Name: bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease
Uploaded: 2020-03-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease at JoVE.com

Denna studie stöds av University of Central Florida College of Medicine start-up bidrag (till HN), University of Pittsburgh Medical Center Hillman Cancer Center start-up bidrag (till HL), USA NIH Grant #1P20CA210300-01 och vietnamesiska hälsoministeriet Grant #4694 / QD-BYT (till PTH). Vi tackar Dr Xue-zhong Yu vid Medical University of South Carolina för att tillhandahålla material för studien.

De experimentella förfarandena godkändes av institutionella Djur vård och användning kommittén vid University of Central Florida.
1. GVHD Induktion
OBS: Allogen benmärg (BM) celltransplantation (steg 1.2) utförs inom 24 timmar efter bestrålning. Alla procedurer som beskrivs nedan utförs i en steril miljö. Utför proceduren i en vävnadskulturhuva och använd filtrerade reagenser.
<ol><li>Dag 0: Förbered mottagarmössen.<ol>
<li>Använd möss av kvinnlig...

<ol>
	<li>Shlomchik, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).</li><li>Appelbaum, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+cell+transplantation+as+immunotherapy.">Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy.</a> Nature. 411, 385-389 (2001).</li><li>Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+graft-versus-host+disease+biology+and+therapy.">Advances in graft-versus-host disease biology and therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).</li><li>Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2010+report+from+the+Center+for+International+Blood+and+Marrow+Transplant+Research+(CIBMTR):+current+uses+and+outcomes+of+hematopoietic+cell+transplants+for+blood+and+bone+marrow+disorders.">2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders.</a> Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).</li><li>Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+graft-versus-host+disease:+advances+and+limitations.">Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations.</a> Disease Model &amp; Mechanism. 4, 318-333 (2011).</li><li>Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+for+Preclinical+Development+of+Allogeneic+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation.</a> ILAR Journal. , ily006 (2018).</li><li>Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+T+cell+subsets+in+lethal+graft-versus-host+disease+(GVHD)+directed+to+class+I+versus+class+II+H-2+differences.+II.+Protective+effects+of+L3T4++cells+in+anti-class+II+GVHD.">Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD.</a> Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).</li><li>Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosuppressor+and+allohelper+T+cells+in+acute+and+chronic+graft-vs-host+disease.+I.+Alloreactive+suppressor+cells+rather+than+killer+T+cells+appear+to+be+the+decisive+effector+cells+in+lethal+graft-vs.-host+disease.">Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).</li><li>Lu, Y., Waller, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomous+role+of+interferon-gamma+in+allogeneic+bone+marrow+transplant.">Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).</li><li>Abdollahi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+platelet-derived+growth+factor+signaling+attenuates+pulmonary+fibrosis.">Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li><li>Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+regulation+of+graft-versus-host+disease+and+graft-versus-leukemia.">Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia.</a> Blood. 119, 5088-5103 (2012).</li><li>Ullmann, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posaconazole+or+fluconazole+for+prophylaxis+in+severe+graft-versus-host+disease.">Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease.</a> New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).</li><li>Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+specific+cell+populations+by+complement+depletion.">Depletion of specific cell populations by complement depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li><li>Nguyen, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+alloantigen-activated+T+cells+after+hematopoietic+cell+transplantation.">Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Nguyen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+C3a+and+C5a+receptors+promote+GVHD+by+suppressing+mitophagy+in+recipient+dendritic+cells.">Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).</li><li>McNutt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Science. 342, 1417 (2013).</li><li>Negrin, R. S., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+using+bioluminescence:+a+tool+for+probing+graft-versus-host+disease.">In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).</li><li>Roy, D. C., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+vs+minor+histocompatibility+antigens.">Major vs minor histocompatibility antigens.</a> Blood. 129, 664-666 (2017).</li><li>Gendelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+conditioning+is+a+primary+determinant+in+modulating+the+effect+of+IL-7+on+murine+graft-versus-host+disease.">Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease.</a> Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HY-Specific+Induced+Regulatory+T+Cells+Display+High+Specificity+and+Efficacy+in+the+Prevention+of+Acute+Graft-versus-Host+Disease.">HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease.</a> Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).</li><li>Zeiser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+CD30+signaling+is+critical+for+adoptively+transferred+CD4+CD25++regulatory+T+cells+in+prevention+of+acute+graft-versus-host+disease.">Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 109, 2225-2233 (2007).</li><li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice.">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li></ol>

Användningen av stamceller för att passa en viss individ är ett effektivt tillvägagångssätt för att behandla avancerade och resistenta cancer18. Små molekylläkemedel har dock länge varit ett primärt fokus på personlig cancerbehandling. Å andra sidan, i cellulär terapi en mängd interaktioner mellan givare och värd kan beslutsamt påverka behandlingsresultaten, såsom utvecklingen av GVHD efter BMT1.
Major MHC-inkompatibla musmodell...

Allogena hematopoietic stamceller transplantation (BMT) är en effektiv terapi för att behandla hematologiska maligniteter1,2 genom graft-versus-leukemi (GVL) effekt3. Emellertid, givare lymfocyter alltid montera oönskade immunologiska attacker mot mottagaren vävnader, en process som kallas graft-versus-host sjukdom (GVHD)4.
Murine modeller av GVHD är ett effektivt verktyg för att studera biologi GVHD och GVL svar5. Möss är en kostnadseffektiv forskningsdjursmodell. De är små och effektivt dosed med molekyler och biologiska läkemedel i tidiga faser av utveckling6. Möss är idealiska forskningsdjur för genetisk manipulation studier eftersom de är genetiskt väl definierade, vilket är idealiskt för att studera biologiska vägar och mekanismer6. Flera mus stora histocompatibility komplexa (MHC) MHC-inkompatibla modeller av GVHD har varit väl etablerade, såsom C57BL/6 (H2b) till BALB / c (H2d) och FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)5,7. Dessa är särskilt värdefulla modeller för att bestämma rollen för enskilda celltyper, gener och faktorer som påverkar GVHD. Transplantation från C57/BL/6 (H2b)föräldradonatorer till mottagare med mutationer i MHC I (B6.C-H2bm1)och/eller MHC II (B6.C-H2bm12) visade att en obalans i både MHC klass I och klass II är ett viktigt krav för utvecklingen av akut GVHD. Detta tyder på att både CD4+ och CD8+ T-celler krävs för sjukdomsutveckling7,8. GVHD är också involverad i en inflammatorisk kaskad som kallas den "proinflammatoriska cytokinstormen"9. Den vanligaste konditioneringsmetoden i murinemodeller är total kroppsbestrålning (TBI) med röntgen eller 137Cs. Detta leder till mottagarens benmärgablation, vilket gör det möjligt för givaren stamcellsengraftment och förhindra nde av transplantatet. Detta görs genom att begränsa spridningen av mottagare T-celler som svar på donatorceller. Dessutom spelar genetiska skillnader en viktig roll i sjukdomsinduktion, som också beror på mindre MHC-obalans10. Därför varierar myeloablativ bestrålningsdos i olika musstammar (t.ex. BALB/c→C57BL/6).
Aktivering av givare T-celler av värd antigen presentera celler (APC) är viktigt för GVHD utveckling. Bland De apc:er är de dritiska cellerna (DCs) de mest potenta. De är ärftligt kapabla att inducera GVHD på grund av deras överlägsna antigenupptag, uttryck för T-cells co-stimulatory molekyler, och produktion av proinflammatoriska cytokiner som polariserar T-celler i patogena undergrupper. Mottagare DCs är avgörande för att underlätta T-cells priming och GVHD induktion efter transplantation11,12. Följaktligen har DCs blivit intressanta mål vid behandling av GVHD12.
TBI krävs för att förbättra givaren cellengraftment. På grund av TBI-effekten aktiveras mottagar-DCs och överlever under en kort tid efter transplantationen12. Trots stora framsteg i användningen av bioluminescens eller fluorescens, etablera en effektiv modell för att studera rollen som mottagare DC i GVHD är fortfarande utmanande.
Eftersom givaren T-celler är den drivande kraften för GVL aktivitet, behandlingsstrategier med immunsuppressiva läkemedel såsom steroider för att undertrycka T-cells alloreactivity orsakar ofta tumör återfall eller infektion13. Därför kan inriktning en mottagare DCs ge en alternativ metod för att behandla GVHD samtidigt som GVL-effekten och undvika infektion.
I korthet ger den aktuella studien en plattform för att förstå hur olika typer av signalering i mottagare DCs reglerar GVHD utveckling och GVL effekt efter BMT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0 100ML</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A20 B-cell lymphoma</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>30954</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl CD4cre</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td></td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R (B220)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220 FITC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10452-85</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c- AF700</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>117319</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD25 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0041-86</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 eFluor&#174; 450 (Pacific Blue&#174; replacement)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>48-0042-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45.1 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0900-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD8a APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-0081-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-5958-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse MHC Class II-antibody APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5320-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TER-119 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Thy1.2</td>
			<td>Bio Excel</td>
			<td>BE0066</td>
			<td>BM generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6 fB-/- mice</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>564</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028</td>
			<td>Transplant recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Donors/Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0251-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5971-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Bilogicals R&#38;D system</td>
			<td>D17051</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352008</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB/NCrl</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>207</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysacharide (LPS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L4391-1MG</td>
			<td>DC mature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS column</td>
			<td>Mitenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Galaxy 170R incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Galaxy 170 R</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scienctific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TER119</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-RAD 320 Biological Irradiator</td>
			<td>Precision X-RAY</td>
			<td>X-RAD 320</td>
			<td>Total Body Irradiation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease

Allogen benmärgtransplantation (BMT) är en effektiv terapi för hematologiska maligniteter på grund av graft-versus-leukemi (GVL) effekt för att utrota tumörer. Emellertid, dess tillämpning begränsas av utvecklingen av graft-versus-host sjukdom (GVHD), en stor komplikation av BMT. GVHD framkallas när T-celler i givaren ympkvistar känner igenalloantigen uttryckt av mottagarceller och montera oönskade immunologiska attacker mot mottagaren friska vävnader. Således är traditionella terapier utformade för att undertrycka givaren T-cells alloreactivity. Dessa metoder försämrar dock avsevärt GVL-effekten så att mottagarens överlevnad inte förbättras. Att förstå effekterna av terapeutiska metoder på BMT, GVL och GVHD är därför viktigt. På grund av antigen-presentera och cytokin-utsöndrar kapacitet för att stimulera givaren T-celler, mottagare dendritiska celler (DCs) spelar en viktig roll i induktion av GVHD. Därför blir inriktning på mottagar-DCs en potentiell metod för att kontrollera GVHD. Detta arbete ger en beskrivning av en ny BMT plattform för att undersöka hur värd DCs reglera GVH och GVL svar efter transplantation. Presenteras också är en effektiv BMT modell för att studera biologi GVHD och GVL efter transplantation.

Den stora MHC-felmatchade B6-modellen (H2k b)-BALB/C (H2kd)motsvarade gvhd-utvecklingen efter transplantationen (figur 2).b Alla sex Kliniska GVHD-tecken som tidigare fastställts av Cooke et al.16 inträffade hos mottagarna som transplanterats med WT-B6 T-celler men inte i mottagarna som transplanterats enbart med BM (steg 1.5), som representerade gvhd-negativa gruppen. Det finns två faser i GVHD utveckling i de...

Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease at JoVE.com

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Graft-versus-host sjukdom är en stor komplikation efter allogena benmärg transplantation. Dendritiska celler spelar en avgörande roll i patogenesen vid graft-versus-host sjukdom. Den aktuella artikeln beskriver en ny benmärg transplantation plattform för att undersöka dendritiska cellers roll i utvecklingen av graft-versus-host sjukdom och graft-versus-leukemi effekt.

Bone Marrow Transplantation Plattform för att undersöka rollen av dendritiska celler i Graft-versus-Host Disease

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

Denna nya benmärgstransplantation protokoll kan användas för att undersöka hur värd dendritiska celler reglerar graft-versus-host och graft-versus-leukemi svar efter transplantation. Ex vivo cell regenereringar gör att detta protokoll som skall anpassas för att testa rollen av andra immuncellpopulation såsom makrofag och neutrofiler helt enkelt genom att ändra odlingstillståndet. Demonstrerar proceduren med mig blir labbchefen Krystal Hossack och grundutbildningen Sanjeev Gurshaney.För givare t-cell-utarmat C57BL/6 benmärg beredning, skörda lårbenet och skenbenet enligt standardprotokoll från avlivade givare möss och överföra ben i en 92 millimeter diameter Petri skålen innehåller 1%RPMI medium. Ta bort ändarna från varje ben med hjälp av sax och fyll en tre milliliterspruta utrustad med en 26 gauge nål med färskt 1%RPMI medium. Stick in nålen i ena änden av ett ben och tryck ned kolven för att spola ut benmärgen ur hålrummet och i en uppsamlingscellsil.När hela benmärgen har samlats in, sila benmärgen bitar genom en 75 mikrometer mesh filter och överföra encelliga suspensionen till en ny 50 milliliter rör. Sediment cellerna genom centrifugering och resuspend pelleten vid en 20 gånger 10 till de sex cellerna per milliliter koncentration i PBS kompletteras med 0,5%BSA. Därefter lägger du till 0,05 mikrogram AVTIO1-antikropp per en gånger 10 till de sex cellerna för en 30-minuters inkubation vid fyra grader Celsius.Vid slutet av inkubationen, tvätta cellerna två gånger med 10 milliliter iskall PBS och resuspend pelleten vid en två gånger 10 till de sju cellerna per milliliter koncentration i 0,5%BSA kompletteras med 10%ung kanin komplement och 2%DNAse i sterilt vatten för en 45-minuters inkubation vid 37 grader Celsius. Vid slutet av inkubationen tvättar du cellerna två gånger med 15 milliliter färsk PBS per tvätt och återanvänd pelleten i 20 milliliter PBS innehållande 0,5%BSA. Poola lymfkörtlarna och mjälten i en 40 mikrometer porsil och använd en sprutkolv för att macererera vävnaderna genom filtren för att frigöra cellerna.Tvätta silen och kolven med RPMI-medium kompletterat med 1%FBS för att samla alla celler och sediment cellerna genom centrifugeringen. Lägg till fem milliliter ACK-lysbuffert till cellpelleten. Efter fem minuter i rumstemperatur, stoppa reaktionen med fem milliliter medium kompletteras med 1%FBS och pellet de vita blodkropparna genom centrifugeringen.Resuspend pelleten i fem milliliter av MACS buffert för räkning och späda cellerna till en koncentration av två gånger 10 till de åtta cellerna per milliliter i färsk MACS buffert. Tillsätt lämplig koncentration av anti-erytroida, anti-granulocyte, anti-B-cell, och anti-NK-cell utarmning antikroppar per en gånger 10 till de sex cellerna för en 15-minuters inkubation vid fyra grader Celsius. Vid slutet av inkubationen, tvätta cellerna med 10 milliliter iskall MACS buffert och återanvänd pelleten vid en gånger 10 till de åtta cellerna per milliliter koncentration i färsk MACS buffert.Därefter lägger du till 0,22 mikroliter anti-biotin mikropärlor per en gång 10 till de sex cellerna med blandning för en 15-minuters inkubation vid fyra grader Celsius. Vid slutet av inkubationen, tvätta cellerna med 10 milliliter iskall MACS buffert och samla de obundna berikade T-celler genom magnetisk pärla separation med hjälp av MACSxpress separator enligt standard pärla isolering protokoll. Vid slutet av separationen sedimentera T-cellerna genom centrifugering och resuspend pelleten i fem milliliter färsk MACS-buffert för räkning.För att generera benmärgshärledda dendritiska celler, isolera benmärgen från lårbenen av vilda typ eller faktor B knockout möss som visat och lysa de röda blodkropparna i fem milliliter av ACK lys buffert, stoppa reaktionen med 10 milliliter av RPMI kompletteras med 1%FBS efter fem minuter. Efter att ha samlat hela blodkropparna genom centrifuger, resuspend pelleten i 10 milliliter av odlingsmedium till två gånger 10 till den sjätte cellen per milliliter koncentration och lägga till 20 nanogram per milliliter GM-CSF till cellerna innan sådd 10 milliliter celler på enskilda 100 med 15 millimeter Petri rätter vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid i sex dagar. På dag sex, aktivera benmärg-härledda dendritiska cellkulturer med 25 mikrogram per milliliter lps per platta.Minst 85%av de odlade benmärgscellerna differentierar till dendritiska celler. T-cellsrenhet efter magnetisk pärla anrikning är 90%Den stora MHC felmatchade C57BL/6 BALB/c modellen nära motsvarar GVHD utveckling efter transplantation. Toppen av allvarlighetsgraden inträffar cirka 11 dagar efter cellöverföring följt av en minskning av de kliniska poängen och kroppsviktsåtervinning fram till dag 16.Mottagarna dukade enhetligt till GVHD vid 30 till 40 dagar posttransplant. Intressant, transplantation med faktor B knockout dendritic celler förbättrar mottagarens överlevnad och GVHD kliniska poäng. Luciferase-transduced A20 B-cells lymfom möjliggör övervakning av tumörtillväxt i levande djur.I detta representativa experiment, alla av vilda typ BALB / c mottagare som fick benmärg ensam plus A20 dog av en tumör återfall. Vilda typ BALB/c mottagare transplanteras med benmärg-derived ACC1-utarmat givare T-celler dog av GVHD. Dessutom dog djur som fick givaren benmärg och ACC1-utarmat T-celler av både GVHD och tumör återfall.För att generera tillräckligt med benmärgscell måste de insamlade skenbenet och lårbenet vara helt fria från muskelvävnad före benmärgskorrigeringen. Negativ rening av benmärgscellerna med biotinylase anti-CD3 och Anti-Biotin MicroBeads kan också per utförs för att tömma lymfocyter från benmärgen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Generering och märkning av murina härledd från benmärg dendritiska celler med Qdot Nanokristaller för spårning studier

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induktion av transplantat-mot-värd-sjukdom och<em&gt; In Vivo</em&gt; T cell övervakning med en MHC-matchade musmodell

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Skilja funktionella roller av genuttryck från immuna och icke-immuna celler i mus Kolit av benmärgstransplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Metoder för att undersöka den reglerande roll små RNA och Ribosomalt Beläggning av<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Generering och identifiering av GM-CSF Derived Alveolära liknande makrofager och dendritiska celler från benmärg från mus

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescensaktiverad cellsortering för Rening av Plasmacytoid dendritiska celler från benmärg från mus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Precision-cut Mouse Lung skivor att visualisera Live Pulmonary dendritiska celler

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

An In Vivo Mouse Model to Measure NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

En In Vivo musmodell åtgärd naiva CD4 T-cellsaktivering, spridning och Th1 differentiering induceras av benmärgen-derived dendritiska celler

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Induktion av Intestinal Graft - versus - host sjukdom och dess Mini-endoskopisk bedömning i levande möss

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Induktion och poängsättning av graft-versus-host-sjukdom i en Xenogeneisk murin modell och kvantifiering av humana T-celler i mus vävnader med hjälp av digital PCR

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...