Name: bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease
Uploaded: 2020-03-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease at JoVE.com

この研究は、セントラルフロリダ大学医学部のスタートアップ助成金(HN)、ピッツバーグ大学医療センターヒルマンがんセンターのスタートアップ助成金(HL)、米国NIHグラント#1P20CA210300-01、ベトナム保健省の助成#4694/QD-BYT(PTH)によってサポートされています。研究のための資料を提供してくれたサウスカロライナ医科大学の徐中宇博士に感謝します。

実験手順は、セントラルフロリダ大学の施設動物のケアと使用委員会によって承認されました.
1. GVHD誘導
注:同種骨髄(BM)細胞移植(ステップ1.2)は、照射後24時間以内に行われる。以下に説明するすべての手順は、無菌環境で行われます。組織培養フードで手順を実行し、濾過試薬を使用します。
<ol><li>0 日目: 受け取ったマウスを準備します。<ol>
<li>?...

<ol>
	<li>Shlomchik, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).</li><li>Appelbaum, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+cell+transplantation+as+immunotherapy.">Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy.</a> Nature. 411, 385-389 (2001).</li><li>Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+graft-versus-host+disease+biology+and+therapy.">Advances in graft-versus-host disease biology and therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).</li><li>Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posaconazole+or+fluconazole+for+prophylaxis+in+severe+graft-versus-host+disease.">Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease.</a> New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).</li><li>Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+specific+cell+populations+by+complement+depletion.">Depletion of specific cell populations by complement depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li><li>Nguyen, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+alloantigen-activated+T+cells+after+hematopoietic+cell+transplantation.">Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Nguyen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+C3a+and+C5a+receptors+promote+GVHD+by+suppressing+mitophagy+in+recipient+dendritic+cells.">Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).</li><li>McNutt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Science. 342, 1417 (2013).</li><li>Negrin, R. S., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+using+bioluminescence:+a+tool+for+probing+graft-versus-host+disease.">In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).</li><li>Roy, D. C., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+vs+minor+histocompatibility+antigens.">Major vs minor histocompatibility antigens.</a> Blood. 129, 664-666 (2017).</li><li>Gendelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+conditioning+is+a+primary+determinant+in+modulating+the+effect+of+IL-7+on+murine+graft-versus-host+disease.">Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease.</a> Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HY-Specific+Induced+Regulatory+T+Cells+Display+High+Specificity+and+Efficacy+in+the+Prevention+of+Acute+Graft-versus-Host+Disease.">HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease.</a> Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).</li><li>Zeiser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+CD30+signaling+is+critical+for+adoptively+transferred+CD4+CD25++regulatory+T+cells+in+prevention+of+acute+graft-versus-host+disease.">Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 109, 2225-2233 (2007).</li><li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice.">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li></ol>

特定の個体に適した幹細胞の使用は、進行癌および耐性癌18を治療するための効果的なアプローチである。しかし、低分子医薬品は、長い間、パーソナライズされたがん治療の主な焦点であり続けています。一方、細胞療法では、ドナーと宿主との間の多数の相互作用が、BMT1後のGVHDの発達など、治療結果に決定的に影響を1与えることができる。
<p class=...

同種造血幹細胞移植(BMT)は、移植片対白血病(GVL)効果3を介して血球悪性腫瘍11、22を治療するための有効な治療法である。しかし、ドナーリンパ球は常にレシピエント組織に対して望ましくない免疫学的攻撃を仕掛け、移植片対宿主病(GVHD)4と呼ばれるプロセスである。4
GVHDのマウスモデルはGVHDの生物学とGVL応答5を研究するための効果的なツールです。マウスは費用対効果の高い研究動物モデルです。彼らは小さく、効率的に開発の初期段階で分子や生物学的製剤を使用しています 6.マウスは遺伝的に適切に定義されているため、遺伝子操作研究に理想的な研究動物であり、生物学的経路およびメカニズム6を研究するのに理想的である。GVHDのいくつかのマウス主要組織適合性複合体 (MHC) MHC 不一致モデルは、C57BL/6 (H2b)から BALB/c (H2d)および FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)5,,7など、十分に確立されている。これらは、GVHDに影響を与える個々の細胞タイプ、遺伝子、および因子の役割を決定するための特に貴重なモデルです。C57/BL/6(H2b)から、MHC I(B6.C-H2bm1)および/またはMHC II(B6.C-H2bm12)の突然変異を有するレシピエントへの親ドナーからの移植は、MHCクラスIおよびクラスIIの両方の不一致が急性GVHDの発症にとって重要な要件であることを明らかにした。これは、疾患の発症77,88にCD4+およびCD8+T細胞の両方が必要であることを示唆している。GVHDは「炎症性サイトカイン嵐」9として知られている炎症性カスケードにも関与しています。マウスモデルにおける最も一般的なコンディショニング法は、X線または137Csによる全身照射(TBI)である。これはレシピエントの骨髄切除につながり、ドナー幹細胞の生着を可能にし、移植片の拒絶反応を防ぐ。これは、ドナー細胞に応答してレシピエントT細胞の増殖を制限することによって行われる。さらに、遺伝的格差は疾患誘導において重要な役割を果たすが、これはマイナーなMHCミスマッチ10にも依存する。したがって、骨髄性照射線量は、異なるマウス株(例えば、BALB/c→C57BL/6)で変化する。
抗原提示細胞(APC)によるドナーT細胞の活性化は、GVHDの開発に不可欠である。APCの中でも樹状細胞(DC)が最も強力です。彼らは、優れた抗原取り込み、T細胞共刺激分子の発現、およびT細胞を病原性サブセットに偏光する炎症促進サイトカインの産生により、GVHDを誘導することができる継承可能である。レシピエントDCは、移植後のT細胞プライミングおよびGVHD誘導を促進するために重要である11,,12.従って、DCはGVHD12の治療において興味深いターゲットとなっている。
TBIはドナー細胞の生着を増強するために必要とされる。TBI効果により、レシピエントDCは活性化され、移植後短時間生存する12.生物発光や蛍光の使用が大きく進歩しているにもかかわらず、GVHDにおけるレシピエントDCの役割を研究するための効果的なモデルの確立は依然として困難です。
ドナーT細胞はGVL活性の原動力であるため、ステロイドなどの免疫抑制薬を用いた治療戦略は、しばしば腫瘍再発または感染13を引き起こす。したがって、ターゲットの受信者のDCは、GVL効果を維持し、感染を避けながら、GVHDを治療するための代替アプローチを提供することができます。
簡単に言えば、現在の研究は、受信側DCの異なるタイプのシグナリングが、BMT後のGVHD開発とGVL効果をどのように調節するかを理解するためのプラットフォームを提供する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0 100ML</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A20 B-cell lymphoma</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>30954</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl CD4cre</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td></td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R (B220)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220 FITC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10452-85</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c- AF700</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>117319</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD25 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0041-86</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 eFluor&#174; 450 (Pacific Blue&#174; replacement)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>48-0042-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45.1 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0900-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD8a APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-0081-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-5958-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse MHC Class II-antibody APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5320-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TER-119 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Thy1.2</td>
			<td>Bio Excel</td>
			<td>BE0066</td>
			<td>BM generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6 fB-/- mice</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>564</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028</td>
			<td>Transplant recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Donors/Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0251-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5971-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Bilogicals R&#38;D system</td>
			<td>D17051</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352008</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB/NCrl</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>207</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysacharide (LPS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L4391-1MG</td>
			<td>DC mature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS column</td>
			<td>Mitenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Galaxy 170R incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Galaxy 170 R</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scienctific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TER119</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-RAD 320 Biological Irradiator</td>
			<td>Precision X-RAY</td>
			<td>X-RAD 320</td>
			<td>Total Body Irradiation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease

同種骨髄移植(BMT)は、腫瘍を根絶するための移植片対白血病(GVL)効果による血球悪性腫瘍に対する効果的な治療法です。しかし、その適用は、移植片対宿主病(GVHD)、BMTの主要な合併症の開発によって制限される。GVHDは、ドナー移植片のT細胞がレシピエント細胞によって発現する認識allo抗原を誘発し、レシピエントの健康組織に対して望ましくない免疫学的攻撃を仕掛ける。したがって、従来の治療法は、ドナーT細胞のアロロ活性を抑制するように設計されている。しかし、これらのアプローチは、実質的に、レシピエントの生存が改善されないようにGVL効果を損なう。したがって、BMT、GVL、およびGVHDに対する治療アプローチの効果を理解することが不可欠です。ドナーT細胞を刺激する抗原提示およびサイトカイン分泌能力のために、レシピエント樹状細胞(DC)はGVHDの誘導において重要な役割を果たす。したがって、受信者 DC をターゲットにすることは、GVHD を制御するための潜在的なアプローチになります。この研究は、ホストDCが移植後のGVHおよびGVL応答をどのように調節するかを調査するための新しいBMTプラットフォームの説明を提供する。また、移植後のGVHDおよびGVLの生物学を研究するための効果的なBMTモデルも提示される。

主要なMHC不一致B6(H2kbb)-BALB/C(H2kd)モデルは、移植後のGVHDの発達に密接に対応した(図2)。Cookeららによって以前に確立された6つのGVHD臨床徴候はすべて、WT-B6 T細胞を移植したレシピでは起こったが、Bm単独で移植されたレシピエント(ステップ1.5)では起こらなかった、GVHD陰性基を表す。GVHD の開発には、このモデル?...

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Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

移植片対宿主病は、同種骨髄移植後の主要な合併症である。樹状細胞は、移植片対宿主病の病因において重要な役割を果たす。現在の記事では、移植片対宿主病の発症における樹状細胞の役割と移植片対白血病効果を調査するための新しい骨髄移植プラットフォームについて説明しています。

移植片対宿主病における樹状細胞の役割を調べる骨髄移植プラットフォーム

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

この新しい骨髄移植プロトコルは、宿主樹状細胞が移植後の移植片対宿主および移植片対白血病応答をどのように調節するかを調べるのに使用することができる。Ex vivo細胞再生は、このプロトコルを単に培養条件を変更することによってマクロファージおよび好中球のような他の免疫細胞集団の役割をテストするために適応することを可能にする。私と一緒に手順を実証することは、ラボマネージャーのクリスタル・ホサックと学部生のサンジーブ・グルシャニーです。ドナーT細胞枯渇C57BL/6骨髄製剤の場合、安楽死させたドナーマウスから標準プロトコルに従って大腿骨および脛骨を収穫し、1%RPMI培地を含む直径92ミリメートルのペトリ皿に骨を移す。はさみを使用して、各骨から端を取り出し、新鮮な1%RPMI培地で26ゲージ針を装備した3ミリリットルのシリンジを充填します。針を1つの骨の一端に挿入し、プランジャーを押して骨髄を空洞から洗い流し、採取細胞ストレーナーに入れられます。骨髄のすべてが収集されたら、骨髄片を75マイクロメートルのメッシュフィルターでひずみ、単一細胞懸濁液を新しい50ミリリットルチューブに移します。遠心分離によって細胞を沈め、0.5%BSAを補充したPBS中の1ミリリットル当たり6細胞に20倍10倍のペレットを再懸濁する。次に、摂氏4度で30分間インキュベーションするために、6つの細胞に10回10回0.05マイクログラムのTHI1抗体を加えます。インキュベーションの終わりに、氷冷PBSの10ミリリットルで細胞を2回洗浄し、ペレットを1ミリリットル当たり7細胞に2倍10回再懸濁し、0.5%BSAに10%若いウサギ補体と2%のDNAsを37°Cで45分間培養します。インキュベーションの終わりに、1回の洗浄につき新鮮なPBSの15ミリリットルで細胞を2回洗浄し、0.5%BSAを含むPBSの20ミリリットルでペレットを再懸濁します。リンパ節と脾臓を40マイクロメートルの細孔ストレーナーにプールし、注射器プランジャーを使用してフィルターを介して組織を浸食して細胞を放出する。1%FBSを補充したRPMI培地でストレーナーとプランジャーを洗浄し、遠心分離によって細胞を全て採取し、細胞を沈めます。細胞ペレットにACKライシスバッファーを5ミリリットル加えます。室温で5分後、1%FBSを添加した培地5ミリリットルで反応を停止し、遠心分離によって白血球をペレットにする。カウント用に5ミリリットルのMACSバッファーでペレットを再懸濁し、新鮮なMACSバッファーで1ミリリットル当たり8個の細胞に2倍の濃度10の濃度に細胞を希釈します。抗赤芽球、抗顆粒球、抗B細胞、抗NK細胞の抗体を10回10回加え、摂氏4度で15分間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、10ミリリットルの氷冷MACSバッファーで細胞を洗浄し、新鮮なMACSバッファーで1ミリリットル濃度当たり8細胞に10倍の10でペレットを再懸濁します。次に、抗ビオチンマイクロビーズを10回10回0.22マイクロリットルを加え、摂氏4度で15分間インキュベーションを混合します。インキュベーションの最後に、10ミリリットルの氷冷MACSバッファーで細胞を洗浄し、標準的なビーズ分離プロトコルに従ってMACSxpressセパレータを使用して磁気ビーズ分離によって結合されていない濃縮T細胞を収集します。分離の終わりに、遠心分離によってT細胞を沈下し、カウント用に新鮮なMACSバッファーの5ミリリットルでペレットを再懸濁する。骨髄由来樹状細胞を生成するには、野生型または因子Bノックアウトマウスの大腿骨から骨髄を分離し、ACKライシス緩衝液の5ミリリットルで赤血球を分解し、5分後に1%FBSで補ったRPMIの10ミリリットルで反応を停止する。遠心分離によって全血球を採取した後、ペレットを10ミリリットルの培養培地で10ミリリットルから1ミリリットル当たり6番目の細胞の2倍に再懸濁し、GM-CSFの1ミリリットル当たり20ナノグラムを細胞に加えて、10ミリリットルの細胞を37°C×15ミリメートルのペトリ皿に37°C、5%の二酸化炭素で6%の炭素で37度で個々の100ミリのペトリ皿に播種する。6日目に、プレートあたりLPSのミリリットル当たり25マイクログラムで骨髄由来樹状細胞培養を活性化する。培養した骨髄細胞の少なくとも85%が樹状細胞に分化する。磁気ビーズ濃縮後のT細胞純度は90%であり、主要なMHC不一致C57BL/6 BALB/cモデルは、移植後のGVHDの発達に密接に対応しています。重症度のピークは、細胞転移の約11日後に起こり、その後、16日目までの臨床スコアおよび体重回復の減少が続く。レシピエントは移植後30〜40日までにGVHDに均一に屈した。興味深いことに、因子Bノックアウト樹状細胞による移植は、レシピエント生存率およびGVHD臨床スコアを改善する。ルシファーゼ導入A20 B細胞リンパ腫は、生きている動物の腫瘍増殖のモニタリングを可能にする。本代表的な実験では、骨髄単独とA20を受けた野生型BALB/cレシピエントのすべてが腫瘍再発で死亡した。骨髄由来ACC1枯渇ドナーT細胞を移植した野生型BALB/cレシピエントはGVHDで死亡した。さらに、ドナー骨髄およびACC1枯渇T細胞を受けた動物は、GVHDおよび腫瘍再発の両方で死亡した。十分な骨髄細胞を生成するには、骨髄の補正前に、採取した脛骨および大腿骨に筋肉組織が完全に含まれていなければなりません。ビオチラーゼ抗CD3および抗ビオチンマイクロビーズを用いた骨髄細胞の陰性精製も、骨髄からリンパ球を枯渇させるために行われる。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

追跡調査のためのQdot ®二ナノとマウス骨髄由来樹状細胞の世代とラベリング

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

移植片対宿主病の誘導および<emインビボで&gt;</emMHCマッチしたマウスモデルを使用する&gt; T細胞のモニタリング

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

骨髄移植によるマウス大腸炎における免疫および非免疫細胞からの遺伝子発現の機能的役割を差別化

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

小さなRNAおよびリボソームの占有の調節の役割を調査する方法<em&gt;熱帯熱マラリア原虫</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

マウスの骨髄からGM-CSF由来肺胞のようなマクロファージや樹状細胞の生成および同定

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

マウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞の精製のために、蛍光活性化細胞選別

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

精密カットライブ肺樹状細胞を可視化するために、マウスの肺スライスを

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

An In Vivo Mouse Model to Measure NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

メジャー ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の活性化、増殖と骨髄由来樹状細胞による th1 細胞分化をIn Vivoマウス モデル

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

腸管移植片対宿主病と生きたマウスのミニ内視鏡評価の誘導

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

デジタルPCRを用いたマウス組織における異種マウスモデルにおける移植片対宿主病の誘導とスコア付け

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...