenti filtrati.
<ol><li>Giorno 0: Preparare...

<ol>
	<li>Shlomchik, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).</li><li>Appelbaum, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+cell+transplantation+as+immunotherapy.">Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy.</a> Nature. 411, 385-389 (2001).</li><li>Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+graft-versus-host+disease+biology+and+therapy.">Advances in graft-versus-host disease biology and therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).</li><li>Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2010+report+from+the+Center+for+International+Blood+and+Marrow+Transplant+Research+(CIBMTR):+current+uses+and+outcomes+of+hematopoietic+cell+transplants+for+blood+and+bone+marrow+disorders.">2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders.</a> Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).</li><li>Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+graft-versus-host+disease:+advances+and+limitations.">Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations.</a> Disease Model &amp; Mechanism. 4, 318-333 (2011).</li><li>Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+for+Preclinical+Development+of+Allogeneic+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation.</a> ILAR Journal. , ily006 (2018).</li><li>Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+T+cell+subsets+in+lethal+graft-versus-host+disease+(GVHD)+directed+to+class+I+versus+class+II+H-2+differences.+II.+Protective+effects+of+L3T4++cells+in+anti-class+II+GVHD.">Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD.</a> Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).</li><li>Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosuppressor+and+allohelper+T+cells+in+acute+and+chronic+graft-vs-host+disease.+I.+Alloreactive+suppressor+cells+rather+than+killer+T+cells+appear+to+be+the+decisive+effector+cells+in+lethal+graft-vs.-host+disease.">Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).</li><li>Lu, Y., Waller, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomous+role+of+interferon-gamma+in+allogeneic+bone+marrow+transplant.">Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).</li><li>Abdollahi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+platelet-derived+growth+factor+signaling+attenuates+pulmonary+fibrosis.">Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li><li>Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+regulation+of+graft-versus-host+disease+and+graft-versus-leukemia.">Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia.</a> Blood. 119, 5088-5103 (2012).</li><li>Ullmann, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posaconazole+or+fluconazole+for+prophylaxis+in+severe+graft-versus-host+disease.">Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease.</a> New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).</li><li>Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+specific+cell+populations+by+complement+depletion.">Depletion of specific cell populations by complement depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li><li>Nguyen, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+alloantigen-activated+T+cells+after+hematopoietic+cell+transplantation.">Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Nguyen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+C3a+and+C5a+receptors+promote+GVHD+by+suppressing+mitophagy+in+recipient+dendritic+cells.">Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).</li><li>McNutt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Science. 342, 1417 (2013).</li><li>Negrin, R. S., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+using+bioluminescence:+a+tool+for+probing+graft-versus-host+disease.">In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).</li><li>Roy, D. C., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+vs+minor+histocompatibility+antigens.">Major vs minor histocompatibility antigens.</a> Blood. 129, 664-666 (2017).</li><li>Gendelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+conditioning+is+a+primary+determinant+in+modulating+the+effect+of+IL-7+on+murine+graft-versus-host+disease.">Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease.</a> Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HY-Specific+Induced+Regulatory+T+Cells+Display+High+Specificity+and+Efficacy+in+the+Prevention+of+Acute+Graft-versus-Host+Disease.">HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease.</a> Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).</li><li>Zeiser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+CD30+signaling+is+critical+for+adoptively+transferred+CD4+CD25++regulatory+T+cells+in+prevention+of+acute+graft-versus-host+disease.">Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 109, 2225-2233 (2007).</li><li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice.">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li></ol>

L'uso di cellule staminali per soddisfare un particolare individuo è un approccio efficace per trattare i tumori avanzati e resistenti18. I prodotti farmaceutici a piccola molecola, tuttavia, sono rimasti a lungo al centro della terapia oncologica personalizzata. D'altra parte, nella terapia cellulare una moltitudine di interazioni tra donatore e ospite può influenzare in modo decisivo gli esiti del trattamento, come lo sviluppo di GVHD dopo BMT1.
<p class="jove_conte...

Il trapianto di cellule staminali ematopoietiche allogeneiche (BMT) è una terapia efficace per il trattamento di neoplasie ematologiche1,2 attraverso l'effetto GVL (innesto-contro-leucemia)3. Tuttavia, i linfociti del donatore montano sempre attacchi immunologici indesiderati contro i tessuti ricitati, un processo chiamato malattia innesto-contro-ospite (GVHD)4.
I modelli Murine di GVHD sono uno strumento efficace per studiare la biologia del GVHD e la risposta GVL5. I topi sono un modello animale di ricerca conveniente. Sono piccoli ed efficacemente dosati con molecole e biologici nelle prime fasi dello sviluppo6. I topi sono animali di ricerca ideali per gli studi di manipolazione genetica perché sono geneticamente ben definiti, il che è ideale per studiare percorsi e meccanismi biologici6. Diversi modelli di GVHD non corrispondenti del complesso di istocompatibilità maggiore del mouse (MHC) di GVHD sono stati ben definiti, ad esempio C57BL/6 (H2b) a BALB/c (H2d) e FVB (H2q) : C57BL/6 (H2b)5,7. Questi sono modelli particolarmente preziosi per determinare il ruolo dei singoli tipi di cellule, geni e fattori che influenzano il GVHD. Il trapianto da donatori genitori C57/BL/6 (H2b)a destinatari con mutazioni in MHC I (B6.C-H2bm1) e/o MHC II (B6.C-H2bm12) ha rivelato che un disallineamento sia nella classe MHC I che nella classe II è un requisito importante per lo sviluppo di GVHD acuto. Ciò suggerisce che sia le celluleCD4 e CD8 sono necessarie per lo sviluppo della malattia7,8. GVHD è anche coinvolto in una cascata infiammatoria conosciuta come la 'tempesta di citochine pro-infiammatorie'9. Il metodo di condizionamento più comune nei modelli murini è l'irradiazione totale del corpo (TBI) da raggi X o 137C. Questo porta all'ablazione del midollo osseo del ricevente, permettendo così l'innesto delle cellule staminali del donatore e impedendo il rigetto dell'innesto. Questo viene fatto limitando la proliferazione delle cellule T del ricevente in risposta alle cellule donatrici. Inoltre, le disparità genetiche svolgono un ruolo importante nell'induzione delle malattie, che dipende anche da una mancata corrispondenza di MHC minori10. Pertanto, la dose di irradiazione mieloablativa varia in diversi ceppi di topo (ad es., BALB/c-C57BL/6).
L'attivazione di cellule T donatori da cellule di presentazione dell'antigene host (APC) è essenziale per lo sviluppo di GVHD. Tra gli APC, le cellule dendritiche (DC) sono le più potenti. Sono ereditariamente in grado di indurre GVHD a causa del loro superiore assorbimento di antigeni, espressione di molecole co-stimolanti a cellule T e produzione di citochine pro-infiammatorie che polarizzano le cellule T in sottoinsiemi patogeni. I controller di dominio destinatari sono fondamentali per facilitare l'innesco delle cellule T e l'induzione del GVHD dopo il trapianto11,12. Di conseguenza, DC sono diventati obiettivi interessanti nel trattamento di GVHD12.
La TBI è necessaria per migliorare l'innesto delle cellule del donatore. A causa dell'effetto TBI, i controller di dominio destinatari vengono attivati e sopravvivono per un breve periodo dopo il trapianto12. Nonostante i grandi progressi nell'uso della bioluminescenza o della fluorescenza, stabilire un modello efficace per studiare il ruolo dei controller di dominio destinatari nel GVHD è ancora impegnativo.
Poiché le cellule T donatrici sono la forza motrice per l'attività GVL, strategie di trattamento che utilizzano farmaci immunosoppressivi come gli steroidi per sopprimere l'allreattività delle cellule T spesso causano ricaduta tumorale o infezione13. Pertanto, il targeting dei controller di dominio dei destinatari può fornire un approccio alternativo per trattare il GVHD preservando l'effetto GVL ed evitando l'infezione.
In breve, lo studio attuale fornisce una piattaforma per capire come i diversi tipi di segnalazione nei controller di dominio dei destinatari regolano lo sviluppo di GVHD e l'effetto GVL dopo BMT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0 100ML</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A20 B-cell lymphoma</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>30954</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl CD4cre</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td></td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R (B220)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220 FITC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10452-85</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c- AF700</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>117319</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD25 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0041-86</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 eFluor&#174; 450 (Pacific Blue&#174; replacement)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>48-0042-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45.1 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0900-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD8a APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-0081-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-5958-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse MHC Class II-antibody APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5320-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TER-119 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Thy1.2</td>
			<td>Bio Excel</td>
			<td>BE0066</td>
			<td>BM generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6 fB-/- mice</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>564</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028</td>
			<td>Transplant recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Donors/Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0251-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5971-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Bilogicals R&#38;D system</td>
			<td>D17051</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352008</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB/NCrl</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>207</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysacharide (LPS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L4391-1MG</td>
			<td>DC mature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS column</td>
			<td>Mitenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Galaxy 170R incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Galaxy 170 R</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scienctific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TER119</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-RAD 320 Biological Irradiator</td>
			<td>Precision X-RAY</td>
			<td>X-RAD 320</td>
			<td>Total Body Irradiation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease

Il trapianto di midollo osseo allogenico (BMT) è una terapia efficace per le neoplasie ematologiche dovute all'effetto innesto-contro leucemia (GVL) per sradicare i tumori. Tuttavia, la sua applicazione è limitata dallo sviluppo della malattia innesto-contro-ospite (GVHD), una complicazione importante di BMT. Il GVHD viene evocato quando le cellule T negli innesti del donatore riconosconoalloantigeno espresso dalle cellule riceventi e montano attacchi immunologici indesiderati contro i tessuti sani riceventi. Così, le terapie tradizionali sono progettate per sopprimere l'allocazione delle cellule T del donatore. Tuttavia, questi approcci compromettono sostanzialmente l'effetto GVL in modo che la sopravvivenza del destinatario non sia migliorata. Comprendere gli effetti degli approcci terapeutici su BMT, GVL e GVHD, è quindi essenziale. A causa delle capacità di presentazione dell'antigene e di citochina per stimolare le cellule T del donatore, le cellule dendritiche dei donatori (DC) svolgono un ruolo significativo nell'induzione del GVHD. Pertanto, l'indirizzamento dei controller di dominio destinatario diventa un potenziale approccio per il controllo di GVHD. Questo lavoro fornisce una descrizione di una nuova piattaforma BMT per studiare come i DC host regolano le risposte GVH e GVL dopo il trapianto. È inoltre stato presentato un modello BMT efficace per studiare la biologia del GVHD e della GVL dopo il trapianto.

Il principale modello B6 (H2k b)-BALB/C (H2kd) corrispondeva strettamente allo sviluppo del GVHD dopo il trapianto (Figura 2).b Tutti e sei i segni clinici GVHD stabiliti in precedenza da Cooke et al.16 si sono verificati nei destinatari trapiantati con cellule T WT-B6, ma non nei destinatari trapiantati con BM da solo (passaggio 1.5), che rappresentavano il gruppo GVHD-negativo. Ci sono due fasi nello sviluppo GV...

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Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

La malattia da innesto contro ospite è una complicazione importante dopo il trapianto di midollo osseo allogenico. Le cellule dendritiche svolgono un ruolo critico nella patogenesi della malattia da trapianto contro ospite. L'articolo attuale descrive una nuova piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nello sviluppo della malattia da trapianto contro ospite e l'effetto innesto contro leucemia.

Piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nella malattia di Graft-versus-Host

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

Questo nuovo protocollo di trapianto di midollo osseo può essere utilizzato per indagare come le cellule dendritiche ospiti regolano le risposte di graft-versus-host e graft-versus-leukemia dopo il trapianto. Le rigenerazioni cellulari ex vivo consentono di adattare questo protocollo per testare il ruolo di altre popolazioni di cellule immunitarie come macrofagi e neutrofili semplicemente modificando la condizione di coltura. A dimostrare la procedura con me saranno il direttore di laboratorio Krystal Hossack e il laureato Sanjeev Gurshaney.Per la preparazione del midollo osseo C57BL/6 impoverito con cellule T del donatore, raccogliere il femore e la tibia secondo protocolli standard da topi donatori eutanasiati e trasferire le ossa in una piastra di Petri di 92 millimetri di diametro contenente mezzo 1%RPMI. Utilizzando le forbici, rimuovere le estremità da ogni osso e riempire una siringa da tre millilitri dotata di un ago calibro 26 con mezzo fresco 1%RPMI. Inserire l'ago in un'estremità di un osso e deprimere lo stantuffo per sciacquare il midollo osseo dalla cavità e in un filtro cellulare di raccolta.Una volta raccolto tutto il midollo osseo, filtrare i pezzi di midollo osseo attraverso un filtro a rete da 75 micrometri e trasferire la sospensione a cella singola in un nuovo tubo da 50 millilitri. Sedimentare le cellule mediante centrifugazione e resostigliere il pellet a una concentrazione di 20 volte 10 a sei cellule per millilitro in PBS integrata con lo 0,5% di BSA. Successivamente, aggiungere 0,05 microgrammi di anticorpo THI1 per uno per 10 alle sei cellule per un'incubazione di 30 minuti a quattro gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, lavare le cellule due volte con 10 millilitri di PBS ghiacciato e rimescolare il pellet a una concentrazione di due volte 10 fino alle sette cellule per millilitro nello 0,5% di BSA integrato con il 10% di complemento di coniglio giovane e il 2%DNAse in acqua sterile per un'incubazione di 45 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule due volte con 15 millilitri di PBS fresco per lavaggio e rimorsi il pellet in 20 millilitri di PBS contenenti 0,5%BSA. Mettere in comune i linfonodi e la milza in un colino poro di 40 micrometri e utilizzare uno stantuffo per siringhe per macerare i tessuti attraverso i filtri per rilasciare le cellule.Lavare il colino e lo stantuffo con mezzo RPMI integrato con 1%FBS per raccogliere tutte le cellule e sedimentare le cellule mediante centrifugazione. Aggiungere cinque millilitri di tampone di lysis ACK al pellet cellulare. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, interrompere la reazione con cinque millilitri di mezzo integrati con 1%FBS e pelletare i globuli bianchi mediante centrifugazione.Resostigliere il pellet in cinque millilitri di tampone MACS per contare e diluire le cellule a una concentrazione di due volte 10 alle otto cellule per millilitro nel tampone MACS fresco. Aggiungere l'appropriata concentrazione di anticorpi anti-eriotiroide, anti-granulocita, anti-B-cell e anti-NK-cell depletion per uno per 10 alle sei cellule per un'incubazione di 15 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con 10 millilitri di tampone MACS ghiacciato e rimorsi il pellet a una volta per 10 alle otto cellule per concentrazione di millilitro nel tampone MACS fresco.Successivamente, aggiungere 0,22 microlitri di MicroBead anti-biotina per uno per 10 alle sei cellule con miscelazione per un'incubazione di 15 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le celle con 10 millilitri di tampone MACS ghiacciato e raccogliere le cellule T arricchite non vincolate mediante separazione magnetica delle perline utilizzando il separatore MACSxpress secondo i protocolli standard di isolamento delle perline. Al termine della separazione, sedimentare le cellule T per centrifugazione e rimosogliere il pellet in cinque millilitri di tampone MACS fresco per il conteggio.Per generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo, isolare il midollo osseo dai femore di tipo selvatico o topi knockout di fattore B come dimostrato e lisciviare i globuli rossi in cinque millilitri di tampone di lisi ACK, fermando la reazione con 10 millilitri di RPMI integrati con 1%FBS dopo cinque minuti. Dopo aver raccolto le cellule intere del sangue per centrifugazione, risosorne il pellet in 10 millilitri di coltura medio a due volte 10 alla sesta temperatura per concentrazione di millilitro e aggiungere 20 nanogrammi per millilitro di GM-CSF alle cellule prima di seminare 10 millilitri di cellule su singoli piatti di Petri da 100 per 15 millimetri a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per sei giorni. Il sesto giorno, attivare le colture cellulari dendritiche derivate dal midollo osseo con 25 microgrammi per millilitro di LPS per piastra.Almeno l'85% delle cellule del midollo osseo coltivate si differenziano in cellule dendritiche. La purezza delle cellule T dopo l'arricchimento magnetico delle perline è del 90%Il modello C57BL/6 BALB/c non corrispondente all'MHC maggiore corrisponde strettamente allo sviluppo di GVHD dopo il trapianto. Il picco di gravità si verifica circa 11 giorni dopo il trasferimento cellulare seguito da una riduzione dei punteggi clinici e dal recupero del peso corporeo fino al giorno 16.I destinatari soccombevano uniformemente al GVHD da 30 a 40 giorni dopo il traspianto. È interessante notare che il trapianto con cellule dendritiche knockout di fattore B migliora la sopravvivenza del ricevente e i punteggi clinici GVHD. Il linfoma a cellule B A20 trasdotto in luciferasi consente il monitoraggio della crescita tumorale negli animali vivi.In questo esperimento rappresentativo, tutti i destinatari selvatici balb/c che hanno ricevuto solo midollo osseo più A20 sono morti per una ricaduta tumorale. I riceventi di tipo selvatico BALB/c trapiantati con cellule T del donatore di origine ACC1 derivate dal midollo osseo sono morti di GVHD. Inoltre, gli animali che hanno ricevuto midollo osseo donatore e cellule T impoverite di ACC1 sono morti sia di GVHD che di ricaduta tumorale.Per generare abbastanza cellule del midollo osseo, le ossa di tibia e femore raccolte devono essere completamente libere dal tessuto muscolare prima della correzione del midollo osseo. La purificazione negativa delle cellule del midollo osseo con biotinilasi anti-CD3 e Anti-Biotina MicroBeads può anche essere eseguita per esaurire il linfocita dal midollo osseo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Generazione e l&#39;etichettatura di Murine osseo cellule dendritiche derivate dal midollo con nanocristalli Qdot per gli Studi inseguimento

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Ricerca

Immunologia e infezioni

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