Name: bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease
Uploaded: 2020-03-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease at JoVE.com

Bu çalışma University of Central Florida College of Medicine start-up hibe (HN), Pittsburgh Üniversitesi Tıp Merkezi Hillman Kanser Merkezi start-up hibe (HL), Amerika Birleşik Devletleri NIH Grant #1P20CA210300-01 ve Vietnam Sağlık Bakanlığı Hibe #4694/QD-BYT (PTH için) tarafından desteklenir. Güney Carolina Tıp Üniversitesi'nden Dr. Xue-zhong Yu'ya çalışma için malzeme sağladığı için teşekkür ederiz.

Deneysel prosedürler, Central Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
1. GVHD İndüksiyon
NOT: Allojeneik kemik iliği (BM) hücre nakli (adım 1.2) ışınlama dan sonra 24 saat içinde yapılır. Aşağıda açıklanan tüm işlemler steril bir ortamda gerçekleştirilir. Bir doku kültürü başlık prosedürü gerçekleştirin ve filtrelenmiş reaktifler kullanın.
<ol><li>0. Gün: Alıcı fareleri hazırlay...

<ol>
	<li>Shlomchik, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).</li><li>Appelbaum, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+cell+transplantation+as+immunotherapy.">Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy.</a> Nature. 411, 385-389 (2001).</li><li>Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+graft-versus-host+disease+biology+and+therapy.">Advances in graft-versus-host disease biology and therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).</li><li>Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2010+report+from+the+Center+for+International+Blood+and+Marrow+Transplant+Research+(CIBMTR):+current+uses+and+outcomes+of+hematopoietic+cell+transplants+for+blood+and+bone+marrow+disorders.">2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders.</a> Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).</li><li>Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+graft-versus-host+disease:+advances+and+limitations.">Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations.</a> Disease Model &amp; Mechanism. 4, 318-333 (2011).</li><li>Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+for+Preclinical+Development+of+Allogeneic+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation.</a> ILAR Journal. , ily006 (2018).</li><li>Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+T+cell+subsets+in+lethal+graft-versus-host+disease+(GVHD)+directed+to+class+I+versus+class+II+H-2+differences.+II.+Protective+effects+of+L3T4++cells+in+anti-class+II+GVHD.">Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD.</a> Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).</li><li>Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosuppressor+and+allohelper+T+cells+in+acute+and+chronic+graft-vs-host+disease.+I.+Alloreactive+suppressor+cells+rather+than+killer+T+cells+appear+to+be+the+decisive+effector+cells+in+lethal+graft-vs.-host+disease.">Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).</li><li>Lu, Y., Waller, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomous+role+of+interferon-gamma+in+allogeneic+bone+marrow+transplant.">Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).</li><li>Abdollahi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+platelet-derived+growth+factor+signaling+attenuates+pulmonary+fibrosis.">Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li><li>Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+regulation+of+graft-versus-host+disease+and+graft-versus-leukemia.">Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia.</a> Blood. 119, 5088-5103 (2012).</li><li>Ullmann, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posaconazole+or+fluconazole+for+prophylaxis+in+severe+graft-versus-host+disease.">Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease.</a> New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).</li><li>Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+specific+cell+populations+by+complement+depletion.">Depletion of specific cell populations by complement depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li><li>Nguyen, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+alloantigen-activated+T+cells+after+hematopoietic+cell+transplantation.">Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Nguyen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+C3a+and+C5a+receptors+promote+GVHD+by+suppressing+mitophagy+in+recipient+dendritic+cells.">Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).</li><li>McNutt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Science. 342, 1417 (2013).</li><li>Negrin, R. S., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+using+bioluminescence:+a+tool+for+probing+graft-versus-host+disease.">In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).</li><li>Roy, D. C., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+vs+minor+histocompatibility+antigens.">Major vs minor histocompatibility antigens.</a> Blood. 129, 664-666 (2017).</li><li>Gendelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+conditioning+is+a+primary+determinant+in+modulating+the+effect+of+IL-7+on+murine+graft-versus-host+disease.">Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease.</a> Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HY-Specific+Induced+Regulatory+T+Cells+Display+High+Specificity+and+Efficacy+in+the+Prevention+of+Acute+Graft-versus-Host+Disease.">HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease.</a> Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).</li><li>Zeiser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+CD30+signaling+is+critical+for+adoptively+transferred+CD4+CD25++regulatory+T+cells+in+prevention+of+acute+graft-versus-host+disease.">Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 109, 2225-2233 (2007).</li><li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice.">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li></ol>

Belirli bir kişiye uygun kök hücre kullanımı gelişmiş ve dirençli kanserlerin tedavisinde etkili bir yaklaşımdır18. Küçük molekül ilaç, ancak, uzun kişiselleştirilmiş kanser tedavisinin birincil odak kalmıştır. Öte yandan, hücresel tedavide donör ve konak arasındaki etkileşimlerin çok sayıda kararlı tedavi sonuçlarını etkileyebilir, BMT sonra GVHD gelişimi gibi1.
BmT'nin MHC'li büyük fare modelleri GVHD'nin biy...

Allojeneik hematopoetik kök hücre nakli (KT) hematolojik malignitelerin tedavisinde etkili bir tedavidir1,2 greft-versus-lösemi (GVL) etkisi ile3. Ancak, donör lenfositler her zaman alıcı dokulara karşı istenmeyen immünolojik ataklar monte, greft-versus-host hastalığı olarak adlandırılan bir süreç (GVHD)4.
GVHD Murine modelleri GVHD ve GVLyanıtı5 biyolojisini incelemek için etkili bir araçtır. Fareler uygun maliyetli bir araştırma hayvan modelidir. Onlar küçük ve verimli moleküller ve biyolojik geliştirmeninerken aşamalarında ile dosed 6 . Onlar genetik olarak iyi tanımlanmış, çünkü fareler genetik manipülasyon çalışmaları için ideal araştırma hayvanlar, hangi biyolojik yollar ve mekanizmaları incelemek için idealdir6. C57BL/6 (H2b) ile BALB/c (H2d)ve FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)5,7gibi birkaç fare majör histouyumluluk kompleksi (MHC) MHC uyumsuzmodelleri iyi kurulmuştur. Bunlar, bireysel hücre tiplerinin, genlerin ve GVHD'yi etkileyen faktörlerin rolünü belirlemek için özellikle değerli modellerdir. C57/BL/6 (H2b)ebeveyn donörlerinden MHC I (B6.C-H2bm1)ve/veya MHC II (B6.C-H2bm12)mutasyonu olan alıcılara yapılan transplantasyon, hem MHC sınıf I'de hem de sınıf II'de bir uyumsuzluk olduğunu ortaya koymuştur. Bu hem CD4+ ve CD8+ T-hücreleri hastalık gelişimi için gerekli olduğunu göstermektedir7,8. GVHD aynı zamanda 'pro-inflamatuar sitokin fırtınası' olarak bilinen inflamatuar bir kaskad yer almaktadır9. Murine modellerinde en sık kullanılan klima yöntemi x-ray veya 137Cs ile toplam vücut ışınlaması (TBI) yöntemidir. Bu alıcının kemik iliği ablasyon yol açar, böylece donör kök hücre engraftment izin ve greft reddini önlemek. Bu donör hücrelere yanıt olarak alıcı T-hücrelerinin çoğalmasını sınırlayarak yapılır. Ayrıca, genetik eşitsizlikler de küçük MHC-uyumsuzluk10bağlıdır hastalık indüksiyon, önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, miyeloablatif ışınlama dozu farklı fare suşlarında değişir (örneğin, BALB/c→C57BL/6).
Donör T-hücrelerinin konak antijen sunan hücreler (AAP' ler) tarafından aktivasyonu GVHD gelişimi için gereklidir. ADC'ler arasında, dendritik hücreler (DCs) en güçlü. Onlar kalıtsal onların üstün antijen alımı nedeniyle GVHD indükleme yeteneğine sahiptirler, T-hücre ko-uyarıcı moleküllerin ekspresyonu, ve patojenik subsets içine T-hücreleri polarize pro-inflamatuar sitokinler üretimi. Alıcı DCs transplantasyon sonrası T-hücre astar ve GVHD indüksiyon kolaylaştırmak için kritik11,12. Buna göre, DCs GVHD tedavisinde ilginç hedefler haline gelmiştir12.
TBI donör hücre engraftment geliştirmek için gereklidir. TBI etkisi nedeniyle alıcı CD'ler aktive edilir ve transplantasyondan sonra kısa bir süre hayattakalır12. Biyolüminesans veya floresan kullanımındaki büyük gelişmelere rağmen, GVHD'de alıcı DC'lerin rolünü incelemek için etkili bir model oluşturmak hala zordur.
Donör T-hücreleri GVL aktivitesi için itici güç olduğundan, t-hücre alloreactivity bastırmak için steroid gibi immünsupresif ilaçlar kullanarak tedavi stratejileri genellikle tümör nüks veyaenfeksiyonneden 13. Bu nedenle, alıcı DC'leri hedeflemek GVL etkisini korurken ve enfeksiyondan kaçınırken GVHD tedavisinde alternatif bir yaklaşım sağlayabilir.
Kısacası, mevcut çalışma, alıcı DC'lerde farklı sinyal türlerinin GVHD gelişimini ve BMT'den sonra GVL etkisini nasıl düzenlediğini anlamak için bir platform sağlamaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0 100ML</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482100</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A20 B-cell lymphoma</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>30954</td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACC1 fl/fl CD4cre</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td></td>
			<td>GVL experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R (B220)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220 FITC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10452-85</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c- AF700</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>117319</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD25 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0041-86</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD4 eFluor&#174; 450 (Pacific Blue&#174; replacement)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>48-0042-82</td>
			<td>Flow staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45.1 PE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-0900-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD8a APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-0081-83</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-5958-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse MHC Class II-antibody APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5320-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TER-119 Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Thy1.2</td>
			<td>Bio Excel</td>
			<td>BE0066</td>
			<td>BM generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6 fB-/- mice</td>
			<td>University of Central Florida</td>
			<td>In house</td>
			<td>Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>564</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>028</td>
			<td>Transplant recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Donors/Recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0112-85</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0251-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-0452-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5971-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 uM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Bilogicals R&#38;D system</td>
			<td>D17051</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352008</td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB/NCrl</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>207</td>
			<td>Donors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysacharide (LPS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L4391-1MG</td>
			<td>DC mature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS column</td>
			<td>Mitenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Galaxy 170R incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Galaxy 170 R</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scienctific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TER119</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-5921-82</td>
			<td>T-cell enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Xenogen IVIS-200</td>
			<td>Live animal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-RAD 320 Biological Irradiator</td>
			<td>Precision X-RAY</td>
			<td>X-RAD 320</td>
			<td>Total Body Irradiation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in graft-versus-host disease

Allojeneik kemik iliği transplantasyonu (KNOT), tümörlerin kökünü kurutmak için greft-versus-lösemi (GVL) etkisine bağlı hematolojik maligniteler için etkili bir tedavi yöntemidir. Ancak, uygulama greft-versus-host hastalığı gelişimi ile sınırlıdır (GVHD), BMT önemli bir komplikasyon. GVHD donör greftlerinde T-hücreleri alıcı hücreler tarafından ifade alloantijen tanımak ve alıcı sağlıklı dokulara karşı istenmeyen immünolojik saldırılar monte uyarılır. Böylece, geleneksel tedaviler donör T-hücre alloreactivity bastırmak için tasarlanmıştır. Ancak, bu yaklaşımlar gvl etkisini önemli ölçüde bozar, böylece alıcının hayatta kalması iyileştirilmez. Terapötik yaklaşımların BMT, GVL ve GVHD üzerindeki etkilerini anlamak bu nedenle önemlidir. Donör T-hücrelerini uyarmak için antijen sunum ve sitokin salgılayıcı kapasiteleri nedeniyle, alıcı dendritik hücreler (DCs) GVHD indüksiyonönemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, alıcı DC'leri hedefleme gvhd kontrol etmek için potansiyel bir yaklaşım haline gelir. Bu çalışma, ev sahibi DC'lerin transplantasyon sonrası GVH ve GVL yanıtlarını nasıl düzenlediğini araştırmak için yeni bir BMT platformunun açıklamasını sağlar. Ayrıca transplantasyon sonrası GVHD ve GVL biyolojisini incelemek için etkili bir BMT modeli sunulmaktadır.

Majör MHC uyumsuz B6 (H2kb)-BALB/C (H2kd)modeli transplantasyon sonrası GVHD gelişimine yakından karşılık gelmektedir (Şekil 2). Cooke ve ark.16 tarafından daha önce tespit edilen altı GVHD klinik bulgunun tümü WT-B6 T-hücreleri ile nakledilen alıcılarda meydana gelmekte, ancak gvhd-negatif grubunu temsil eden BM ile nakledilen alıcılarda (adım 1.5) yer almıyordu. Bu modelde GVHD gelişiminde i...

Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease at JoVE.com

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Greft-versus-host hastalığı allojenik kemik iliği transplantasyonu sonrası önemli bir komplikasyondur. Dendritik hücreler greft-versus-host hastalığının patogenezinde kritik bir rol oynarlar. Bu makalede, dendritik hücrelerin greft-versus-host hastalığı nın gelişimindeki rolünü ve greft-versus-lösemi etkisinin araştırılması için yeni bir kemik iliği transplantasyon platformu açıklanmaktadır.

Kemik İliği Transplantasyon Platformu Greft-versus-Host Hastalığında Dendritik Hücrelerin Rolünü Araştırmak Için

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

Bu yeni kemik iliği nakli protokolü, transplantasyon sonrası konak dendritik hücrelerin greft-versus-host ve greft-versus-lösemi yanıtlarını nasıl düzenlediğini araştırmak için kullanılabilir. Ex vivo hücre rejenerasyonları bu protokolün sadece kültür durumunu değiştirerek makrofaj ve nötrofiller gibi diğer bağışıklık hücre popülasyonunun rolünü test etmek için uyarlanmasına olanak sağlar. Prosedürü benimle birlikte gösteren laboratuvar müdürü Krystal Hossack ve lisans Sanjeev Gurshaney olacaktır.Donör T-hücre tükenen C57BL/6 kemik iliği hazırlığı için, ötanazi donör farelerin standart protokollerine göre femur ve tibia hasat ve 92 milimetre çapında Petri çanak içine transfer 1%RPMI orta. Makas kullanarak, her kemikten uçları çıkarın ve taze% 1 RPMI orta ile 26 gauge iğne ile donatılmış üç mililitreşlik şırınga doldurun. İğneyi bir kemiğin bir ucuna yerleştirin ve kemik iliğini boşluktan çıkarıp toplama hücresi süzgecinden çıkarmak için pistonun tuşuna basın.Tüm kemik iliği toplandığında, kemik iliği parçalarını 75 mikrometrelik bir kafes filtresinden geçirin ve tek hücreli süspansiyonu 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Hücreleri santrifüj ile tortulayın ve pbs'de mililitre konsantrasyonu başına altı hücreye 20 çarpı 10 oranında geri alın ve %0.5 BSA ile tamamlayın. Daha sonra, dört santigrat derecede 30 dakikalık bir kuluçka için altı hücreye 10 kez thi1 antikor 0.05 mikrogram ekleyin.Kuluçka sonunda, hücreleri 10 mililitre buz gibi pbs ile iki kez yıkayın ve mililitre başına yedi hücreye 2 kez 10%BSA ile takviye %10 genç tavşan komplemanı ve %2 NAAse steril suda 45 dakikalık kuluçka için 37 santigrat dereceye kadar yeniden askıya alın. Kuluçka sonunda, hücreleri yıkama başına 15 mililitre taze PBS ile iki kez yıkayın ve %0,5 BSA içeren 20 mililitre PBS'de peleti yeniden askıya alın. 40 mikrometre gözenek süzgecinde lenf düğümlerini ve dalağını birleştirin ve hücreleri serbest bırakmak için dokuları filtrelerden geçirmek için bir şırınga pistonu kullanın.Tüm hücreleri toplamak ve santrifüj ile hücreleri tortulamak için% 1 FBS ile desteklenen RPMI orta ile süzgeç ve piston yıkayın. Hücre peletine beş mililitre ACK lisis arabelleği ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, orta beş mililitre ile reaksiyonu durdurmak 1% FBS ile takviye ve santrifüj ile beyaz kan hücreleri pelet.Saymak için beş mililitre MACS tamponundaki peleti yeniden askıya alın ve hücreleri taze MACS tamponunda mililitre başına sekiz hücreye kadar iki katı 10'luk bir konsantrasyona seyreltin. Anti-eritrosit uygun konsantrasyonu ekleyin, anti-granülosit, anti-B hücresi, ve anti-NK-hücre tükenmesi antikorları bir kez 10 dört santigrat derecede 15 dakikalık kuluçka için altı hücreye. Kuluçka sonunda, hücreleri 10 mililitre buz gibi MACS tamponuyla yıkayın ve taze MACS tamponundaki mililitre konsantrasyonu başına sekiz hücreye bir kere 10'da peleti yeniden askıya alın.Daha sonra, dört santigrat derecede 15 dakikalık bir kuluçka için karıştırma ile altı hücre ye 10 kez 10 başına Anti-Biotin MicroBeads 0.22 mikrolitre ekleyin. Kuluçka sonunda, hücreleri 10 mililitre buz gibi MACS tamponuyla yıkayın ve standart boncuk izolasyon protokollerine göre MACSxpress ayırıcısını kullanarak manyetik boncuk ayrıştırma ile bağlanmamış zenginleştirilmiş T-hücrelerini toplayın. Ayırma sonunda, t-hücrelerini santrifüj ile tortular ve peleti saymak için beş mililitre taze MACS tamponu içinde yeniden askıya alın.Kemik iliği kaynaklı dendritik hücreler oluşturmak için, kemik iliğini vahşi tip veya faktör B nakavt farelerin uyluk kemiğinden izole edin ve kırmızı kan hücrelerini ACK lysis tamponunun beş mililitresinde inceleyin, beş dakika sonra %1 FBS ile takviye edilen 10 mililitre RPMI ile reaksiyonu durdurun. Santrifüj ile tüm kan hücrelerini topladıktan sonra, mililitre konsantrasyonbaşına altıncı hücrelere iki kez 10 kültür orta 10 mililitre pelet resuspend ve 10 mililitre hücre üzerine tek tek 100 mililitre tohumlama önce hücrelere GM-CSF mililitre başına 20 nanogram ekleyin 100 tarafından 15 milimetre Petri yemekleri 37 santigrat derece ve 5% karbon dioksit altı gün boyunca. Altıncı günde, kemik iliği kaynaklı dendritik hücre kültürlerini plaka başına mililitre başına 25 mikrogram ile aktive edin.Kültürlü kemik iliği hücrelerinin en az %85'i dendritik hücrelere ayrılır. Manyetik boncuk zenginleştirme sonrası T-hücre saflığı %90'dır Majör MHC uyumsuz C57BL/6 BALB/c modeli transplantasyon sonrası GVHD gelişimine yakından karşılık gelmektedir. Şiddetin doruğu hücre transferinden yaklaşık 11 gün sonra ortaya çıkar ve ardından klinik skorlarda azalma ve 16.Alıcılar 30 ila 40 gün sonra GVHD'ye yenik düştüler. İlginçtir, faktör B nakavt dendritik hücreleri ile transplantasyon alıcı sağkalım ve GVHD klinik skorları artırır. Luciferase transdükse A20 B hücreli lenfoma canlı hayvanlarda tümör büyümesinin izlenmesini sağlar.Bu temsili deneyde, tek başına kemik iliği ve A20 alan tüm yabani balb/c alıcıları tümör nüksünden öldü. Kemik iliği kaynaklı ACC1-tükenmiş donör T-hücreleri ile nakledilen yabani tip BALB/c alıcıları GVHD'den öldü. Buna ek olarak, donör kemik iliği ve ACC1-tükenmiş T-hücreleri alınan hayvanlar hem GVHD ve tümör nüks öldü.Yeterli kemik iliği hücresi oluşturmak için, toplanan tibia ve femur kemikleri kemik iliği düzeltme önce kas dokusu tamamen serbest olmalıdır. Biyotinylaz anti-CD3 ve Anti-Biotin MikroBoncuklar ile kemik iliği hücrelerinin negatif saflaştırma da kemik iliği lenfosit tüketmek için yapılan başına olabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

İzleme Araştırmaları Qdot nanokristaller murin Kemik İliği-türevli dendritik hücrelerin üretilmesi ve Etiketleme

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve<em&gt; In Vivo</emBir MHC-eşlemeli murin Model Kullanma&gt; T Hücre İzleme

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Kemik İliği Transplantasyonu tarafından Fare Kolit immün ve non-immün Hücreler Gen Ekspresyonu İşlevsel Rolleri Farklılaşan

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Yöntemler Küçük RNA&#39;ların ve Ribosomal doluluk Düzenleyici Rolü Araştırma<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Fare Kemik İliği itibaren Üretimi ve GM-CSF tanımlanması Türetilmiş Alveoler gibi makrofajlar ve dendritik hücrelerin

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Hassas kesimli Canlı Pulmoner Dendritik Hücreler Visualize&#39;a Fare Akciğer Dilimleri

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

An In Vivo Mouse Model to Measure NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Vivo fare modeli ölçü saf CD4 T Hücre aktivasyonu, yayılması ve kemik iliği türevi dendritik hücreler tarafından indüklenen Th1 farklılaşma

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

İndüksiyon bağırsak Graft - versus - host hastalığı ve canlı fareler, Mini-endoskopik değerlendirme

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Bir Xenogeneic Murine modelinde Graft-versus-Host hastalığının indüksiyon ve skorlama ve dijital PCR kullanarak fare dokularında ınsan T hücrelerinin ölçümü

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...