Name: bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease
Uploaded: 2020-03-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease at JoVE.com

Denne studien støttes av University of Central Florida College of Medicine oppstartsstipend (til HN), University of Pittsburgh Medical Center Hillman Cancer Center oppstartsstipend (til HL), USA NIH Grant #1P20CA210300-01 og vietnamesiskhelsedepartementet Grant #4694 / QD-BYT (til PTH). Vi takker Dr. Xue-zhong Yu ved Medical University of South Carolina for å gi materialer til studien.

De eksperimentelle prosedyrene ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of University of Central Florida.
1. GVHD Induksjon
MERK: Allogene benmarg (BM) celletransplantasjon (trinn 1.2) utføres innen 24 timer etter bestråling. Alle prosedyrer beskrevet nedenfor utføres i et sterilt miljø. Utfør prosedyren i en vevskulturhette og bruk filtrerte reagenser.
<ol><li>Dag 0: Forbered mottakermusene.<ol>
<li>Bruk kvinnelige villtypemus (WT) på en ...

<ol>
	<li>Shlomchik, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).</li><li>Appelbaum, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+cell+transplantation+as+immunotherapy.">Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy.</a> Nature. 411, 385-389 (2001).</li><li>Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+graft-versus-host+disease+biology+and+therapy.">Advances in graft-versus-host disease biology and therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).</li><li>Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2010+report+from+the+Center+for+International+Blood+and+Marrow+Transplant+Research+(CIBMTR):+current+uses+and+outcomes+of+hematopoietic+cell+transplants+for+blood+and+bone+marrow+disorders.">2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders.</a> Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).</li><li>Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+graft-versus-host+disease:+advances+and+limitations.">Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations.</a> Disease Model &amp; Mechanism. 4, 318-333 (2011).</li><li>Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+for+Preclinical+Development+of+Allogeneic+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation.</a> ILAR Journal. , ily006 (2018).</li><li>Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+T+cell+subsets+in+lethal+graft-versus-host+disease+(GVHD)+directed+to+class+I+versus+class+II+H-2+differences.+II.+Protective+effects+of+L3T4++cells+in+anti-class+II+GVHD.">Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD.</a> Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).</li><li>Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosuppressor+and+allohelper+T+cells+in+acute+and+chronic+graft-vs-host+disease.+I.+Alloreactive+suppressor+cells+rather+than+killer+T+cells+appear+to+be+the+decisive+effector+cells+in+lethal+graft-vs.-host+disease.">Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).</li><li>Lu, Y., Waller, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomous+role+of+interferon-gamma+in+allogeneic+bone+marrow+transplant.">Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).</li><li>Abdollahi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+platelet-derived+growth+factor+signaling+attenuates+pulmonary+fibrosis.">Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li><li>Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+regulation+of+graft-versus-host+disease+and+graft-versus-leukemia.">Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia.</a> Blood. 119, 5088-5103 (2012).</li><li>Ullmann, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posaconazole+or+fluconazole+for+prophylaxis+in+severe+graft-versus-host+disease.">Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease.</a> New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).</li><li>Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+specific+cell+populations+by+complement+depletion.">Depletion of specific cell populations by complement depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li><li>Nguyen, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+alloantigen-activated+T+cells+after+hematopoietic+cell+transplantation.">Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Nguyen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+C3a+and+C5a+receptors+promote+GVHD+by+suppressing+mitophagy+in+recipient+dendritic+cells.">Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).</li><li>McNutt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Science. 342, 1417 (2013).</li><li>Negrin, R. S., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+using+bioluminescence:+a+tool+for+probing+graft-versus-host+disease.">In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).</li><li>Roy, D. C., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+vs+minor+histocompatibility+antigens.">Major vs minor histocompatibility antigens.</a> Blood. 129, 664-666 (2017).</li><li>Gendelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+conditioning+is+a+primary+determinant+in+modulating+the+effect+of+IL-7+on+murine+graft-versus-host+disease.">Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease.</a> Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HY-Specific+Induced+Regulatory+T+Cells+Display+High+Specificity+and+Efficacy+in+the+Prevention+of+Acute+Graft-versus-Host+Disease.">HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease.</a> Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).</li><li>Zeiser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+CD30+signaling+is+critical+for+adoptively+transferred+CD4+CD25++regulatory+T+cells+in+prevention+of+acute+graft-versus-host+disease.">Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 109, 2225-2233 (2007).</li><li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice.">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li></ol>

Bruken av stamceller som passer til en bestemt person er en effektiv tilnærming til å behandle avanserte og resistente kreftformer18. Små molekyllegemidler har imidlertid lenge vært et hovedfokus for personlig kreftbehandling. På den annen side, i cellulær terapi kan en rekke interaksjoner mellom donor og vert avgjørende påvirke behandlingsresultatene, for eksempel utviklingen av GVHD etter BMT1.
Store MHC-mismatched musemodeller av BMT e...

Allogene hematopoietiske stamcelletransplantasjon (BMT) er en effektiv terapi for å behandle hematologiske maligniteter1,2 gjennom graft-versus-leukemi (GVL) effekt3. Donorlymfocytter monterer imidlertid alltid uønskede immunologiske angrep mot mottakervev, en prosess som kalles graft-versus-host sykdom (GVHD)4.
Murine modeller av GVHD er et effektivt verktøy for å studere biologien til GVHD og GVL respons5. Mus er en kostnadseffektiv forskningsdyrmodell. De er små og effektivt dosert med molekyler og biologer i tidlige faser av utvikling6. Mus er ideelle forskningsdyr for genetiske manipulasjonsstudier fordi de er genetisk godt definert, noe som er ideelt for å studere biologiske veier og mekanismer6. Flere mus store histokompatibilitet kompleks (MHC) MHC-mismatchet modeller av GVHD har blitt godt etablert, for eksempel C57BL/6 (H2b) til BALB/c (H2d) og FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)5,7. Dette er spesielt verdifulle modeller for å bestemme rollen til individuelle celletyper, gener og faktorer som påvirker GVHD. Transplantasjon fra C57/BL/6 (H2b) foreldregivere til mottakere med mutasjoner i MHC I (B6.C-H2bm1) og/eller MHC II (B6.C-H2bm12) viste at en mismatch i både MHC klasse I og klasse II er et viktig krav for utvikling av akutt GVHD. Dette tyder på at både CD4+ og CD8+ T-celler er nødvendig for sykdomsutvikling7,8. GVHD er også involvert i en inflammatorisk kaskade kjent som den "proinflammatoriske cytokinstormen"9. Den vanligste kondisjoneringsmetoden i murine-modeller er total kroppsbestråling (TBI) av røntgen eller 137Cs. Dette fører til mottakerens benmargsablasjon, og dermed tillater donor stamcelleengraftment og forhindrer avvisning av transplantatet. Dette gjøres ved å begrense spredningen av mottaker T-celler som svar på donorceller. I tillegg spiller genetiske forskjeller en viktig rolle i sykdomsinduksjon, som også avhenger av mindre MHC-mismatch10. Myeloablatisk bestrålingsdose varierer derfor i forskjellige musestammer (f.eks. BALB/c→C57BL/6).
Aktivering av donor T-celler ved vert antigen presentere celler (APCer) er avgjørende for GVHD utvikling. Blant APCene er dendrittceller (DCer) de mest potente. De er arvelig i stand til å indusere GVHD på grunn av deres overlegne antigenopptak, uttrykk for T-celle co-stimulerende molekyler, og produksjon av proinflammatoriske cytokiner som polariserer T-celler i patogene undergrupper. Mottaker DCer er avgjørende for å legge til rette for T-celle priming og GVHD induksjon etter transplantasjon11,12. Følgelig har DCs blitt interessante mål i behandlingen av GVHD12.
TBI er nødvendig for å forbedre donorcelleinnpode. På grunn av TBI-effekten aktiveres mottaker-DCer og overlever i kort tid etter transplantasjonen12. Til tross for store fremskritt i bruk av bioluminescens eller fluorescens, etablere en effektiv modell for å studere rollen som mottaker DCs i GVHD er fortsatt utfordrende.
Fordi donor T-celler er drivkraften for GVL aktivitet, behandling strategier ved hjelp av immunsuppressive legemidler som steroider for å undertrykke T-celle alloreaktivitet ofte føre til tumor tilbakefall eller infeksjon13. Målretting mottaker DCs kan derfor gi en alternativ tilnærming til å behandle GVHD samtidig bevare GVL-effekten og unngå infeksjon.
Kort sagt, den nåværende studien gir en plattform for å forstå hvordan ulike typer signalering i mottaker-DCer regulerer GVHD-utvikling og GVL-effekten etter BMT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0 100ML</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A20 B-cell lymphoma</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>30954</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl CD4cre</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td></td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R (B220)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220 FITC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10452-85</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c- AF700</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>117319</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD25 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0041-86</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 eFluor&#174; 450 (Pacific Blue&#174; replacement)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>48-0042-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45.1 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0900-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD8a APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-0081-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-5958-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse MHC Class II-antibody APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5320-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TER-119 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Thy1.2</td>
			<td>Bio Excel</td>
			<td>BE0066</td>
			<td>BM generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6 fB-/- mice</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>564</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028</td>
			<td>Transplant recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Donors/Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0251-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5971-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Bilogicals R&#38;D system</td>
			<td>D17051</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352008</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB/NCrl</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>207</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysacharide (LPS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L4391-1MG</td>
			<td>DC mature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS column</td>
			<td>Mitenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Galaxy 170R incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Galaxy 170 R</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scienctific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TER119</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-RAD 320 Biological Irradiator</td>
			<td>Precision X-RAY</td>
			<td>X-RAD 320</td>
			<td>Total Body Irradiation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease

Allogene benmargstransplantasjon (BMT) er en effektiv terapi for hematologiske maligniteter på grunn av graft-versus-leukemi (GVL) effekt for å utrydde svulster. Imidlertid er søknaden begrenset av utviklingen av graft-versus-host sykdom (GVHD), en stor komplikasjon av BMT. GVHD fremkalles når T-celler i donortransplantatene gjenkjenner alloantigen uttrykt av mottakerceller og monterer uønskede immunologiske angrep mot mottakerens friske vev. Dermed er tradisjonelle terapier designet for å undertrykke donor T-celle alloreactivity. Disse tilnærmingene svekker imidlertid GVL-effekten vesentlig slik at mottakerens overlevelse ikke forbedres. Å forstå effekten av terapeutiske tilnærminger på BMT, GVL og GVHD, er dermed viktig. På grunn av antigen-presentere og cytokin-utskillekapasitet for å stimulere donor T-celler, mottaker dendrittiske celler (DCs) spille en betydelig rolle i induksjon av GVHD. Målretting mottaker DCs blir derfor en potensiell tilnærming for å kontrollere GVHD. Dette arbeidet gir en beskrivelse av en ny BMT-plattform for å undersøke hvordan verts-DCer regulerer GVH- og GVL-svar etter transplantasjon. Også presentert er en effektiv BMT modell for å studere biologien til GVHD og GVL etter transplantasjon.

Den store MHC-mismatched B6 (H2kb)-BALB/C (H2kd) modellen nært korresponderte med GVHD utvikling etter transplantasjon (Figur 2). Alle seks GVHD kliniske tegn etablert tidligere av Cooke et al.16 forekom hos mottakerne transplantert med WT-B6 T-celler, men ikke hos mottakerne transplantert med BM alene (trinn 1.5), som representerte GVHD-negativ gruppe. Det er to faser i GVHD utvikling i denne modellen. For det f...

Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease at JoVE.com

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Graft-versus-host sykdom er en stor komplikasjon etter allogen benmargstransplantasjon. Dendrittiske celler spiller en kritisk rolle i patogenesen av graft-versus-host sykdom. Den nåværende artikkelen beskriver en ny benmargstransplantasjonsplattform for å undersøke rollen som dendrittiske celler i utviklingen av graft-versus-host sykdom og graft-versus-leukemi effekt.

Benmargstransplantasjonsplattform for å undersøke rollen til dendrittiske celler i graft-versus vertssykdom

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

Denne romanen benmargstransplantasjon protokollen kan brukes til å undersøke hvordan verten dendrittiske celler regulerer graft-versus-host og graft-versus-leukemi svar etter transplantasjon. Ex vivo celle regenerering gjør at denne protokollen kan tilpasses for å teste rollen til andre immuncellepopulasjoner som makrofag og nøytrofiler bare ved å endre kulturtilstanden. Demonstrere prosedyren med meg vil være lab manager Krystal Hossack og lavere Sanjeev Gurshaney.For donor T-celle-utarmet C57BL/6 benmargsforberedelse, høst lårbenet og tibia i henhold til standard protokoller fra eutaniserte donormus og overfør beinene til en petriskål med 92 millimeter diameter som inneholder 1% RPMI-medium. Bruk saks, fjern endene fra hvert bein og fyll en tre milliliter sprøyte utstyrt med en 26 gauge nål med frisk 1% RPMI medium. Sett nålen inn i den ene enden av ett bein og trykk stempelet for å skylle benmargen ut av hulrommet og inn i en samlingscellesil.Når hele benmargen er samlet, spenne benmargsbitene gjennom et 75 mikrometer mesh filter og overføre encelledepensjon til en ny 50 milliliter tube. Sediment cellene ved sentrifugering og gjenbruk pellet på en 20 ganger 10 til de seks cellene per milliliter konsentrasjon i PBS supplert med 0,5% BSA. Deretter legger du til 0,05 mikrogram THI1-antistoff per en ganger 10 til de seks cellene for en 30-minutters inkubasjon ved fire grader Celsius.På slutten av inkubasjonen, vask cellene to ganger med 10 milliliter iskald PBS og resuspend pellet på en to ganger 10 til de syv cellene per milliliter konsentrasjon i 0,5% BSA supplert med 10% ung kanin komplement og 2% DNAse i sterilt vann for en 45-minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, vask cellene to ganger med 15 milliliter frisk PBS per vask og resuspend pellet i 20 milliliter PBS som inneholder 0,5%BSA. Pool lymfeknuter og milten i en 40 mikrometer pore sil og bruke en sprøyte stempel for å macerate vev gjennom filtrene for å frigjøre cellene.Vask silen og stempelet med RPMI medium supplert med 1% FBS for å samle alle cellene og sediment cellene ved sentrifugering. Tilsett fem milliliter ACK lysis buffer til cellepellet. Etter fem minutter ved romtemperatur, stopp reaksjonen med fem milliliter medium supplert med 1% FBS og pellet de hvite blodlegemene ved sentrifugering.Resuspend pellet i fem milliliter macs buffer for telling og fortynne cellene til en konsentrasjon på to ganger 10 til de åtte cellene per milliliter i fersk MACS buffer. Tilsett riktig konsentrasjon av anti-erythroid, anti-granulocytt, anti-B-celle, og anti-NK-celle uttømming antistoffer per en ganger 10 til de seks cellene for en 15-minutters inkubasjon ved fire grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, vask cellene med 10 milliliter iskald MACS buffer og resuspend pellet på en gang 10 til de åtte cellene per milliliter konsentrasjon i frisk MACS buffer.Deretter legger du til 0,22 mikroliter anti-biotin microbeads per en ganger 10 til de seks cellene med blanding for en 15-minutters inkubasjon ved fire grader Celsius. På slutten av inkubasjonen vask cellene med 10 milliliter iskald MACS-buffer og samle de ubundet berikede T-cellene ved magnetisk perleseparasjon ved hjelp av MACSxpress separator i henhold til standard perleisolasjonsprotokoller. På slutten av separasjonen sedimenterer T-cellene ved sentrifugering og gjenbruker pelleten i fem milliliter frisk MACS-buffer for telling.For å generere benmargsavledede dendrittiske celler, isolere benmargen fra lårbenet av vill type eller faktor B knockout mus som demonstrert og lyse de røde blodlegemene i fem milliliter ACK lysis buffer, stoppe reaksjonen med 10 milliliter RPMI supplert med 1% FBS etter fem minutter. Etter å ha samlet hele blodcellene ved sentrifugering, resuspend pellet i 10 milliliter kultur medium til en to ganger 10 til sjette celler per milliliter konsentrasjon og legge til 20 nanograms per milliliter GM-CSF til cellene før seeding 10 milliliter celler på individuelle 100 av 15 millimeter Petri retter på 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i seks dager. På dag seks aktiverer du benmargsavledede dendrittiske cellekulturer med 25 mikrogram per milliliter LPS per plate.Minst 85% av de kultiverte benmargscellene skiller seg i dendrittiske celler. T-celle renhet etter magnetisk perle berikelse er 90%Den store MHC mismatchet C57BL/6 BALB/c modellen tilsvarer nøye GVHD utvikling etter transplantasjon. Alvorlighetsgradens topp oppstår ca. 11 dager etter celleoverføring etterfulgt av en reduksjon i kliniske score og kroppsvektgjenoppretting opp til dag 16.Mottakerne bukket jevnt under for GVHD med 30 til 40 dager ettertransplantasjon. Interessant, transplantasjon med faktor B knockout dendrittiske celler forbedrer mottakerens overlevelse og GVHD kliniske score. Luciferase-transdusert A20 B-celle lymfom tillater overvåking av tumorvekst hos levende dyr.I dette representative eksperimentet døde alle de ville typen BALB/c-mottakere som fikk benmarg alene pluss A20 av et tumorfall. Wild type BALB/c mottakere transplantert med benmargs-avledet ACC1-utarmet donor T-celler døde av GVHD. I tillegg døde dyr som fikk donorbenmarg og ACC1-utarmet T-celler av både GVHD og tumorrefall.For å generere nok benmargscelle må de oppsamlede tibia- og lårbenene være helt fri for muskelvev før benmargskorreksjonen. Negativ rensing av benmargscellene med biotinylase anti-CD3 og Anti-Biotin MicroBeads kan også per utført for å tømme lymfocytten fra benmargen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induksjon av transplantat-mot-vert-sykdom og<em&gt; In Vivo</em&gt; T Cell overvåking ved hjelp av en MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Skille funksjonelle roller av genuttrykk fra immune og ikke-immune celler i mus Kolitt av benmargstransplantasjon

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Metoder for å undersøke om forskrifter rolle Små RNA og Ribosomalt Kapasitet av<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Generasjon og identifisering av GM-CSF Avledet Alveolære lignende makrofager og dendrittiske celler fra mus Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescens-aktivert cellesortering for Rensing av Plasmacytoid dendrittiske celler fra mus Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Precision-kutt Mouse Lung Slices å visualisere Live-lunge dendrittiske celler

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

An In Vivo Mouse Model to Measure NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

En i Vivo musemodell mål naiv CD4 T celle aktivering, spredning og Th1 differensiering av Ben margtransplantasjon-avledet dendrittiske celler

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Induksjon av Intestinal Graft - versus - host sykdom og sin Mini-endoskopisk vurdering i levende mus

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Induksjon og scoring av pode-versus-host sykdom i en Xenogeneic murine modell og kvantifisering av menneskelige T celler i mus vev ved hjelp av digital PCR

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...