Name: bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease
Uploaded: 2020-03-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease at JoVE.com

Este estudio es apoyado por la beca de inicio de la Universidad de Florida Central College of Medicine (a HN), la beca de inicio del Centro de Cáncer Hillman de la Universidad de Pittsburgh, Hillman Cancer Center (a HL), la Subvención NIH de los Estados Unidos #1P20CA210300-01 y la Beca del Ministerio de Salud de Vietnam #4694/QD-BYT (a PTH). Agradecemos al Dr. Xue-zhong Yu de la Universidad Médica de Carolina del Sur por proporcionar materiales para el estudio.

Los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Florida Central.
1. Inducción de la EICH
NOTA: El trasplante de células alogénicos de médula ósea (BM) (paso 1.2) se realiza dentro de las 24 h después de la irradiación. Todos los procedimientos descritos a continuación se realizan en un entorno estéril. Realice el procedimiento en una campana de cultivo de tejido y utilice reacti...

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	<li>Shlomchik, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).</li><li>Appelbaum, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+cell+transplantation+as+immunotherapy.">Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy.</a> Nature. 411, 385-389 (2001).</li><li>Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+graft-versus-host+disease+biology+and+therapy.">Advances in graft-versus-host disease biology and therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).</li><li>Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2010+report+from+the+Center+for+International+Blood+and+Marrow+Transplant+Research+(CIBMTR):+current+uses+and+outcomes+of+hematopoietic+cell+transplants+for+blood+and+bone+marrow+disorders.">2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders.</a> Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).</li><li>Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+graft-versus-host+disease:+advances+and+limitations.">Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations.</a> Disease Model &amp; Mechanism. 4, 318-333 (2011).</li><li>Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+for+Preclinical+Development+of+Allogeneic+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation.</a> ILAR Journal. , ily006 (2018).</li><li>Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+T+cell+subsets+in+lethal+graft-versus-host+disease+(GVHD)+directed+to+class+I+versus+class+II+H-2+differences.+II.+Protective+effects+of+L3T4++cells+in+anti-class+II+GVHD.">Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD.</a> Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).</li><li>Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosuppressor+and+allohelper+T+cells+in+acute+and+chronic+graft-vs-host+disease.+I.+Alloreactive+suppressor+cells+rather+than+killer+T+cells+appear+to+be+the+decisive+effector+cells+in+lethal+graft-vs.-host+disease.">Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).</li><li>Lu, Y., Waller, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomous+role+of+interferon-gamma+in+allogeneic+bone+marrow+transplant.">Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).</li><li>Abdollahi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+platelet-derived+growth+factor+signaling+attenuates+pulmonary+fibrosis.">Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li><li>Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+regulation+of+graft-versus-host+disease+and+graft-versus-leukemia.">Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia.</a> Blood. 119, 5088-5103 (2012).</li><li>Ullmann, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posaconazole+or+fluconazole+for+prophylaxis+in+severe+graft-versus-host+disease.">Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease.</a> New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).</li><li>Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+specific+cell+populations+by+complement+depletion.">Depletion of specific cell populations by complement depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li><li>Nguyen, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+alloantigen-activated+T+cells+after+hematopoietic+cell+transplantation.">Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Nguyen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+C3a+and+C5a+receptors+promote+GVHD+by+suppressing+mitophagy+in+recipient+dendritic+cells.">Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).</li><li>McNutt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Science. 342, 1417 (2013).</li><li>Negrin, R. S., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+using+bioluminescence:+a+tool+for+probing+graft-versus-host+disease.">In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).</li><li>Roy, D. C., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+vs+minor+histocompatibility+antigens.">Major vs minor histocompatibility antigens.</a> Blood. 129, 664-666 (2017).</li><li>Gendelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+conditioning+is+a+primary+determinant+in+modulating+the+effect+of+IL-7+on+murine+graft-versus-host+disease.">Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease.</a> Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HY-Specific+Induced+Regulatory+T+Cells+Display+High+Specificity+and+Efficacy+in+the+Prevention+of+Acute+Graft-versus-Host+Disease.">HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease.</a> Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).</li><li>Zeiser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+CD30+signaling+is+critical+for+adoptively+transferred+CD4+CD25++regulatory+T+cells+in+prevention+of+acute+graft-versus-host+disease.">Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 109, 2225-2233 (2007).</li><li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice.">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li></ol>

El uso de células madre para adaptarse a un individuo en particular es un enfoque eficaz para tratar cánceres avanzados y resistentes18. Los productos farmacéuticos de moléculas pequeñas, sin embargo, han permanecido durante mucho tiempo un foco principal de la terapia personalizada contra el cáncer. Por otro lado, en la terapia celular una multitud de interacciones entre el donante y el huésped puede influir decisivamente en los resultados del tratamiento, como el desarrollo de la EICH des...

El trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (BMT) es una terapia eficaz para tratar las neoplasias malignas hematológicas1,2 a través del efecto injerto-contra-leucemia (GVL)3. Sin embargo, los linfocitos de donantes siempre montan ataques inmunológicos no deseados contra los tejidos receptores, un proceso llamado enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD)4.
Los modelos murinos de La EICH son una herramienta eficaz para estudiar la biología de la EICH y la respuesta GVL5. Los ratones son un modelo animal de investigación rentable. Son pequeñas y eficientemente dosificados con moléculas y productos biológicos en las primeras fases del desarrollo6. Los ratones son animales de investigación ideales para estudios de manipulación genética porque están genéticamente bien definidos, lo que es ideal para el estudio de vías y mecanismos biológicos6. Se han establecido bien varios modelos de GHC de MHC de complejos de histocompatibilidad (MHC) de ratón, como C57BL/6 (H2b) a BALB/c (H2d) y FVB (H2q) , C57BL/6 (H2b)5,7. Estos son modelos particularmente valiosos para determinar el papel de los tipos de células individuales, genes y factores que afectan a la EICH. El trasplante de C57/BL/6 (H2b) a receptores con mutaciones en MHC I (B6.C-H2bm1)y/o MHC II (B6.C-H2bm12) reveló que un desajuste tanto en MHC clase I como en clase II es un requisito importante para el desarrollo de la EICH aguda. Esto sugiere que tanto CD4+ como CD8+ T-células son necesarias para el desarrollo de la enfermedad7,8. La EICH también participa en una cascada inflamatoria conocida como la «tormenta proinflamatoria de la citoquina»9. El método de acondicionamiento más común en los modelos murinos es la irradiación corporal total (TBI) por rayos X o 137Cs. Esto conduce a la ablación de la médula ósea del receptor, permitiendo así el injerto de células madre del donante y previniendo el rechazo del injerto. Esto se hace limitando la proliferación de células T receptoras en respuesta a las células donantes. Además, las disparidades genéticas desempeñan un papel importante en la inducción de la enfermedad, que también depende del menor de coincidencia de MHC10. Por lo tanto, la dosis de irradiación mieloablativa varía en diferentes cepas de ratón (por ejemplo, BALB/c-C57BL/6).
La activación de las células T del donante por las células que presentan el antígeno host (ACC) es esencial para el desarrollo de la EICH. Entre los ACC, las células dendríticas (CC) son las más potentes. Son herediblemente capaces de inducir la EICH debido a su ingesta superior de antígenos, la expresión de moléculas coestimulantes de células T y la producción de citoquinas proinflamatorias que polarizan las células T en subconjuntos patógenos. Los CI receptores son fundamentales para facilitar el cebado de células T y la inducción de la EICH después del trasplante11,12. En consecuencia, los centros de interesado se han convertido en objetivos interesantes en el tratamiento de la EICH12.
Se requiere TBI para mejorar el injerto de células del donante. Debido al efecto TBI, los cocones receptores se activan y sobreviven durante un breve periodo de tiempo después del trasplante12. A pesar de los importantes avances en el uso de la bioluminiscencia o la fluorescencia, el establecimiento de un modelo eficaz para estudiar el papel de los DC receptores en la EICH sigue siendo un desafío.
Debido a que las células T del donante son la fuerza motriz para la actividad de GVL, las estrategias de tratamiento que utilizan medicamentos inmunosupresores como los esteroides para suprimir la aoresación de células T a menudo causan recaída tumoral o infección13. Por lo tanto, los dispositivos de compra de beneficiarios pueden proporcionar un enfoque alternativo para tratar la EICH, preservando al mismo tiempo el efecto GVL y evitando la infección.
En resumen, el estudio actual proporciona una plataforma para comprender cómo los diferentes tipos de señalización en los CC receptores regulan el desarrollo de la EICH y el efecto GVL después de BMT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0 100ML</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A20 B-cell lymphoma</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>30954</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl CD4cre</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td></td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R (B220)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220 FITC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10452-85</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c- AF700</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>117319</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD25 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0041-86</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 eFluor&#174; 450 (Pacific Blue&#174; replacement)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>48-0042-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45.1 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0900-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD8a APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-0081-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-5958-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse MHC Class II-antibody APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5320-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TER-119 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Thy1.2</td>
			<td>Bio Excel</td>
			<td>BE0066</td>
			<td>BM generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6 fB-/- mice</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>564</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028</td>
			<td>Transplant recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Donors/Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0251-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5971-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Bilogicals R&#38;D system</td>
			<td>D17051</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352008</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB/NCrl</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>207</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysacharide (LPS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L4391-1MG</td>
			<td>DC mature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS column</td>
			<td>Mitenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Galaxy 170R incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Galaxy 170 R</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scienctific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TER119</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-RAD 320 Biological Irradiator</td>
			<td>Precision X-RAY</td>
			<td>X-RAD 320</td>
			<td>Total Body Irradiation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease

El trasplante alogénico de médula ósea (BMT) es una terapia eficaz para neoplasias malignas hematológicas debido al efecto injerto-contra leucemia (GVL) para erradicar los tumores. Sin embargo, su aplicación está limitada por el desarrollo de la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), una complicación importante de la MtB. La EICH se evoca cuando las células T en los injertos de donantes reconocen el clorótatógeno expresado por las células receptoras y montan ataques inmunológicos no deseados contra tejidos sanos receptores. Por lo tanto, las terapias tradicionales están diseñadas para suprimir la aleeactividad de las células T del donante. Sin embargo, estos enfoques perjudican sustancialmente el efecto GVL para que no se mejore la supervivencia del receptor. Por lo tanto, es esencial comprender los efectos de los enfoques terapéuticos en bMT, GVL y EICH. Debido a las capacidades de presentación de antígenos y secretodenia para estimular las células T del donante, las células dendríticas receptoras (CC) desempeñan un papel importante en la inducción de la EICH. Por lo tanto, la segmentación de los controladores de datos de los destinatarios se convierte en un enfoque potencial para controlar la EICH. Este trabajo proporciona una descripción de una nueva plataforma BMT para investigar cómo los cAños anfitriones regulan las respuestas de GVH y GVL después del trasplante. También se presenta un modelo BMT eficaz para estudiar la biología de la EICH y la EV después del trasplante.

El principal modelo B6 (H2kb)-BALB/C (H2kd) correspondió estrechamente al desarrollo de la EICH después del trasplante(Figura 2). Los seis signos clínicos de la EICH establecidos anteriormente por Cooke et al.16 ocurrieron en los receptores trasplantados con células T WT-B6, pero no en los receptores trasplantados solo con BM (paso 1.5), que representaba el grupo negativo de la EICH. Hay dos fases en el desarr...

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Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

La enfermedad de injerto contra huésped es una complicación importante después del trasplante alogénico de médula ósea. Las células dendríticas desempeñan un papel crítico en la patogénesis de la enfermedad del injerto contra el huésped. El artículo actual describe una nueva plataforma de trasplante de médula ósea para investigar el papel de las células dendríticas en el desarrollo de la enfermedad de injerto contra huésped y el efecto injerto-contra-leucemia.

Plataforma de trasplante de médula ósea para investigar el papel de las células dendríticas en la enfermedad de injerto contra huésped

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

Este novedoso protocolo de trasplante de médula ósea se puede utilizar para investigar cómo las células dendríticas del huésped regulan las respuestas de injerto contra huésped e injerto contra leucemia después del trasplante. Las regeneraciones celulares ex vivo permiten adaptar este protocolo para probar el papel de otras poblaciones de células inmunitarias como los macrófagos y los neutrófilos simplemente modificando la condición de cultivo. Demostrando el procedimiento conmigo será el gerente de laboratorio Krystal Hossack y el estudiante Sanjeev Gurshaney.Para la preparación de médula ósea C57BL/6 agotada por células T del donante, cosecha el fémur y la tibia de acuerdo con los protocolos estándar de ratones donantes eutanizados y transfiere los huesos a una placa Petri de 92 milímetros de diámetro que contenga un medio de 1%RPMI. Con tijeras, retire los extremos de cada hueso y llene una jeringa de tres mililitros equipada con una aguja de calibre 26 con un medio fresco de 1%RPMI. Inserte la aguja en un extremo de un hueso y presione el émbolo para eliminar la médula ósea de la cavidad y en un colador de células de recolección.Una vez que se haya recogido toda la médula ósea, tensa las piezas de la médula ósea a través de un filtro de malla de 75 micrómetros y transfiere la suspensión de una sola célula a un nuevo tubo de 50 mililitros. Sedimentar las células por centrifugación y resuspender el pellet en un 20 veces 10 a las seis células por mililitro concentración en PBS complementado con 0.5%BSA. A continuación, agregue 0,05 microgramos de anticuerpos THI1 por uno por 10 a las seis células para una incubación de 30 minutos a cuatro grados centígrados.Al final de la incubación, lavar las células dos veces con 10 mililitros de PBS helado y resuspender el pellet a dos veces 10 a las siete células por concentración de mililitro en 0.5%BSA complementado con 10% de suplemento de conejo joven y 2%DNAse en agua estéril para una incubación de 45 minutos a 37 grados Celsius. Al final de la incubación, lave las células dos veces con 15 mililitros de PBS fresco por lavado y resusppend el pellet en 20 mililitros de PBS que contienen 0.5%BSA. Agrupa los ganglios linfáticos y el bazo en un colador de poro de 40 micrómetros y usa un émbolo de jeringa para macerar los tejidos a través de los filtros para liberar las células.Lavar el colador y el émbolo con el medio RPMI complementado con 1%FBS para recoger todas las células y sedimentar las células por centrifugación. Agregue cinco mililitros de tónime de ACK al pellet de la célula. Después de cinco minutos a temperatura ambiente, detener la reacción con cinco mililitros de medio complementados con 1%FBS y peletizar los glóbulos blancos por centrifugación.Resuspender el pellet en cinco mililitros de tampón MACS para contar y diluir las células a una concentración de dos veces 10 a las ocho células por mililitro en el búfer MACS fresco. Agregue la concentración adecuada de anticuerpos anti-eritroide, antigranulocitos, anti-células B y anti-células NK por uno por uno 10 a las seis células para una incubación de 15 minutos a cuatro grados celsius. Al final de la incubación, lave las células con 10 mililitros de tampón MACS helado y resusppend el pellet en un solo 10 a las ocho células por concentración de mililitro en tampón MACS fresco.A continuación, agregue 0,22 microlitros de microperlas antibiotinas por una vez 10 a las seis células con mezcla para una incubación de 15 minutos a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, lave las células con 10 mililitros de tampón MACS frío y recoja las células T enriquecidas sin enlazar mediante separación magnética de cordón utilizando el separador MACSxpress de acuerdo con los protocolos de aislamiento de cuentas estándar. Al final de la separación, sedimentar las células T por centrifugación y resuspend el pellet en cinco mililitros de tampón MACS fresco para el recuento.Para generar células dendríticas derivadas de la médula ósea, aísle la médula ósea de los fémures de tipo salvaje o de los ratones noqueadores del factor B como se ha demostrado y anule los glóbulos rojos en cinco mililitros de tampón de lisis ACK, deteniendo la reacción con 10 mililitros de RPMI complementados con 1%FBS después de cinco minutos. Después de recoger las células sanguíneas enteras por centrifugación, resuspender el pellet en 10 mililitros de medio de cultivo a dos veces 10 a la sexta célula por mililitro de concentración y añadir 20 nanogramos por mililitro de GM-CSF a las células antes de sembrar 10 mililitros de células en platos individuales de 100 por 15 milímetros De Petri a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante seis días. En el sexto día, active los cultivos de células dendríticas derivadas de la médula ósea con 25 microgramos por mililitro de LPS por placa.Al menos el 85% de las células de médula ósea cultivadas se diferencian en células dendríticas. La pureza de la célula T después del enriquecimiento magnético del cordón es del 90%El principal modelo C57BL/6 BALB/c no coincidente con MHC corresponde estrechamente al desarrollo de la EICH después del trasplante. El pico de gravedad ocurre aproximadamente 11 días después de la transferencia celular seguido de una reducción en las puntuaciones clínicas y la recuperación del peso corporal hasta el día 16.Los receptores sucumbieron uniformemente a la EICH por 30 a 40 días después de la trasplante. Curiosamente, el trasplante con células dendríticas noqueadoras del factor B mejora la supervivencia de los receptores y las puntuaciones clínicas de la EICH. El linfoma de células B A20 transducido por Luciferase permite el monitoreo del crecimiento tumoral en animales vivos.En este experimento representativo, todos los receptores BALB/c de tipo salvaje que recibieron médula ósea solos más A20 murieron de una recaída tumoral. Los receptores BALB/c de tipo salvaje trasplantados con células T de donantes con ACC1 de origen boneo agotadas por ACC1 murieron de EICH. Además, los animales que recibieron médula ósea del donante y células T agotadas por ACC1 murieron de la EICH y la recaída tumoral.Para generar suficiente célula de médula ósea, la tibia y los huesos del fémur recogidos deben estar completamente libres de tejido muscular antes de la corrección de la médula ósea. La purificación negativa de las células de la médula ósea con micro-CD3 y anti-biotina MicroBeads también puede ser realizada para agotar el linfocitos de la médula ósea.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Generación y Etiquetado de murino médula ósea procedentes de células dendríticas con nanocristales Qdot de Estudios de seguimiento

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Investigación

Inmunología e Infección

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

La inducción de la enfermedad de injerto contra huésped y<em&gt; En Vivo</em&gt; T Monitoreo Celular Utilizando un modelo murino MHC de concordancia

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Métodos para investigar el papel de Regulación de pequeños ARN ribosomal y ocupación de<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Generación e identificación de GM-CSF Derivado alveolares-como los macrófagos y las células dendríticas A partir de médula ósea de ratones

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Clasificación de células activadas por fluorescencia para la purificación de células dendríticas plasmocitoide de la médula ósea de ratones

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Precisión de corte pulmón de ratón Rebanadas para visualizar las células en vivo pulmonar dendríticas

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

An In Vivo Mouse Model to Measure NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Un modelo de ratón In Vivo a medida ingenuo CD4 células T activación, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por las células dendríticas derivadas de la médula ósea

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Inducción de Intestinal injerto - versus - host Disease y su evaluación Mini-endoscópica en ratones vivos

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Inducción y puntuación de la enfermedad de injerto-versus-huésped en un modelo de murina xenógeno y cuantificación de células T humanas en tejidos de ratón utilizando PCR digital

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...