Name: bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease
Uploaded: 2020-03-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease at JoVE.com

이 연구는 의학의 중앙 플로리다 대학 의과 대학 창업 보조금의 대학에 의해 지원된다 (HN에), 피츠버그 의료 센터 힐만 암 센터 스타트 업 보조금의 대학 (HL에), 미국 NIH 그랜트 #1P20CA210300-01 및 건강 보조금 #4694 / QD-BYT의 베트남 정부 (PTH에). 우리는 연구를 위한 자료를 제공한 사우스 캐롤라이나 의과 대학에 박사 Xue-zhong Yu 에게 감사합니다.

실험 절차는 중앙 플로리다 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다.
1. GVHD 유도
참고: 동종 골수 (BM) 세포 이식 (단계 1.2) 조사 후 24 시간 이내에 수행된다. 아래에 설명된 모든 절차는 멸균 환경에서 수행됩니다. 조직 배양 후드에서 절차를 수행하고 여과 된 시약을 사용하십시오.
<ol><li>일 0: 받는 마우스를 준비합니다.<ol>
<li>BALB/c 배경(...

<ol>
	<li>Shlomchik, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).</li><li>Appelbaum, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+cell+transplantation+as+immunotherapy.">Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy.</a> Nature. 411, 385-389 (2001).</li><li>Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+graft-versus-host+disease+biology+and+therapy.">Advances in graft-versus-host disease biology and therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).</li><li>Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. 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The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Nguyen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+C3a+and+C5a+receptors+promote+GVHD+by+suppressing+mitophagy+in+recipient+dendritic+cells.">Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).</li><li>McNutt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Science. 342, 1417 (2013).</li><li>Negrin, R. S., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+using+bioluminescence:+a+tool+for+probing+graft-versus-host+disease.">In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).</li><li>Roy, D. C., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+vs+minor+histocompatibility+antigens.">Major vs minor histocompatibility antigens.</a> Blood. 129, 664-666 (2017).</li><li>Gendelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+conditioning+is+a+primary+determinant+in+modulating+the+effect+of+IL-7+on+murine+graft-versus-host+disease.">Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease.</a> Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HY-Specific+Induced+Regulatory+T+Cells+Display+High+Specificity+and+Efficacy+in+the+Prevention+of+Acute+Graft-versus-Host+Disease.">HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease.</a> Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).</li><li>Zeiser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+CD30+signaling+is+critical+for+adoptively+transferred+CD4+CD25++regulatory+T+cells+in+prevention+of+acute+graft-versus-host+disease.">Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 109, 2225-2233 (2007).</li><li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice.">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li></ol>

특정 개인에 맞게 줄기 세포의 사용은 고급 및 내성 암을 치료하는 효과적인 접근 이다18. 작은 분자 약제는, 그러나, 개인화한 암 치료의 1 차적인 초점으로 오래 남아 있습니다. 한편, 세포 치료에서 기증자와 숙주 간의 다수 상호작용은 BMT1후 GVHD의 발달과 같은 치료 결과에 결정적으로 영향을 미칠 수 있다.
BMT의 주요 MHC 불일치 마우스 모?...

동종 조혈 줄기 세포 이식(BMT)은 이식편 대 백혈병(GVL)효과를,통해 혈액학적 악성종양을치료하는 효과적인 치료법3. 그러나, 기증자 림프톨은 항상 수용자 조직에 대하여 원치 않는 면역학 공격을 거치고, 이식편 대 호스트 질병에게 불린 프로세스 (GVHD)4.
GVHD의 뮤린 모델은 GVHD와 GVL응답5의생물학을 연구하는 효과적인 도구입니다. 마우스는 비용 효율적인 연구 동물 모델입니다. 그들은 작고 효율적으로 개발6의초기 단계에서 분자와 생물학적 제제로 dosed. 마우스는 생물학적 경로 및 메커니즘을 연구하는 데 이상적인 유전적 조작 연구를 위한 이상적인 연구 동물이며, 이는 생물학적 경로 및 메커니즘을 연구하는 데 이상적입니다6. 여러 마우스 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) GVHD의 MHC 불일치 모델은 잘 설립되었습니다, 이러한 BALB / c에 (H2b)및 FVB (H2 q)와 FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)b5,,7. 이들은 GVHD에 영향을 미치는 개별적인 세포 모형, 유전자 및 요인의 역할을 결정하기 위하여 특히 귀중한 모형입니다. C57/BL/6 (H2b)MHC I (B6.C-H2bm1)및/또는 MHC II (B6.C-H2bm12)에서돌연변이를 가진 수령인에게 부모 기증자로부터의 이식은 MHC 클래스 I 및 클래스 II 모두에서 불일치가 급성 GVHD의 발달을 위한 중요한 요구 사항임을 밝혔다. 이는CD4+ 및 CD8+ T 세포가 질병발달7,,8에모두 필요하다는 것을 시사한다. GVHD는 또한 '프로 염증성 사이토카인 폭풍'으로 알려진 염증성 캐스케이드에관여9. 뮤린 모델에서 가장 일반적인 컨디셔닝 방법은 X 선 또는 137Cs에 의한 총 체조사(TBI)입니다. 이것은 수령인의 골수 절제로 이끌어 내고, 기증자 줄기 세포 생착을 허용하고 이식의 거부를 방지합니다. 이것은 공여자 세포에 응하여 수용자 T 세포의 증식을 제한해서 행해진다. 추가적으로, 유전 불균형은 또한 경미한 MHC 불일치10에달려 있는 질병 유도에 있는 중요한 역할을 합니다. 따라서, 골수성 조사 량은 상이한 마우스 균주(예를 들어, BALB/c→C57BL/6)에서 다양하다.
숙주 항원 제시 세포(APC)에 의한 공여자 T 세포의 활성화는 GVHD 발달에 필수적이다. APC 중 수지상 세포 (DC)가 가장 강력합니다. 그(것)들은 그들의 우수한 항원 장악, T 세포 공동 자극 분자의 표현 및 병원성 부세트로 T 세포를 편광하는 pro-염증성 사이토카인의 생산 때문에 GVHD를 유도할 수 승계할 수 있습니다. 수용자 DC는 이식 후 T 세포 프라이밍 및 GVHD 유도를 촉진하는 데 매우 중요합니다11,,12. 따라서, DC는 GVHD12의치료에 흥미로운 표적이되고있다.
TBI는 공여자 세포 생착을 향상시키기 위해 요구된다. TBI 효과로 인해, 수용자 DC는 이식 후 짧은 시간 동안 활성화되고생존(12). 생물 발광 또는 형광의 사용이 크게 발전했음에도 불구하고 GVHD에서 받는 DC의 역할을 연구하는 효과적인 모델을 수립하는 것은 여전히 어려운 일입니다.
공여자 T세포는 GVL 활성의 원동력이기 때문에, 스테로이드와 같은 면역억제제를 이용한 치료 전략은 종종 종양 재발 또는 감염을 유발한다13. 따라서, 대상자 DC를 타겟팅하는 것은 GVL 효과를 보존하고 감염을 피하면서 GVHD를 치료하는 다른 접근법을 제공할 수 있다.
간단히 말해서, 현재 연구는 수신자 DC에서 신호의 다른 유형이 BMT 후 GVHD 개발 및 GVL 효과를 조절하는 방법을 이해하는 플랫폼을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0 100ML</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A20 B-cell lymphoma</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>30954</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl CD4cre</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td></td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R (B220)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220 FITC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10452-85</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c- AF700</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>117319</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD25 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0041-86</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 eFluor&#174; 450 (Pacific Blue&#174; replacement)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>48-0042-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45.1 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0900-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD8a APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-0081-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-5958-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse MHC Class II-antibody APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5320-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TER-119 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Thy1.2</td>
			<td>Bio Excel</td>
			<td>BE0066</td>
			<td>BM generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6 fB-/- mice</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>564</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028</td>
			<td>Transplant recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Donors/Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0251-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5971-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Bilogicals R&#38;D system</td>
			<td>D17051</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352008</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB/NCrl</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>207</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysacharide (LPS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L4391-1MG</td>
			<td>DC mature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS column</td>
			<td>Mitenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Galaxy 170R incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Galaxy 170 R</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scienctific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TER119</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-RAD 320 Biological Irradiator</td>
			<td>Precision X-RAY</td>
			<td>X-RAD 320</td>
			<td>Total Body Irradiation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease

동종 골수 이식 (BMT)은 종양을 근절하기 위한 이식편 대 백혈병 (GVL) 효과로 인한 혈액학적 악성 종양에 대한 효과적인 치료법입니다. 그러나, 그것의 응용은 BMT의 중요한 합병증인 이식편 대 호스트 질병 (GVHD)의 발달에 의해 제한됩니다. GVHD는 기증자 이식편에서 T 세포가 수용자 세포에 의해 발현된 alloantigen을 인식하고 수령인 건강한 조직에 대하여 원치 않는 면역학적 공격을 탑재할 때 불러오릅니다. 따라서, 전통적인 치료는 기증자 T 세포 동호성을 억제하도록 설계되었습니다. 그러나, 이러한 접근법은 수신자의 생존이 개선되지 않도록 GVL 효과를 실질적으로 손상시다. 따라서 BMT, GVL 및 GVHD에 대한 치료 접근법의 효과를 이해하는 것이 필수적입니다. 공여자 T 세포를 자극하는 항원 제시 및 사이토카인 분비 용량으로 인해, 수용자 수지상 세포(DC)는 GVHD의 유도에 중요한 역할을 한다. 따라서 받는 DC를 대상으로 하는 것은 GVHD를 제어하기 위한 잠재적인 접근 방식이 됩니다. 이 작품은 호스트 DC가 이식 후 GVH 및 GVL 응답을 조절하는 방법을 조사하는 새로운 BMT 플랫폼에 대한 설명을 제공합니다. 또한 이식 후 GVHD 및 GVL의 생물학을 연구하는 효과적인 BMT 모델이다.

주요 MHC-불일치 B6 (H2kbb)-BALB/C (H2kd)모델은 이식 후 GVHD 개발에 밀접하게 대응하였다(그림2). Cooke et al.16에 의해 이전에 확립된 모든 6개의 GVHD 임상 징후는 WT-B6 T 세포로 이식된 수용자에서 발생하지만, GVHD 음성 군을 나타내는 BM 단독으로 이식된 수용자(단계 1.5)에서는 발생하지 않았다. 이 모델에는 GVHD 개발에 두 단?...

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Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

이식편 대 숙주 질병은 동종 골수 이식 후에 중요한 합병증입니다. 수지상 세포는 이식편 대 숙주 질환의 발병기전에 중요한 역할을 합니다. 현재 논문은 이식편 대 숙주 질환및 이식편 대 백혈병 효과의 발달에 있는 수지상 세포의 역할을 조사하기 위하여 새로운 골수 이식 플랫폼을 기술합니다.

이식대 숙주 질환에서 수지상 세포의 역할을 조사하는 골수 이식 플랫폼

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

이 새로운 골수 이식 프로토콜은 숙주 수지상 세포가 이식 대 숙주 및 이식편 대 백혈병 반응을 이식하는 방법을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. Ex vivo 세포 재생을 통해 이 프로토콜은 단순히 배양 상태를 수정하여 대식세포 및 호중구와 같은 다른 면역 세포 집단의 역할을 테스트하도록 적응할 수 있게 한다. 나와 함께 절차를 시연하는 것은 실험실 매니저 크리스탈 호색과 학부 산예프 구르샤니가 될 것입니다.기증자 T 세포 고갈 C57BL/6 골수 제제의 경우, 안락사 한 기증자 마우스의 표준 프로토콜에 따라 대퇴골과 경골을 수확하고 뼈를 1 % RPMI 배지를 함유 한 92 밀리미터 직경페트리 접시로 옮직다. 가위를 사용하여 각 뼈에서 끝을 제거하고 신선한 1 % RPMI 매체가있는 26 게이지 바늘이 장착 된 3 밀리리터 주사기를 채웁니다. 바늘을 한 뼈의 한쪽 끝에 삽입하고 플런저를 우울하게 하여 골수를 캐비티 밖으로 플러시하고 수집 셀 스트레이너로 넣습니다.모든 골수가 수집되면 75 마이크로미터 메쉬 필터를 통해 골수 조각을 변형시키고 단일 셀 서스펜션을 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮킨다. 세포를 원심분리에 의한 퇴적물을 환원하고 0.5%BSA로 보충된 PBS의 밀리리터 농도당 6개의 세포에 20배 10회 10회에서 펠릿을 재연한다. 다음으로, 1회 당 THI1 항체0.05 마이크로그램을 6세포에 10마이크로그램을 추가하여 섭씨 4도에서 30분 배양에 대한다.인큐베이션이 끝나면 10밀리리터의 얼음 차가운 PBS로 세포를 두 번 씻고 0.5%BSA의 밀리리터 농도당 7개의 세포로 2회 10시에 펠릿을 재봉, 37도에서 45분간 배양할 수 있는 멸균수에 2%DNAse를 보충하였다. 인큐베이션이 끝나면 세척당 15밀리리터의 신선한 PBS로 세포를 두 번 세척하고 0.5%BSA를 함유한 PBS의 20밀리리터에서 펠릿을 재놓습니다. 림프절과 비장을 40 마이크로미터 모공 스트레이너에 풀링하고 주사기 플런저를 사용하여 필터를 통해 조직을 제거하여 세포를 방출합니다.1%FBS로 보충된 RPMI 배지로 스트레이너와 플런저를 세척하여 모든 세포와 퇴적물을 원심분리에 의한 세포와 퇴적물을 수집합니다. 세포 펠릿에 ACK 리시스 버퍼 5밀리리터를 추가합니다. 실온에서 5 분 후, 1 %의 FBS로 보충 된 중간 크기의 5 밀리리터와 반응을 중지하고 원심 분리에 의해 백혈구를 펠릿.계산을 위한 MACS 버퍼의 5밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 신선한 MACS 버퍼에서 밀리리터 당 8개의 세포에 2회 10의 농도로 세포를 희석한다. 항에리스로이드, 항과립구, 항B세포 및 항NK 세포 고갈 항체의 적절한 농도를 섭씨 4도에서 15분 배양하기 위해 6세포에 1회 10회당 첨가한다. 인큐베이션이 끝나면 10밀리리터의 얼음 차가운 MACS 버퍼로 세포를 세척하고 신선한 MACS 버퍼에서 밀리리터 농도당 8개의 세포로 10회 10회에서 펠릿을 재연합니다.다음으로, 섭씨 4도에서 15분 배양을 위해 혼합된 6개의 세포에 1회 당 1회 당 0.22 마이크로리터를 첨가합니다. 인큐베이션의 끝에서, 얼음 차가운 MACS 버퍼의 10 밀리리터로 세포를 세척하고 표준 비드 절연 프로토콜에 따라 MACSxpress 분리기를 사용하여 자기 비드 분리에 의해 결합되지 않은 농축 T 세포를 수집합니다. 분리의 끝에서, T 세포를 원심분리에 의한 퇴적물 및 계산을 위한 신선한 MACS 버퍼의 5밀리리터에서 펠릿을 재보종.골수 유래 수지상 세포를 생성하기 위해, 야생형 또는 인자 B 녹아웃 마우스의 대퇴골으로부터 골수를 증설하고 ACK 리시스 버퍼의 5밀리리터에서 적혈구를 분해하고, 5분 후 1%FBS로 보충된 RPMI의 10밀리리터로 반응을 중지한다. 원심분리에 의한 전혈구를 수집한 후, 배양 배지의 10밀리리터에서 밀리리터 농도당 6세포에 10나노그램을 2배로 재차, GM-CSF의 밀리리터당 20나노그램을 세포에 첨가한 후 37°C의 100밀리리터를 개별 100x15mm 페트리 요리에 10밀리리터를 첨가한다. 6일째에는 골수 유래 수지상 세포 배양을 플레이트당 LPS 밀리리터당 25마이크로그램으로 활성화합니다.배양된 골수 세포의 85% 이상이 수지상 세포로 분화한다. 자기 비드 농축 후 T 세포 순도는 90 %이며 주요 MHC 불일치 C57BL / 6 BALB / c 모델은 이식 후 GVHD 개발에 밀접하게 대응한다. 중증도의 피크는 세포 전달 후 약 11 일 발생 한 다음 임상 점수및 체중 회복의 감소에 의해 16 일까지.수령인은 이식 후 30~40일 간 GVHD에 균일하게 굴복했습니다. 흥미롭게도, 인자 B 녹아웃 수지상 세포를 가진 이식은 수신자 생존및 GVHD 임상 점수를 향상시킵니다. 루시파라제-트랜스포동 A20 B 세포 림프종은 살아있는 동물의 종양 성장을 모니터링할 수 있게 한다.이 대표적인 실험에서는 골수를 단독으로 받은 모든 야생형 BALB/c 수신자와 A20이 종양 재발로 사망했다. 골수 유래 ACC1 고갈된 기증자 T 세포로 이식된 야생형 BALB/c 수신자는 GVHD로 사망하였다. 또한, 기증자 골수와 ACC1 고갈된 T 세포를 수신한 동물은 GVHD와 종양 재발 둘 다에서 정지했습니다.충분한 골수 세포를 생성하려면 수집 된 경골과 대퇴골 뼈는 골수 교정 전에 근육 조직이 완전히 없어야합니다. 바이오티닐라제 항 CD3 및 항-비오틴 마이크로비드를 사용하여 골수 세포의 음의 정제는 또한 골수에서 림프구를 고갈하기 위해 수행 될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

추적 연구 Qdot Nanocrystals와 Murine 골수 파생 돌기 세포의 생성 및 라벨링

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

연구

면역학 및 감염병학

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

이식 - 대 - 호스트 질병의 유도 및<em&gt; 생체 내</emMHC 검색 손쥐 모델을 사용&gt; T 셀 모니터링

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

골수 이식으로 마우스 대장염에서 면역 및 비 면역 세포에서 유전자 발현의 기능 역할을 차별화

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

방법은 작은 RNA를과의 리보솜 점유 규제 역할을 조사하기 위해<em&gt; 말라리아 원충</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

마우스 골수에서 생성 및 GM-CSF의 식별 파생 폐포와 같은 대 식세포와 수지상 세포

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

정밀 절단 라이브 폐 수지상 세포를 시각화하기 위해 마우스 폐 슬라이스

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

An In Vivo Mouse Model to Measure NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Vivo에서 마우스 모델을 측정 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산 및 골 수 유래 수지상 세포에 의해 유도 된 Th1 차별화

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

장 이식-비교-호스트 질병 및 라이브 쥐에서 미니 내 시경 평가의 유도

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

디지털 PCR을 사용하여 마우스 조직에서 인간 T 세포의 Xegeneic Murine 모델 및 정량화에서 이식편 대 숙주 질환의 유도 및 채점

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...