Name: generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

وقد تم دعم هذا البحث بتمويل من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (NHLBI)، والمعاهد الوطنية للصحة من خلال المنح U01HL099656 (P.G. وD.L.F.) وU01HL134696 (P.G. و D.L.F.).

1. تصميم وبناء دليل RNA (gRNA)
ملاحظة: يتكون كل gRNA من اثنين من 60 زوج قاعدة (BP) oligonucleotides التي يتم صلب لتوليد 100 نقطة أساس مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل (DS) oligonucleotide(الشكل 1A-C). الجدول الزمني لتصميم gRNA، وتوليد، واختبار كفاءة القطع هو ما يقرب من 2 أسابيع(?...

<ol>
	<li>Srivastava, D., Dewitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+In+Vivo+Cellular+Reprogramming:+The+Next+Generation.">Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation.</a> Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Review Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Embryonic+Stem+Cells+to+Relevant+Populations:+Lessons+from+Embryonic+Development.">Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 1-6 (2018).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Tiyaboonchai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA6+Plays+an+Important+Role+in+the+Induction+of+Human+Definitive+Endoderm,+Development+of+the+Pancreas,+and+Functionality+of+Pancreatic+&#946;+Cells.">GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic &#946; Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+hESCs+to+Probe+the+Interaction+of+the+Diabetes-Associated+Genes+CDKAL1+and+MT1E.">Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E.</a> Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Isogenic+Human+ESC+Platform+for+Functional+Evaluation+of+Genome-wide-Association-Study-Identified+Diabetes+Genes+and+Drug+Discovery.">An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+with+zinc+finger+nucleases+for+cellular+imaging.">Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging.</a> Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).</li><li>Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Modification+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Homologous+Recombination+and+CRISPR/Cas9+System.">Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System.</a> Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+gene-corrected+adult+beta+globin+protein+in+human+erythrocytes+differentiated+from+patient+iPSCs+after+genome+editing+of+the+sickle+point+mutation.">Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors.">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).</li><li>Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Doxycycline-Inducible+System+for+Genetic+Correction+of+iPSC+Disease+Models.">A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li><li>Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+human+stem+cells.">Genome editing in human stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).</li><li>Zhu, Z., Gonz&#225;lez, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis.">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li><li>Cong, L., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).</li><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+homology+directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA.">Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li><li>Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+crispr+cas9-mediated+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).</li></ol>

في هذا البروتوكول، يظهر استخدام CRISPR-CAS9 جنبا إلى جنب مع اثنين من قوالب إصلاح ssODN لتوليد تغييرات محددة في الجينوم غير المتجانس أو المتجانس في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى. وقد أدى هذا الأسلوب إلى نجاح توليد خطوط الخلايا المسببة للسرطان التي تعبر عن التغيرات الجينية غير المتجانسة بك?...

الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSCs) هي أدوات قيمة لنمذجة الأمراض البشرية بسبب قدرتها على التجديد، مع الحفاظ على القدرة على توليد أنواع الخلايا من سلالات مختلفة1،2 ،3،4. هذه النماذج تفتح إمكانية استجواب وظيفة الجينات، وفهم كيف ترتبط الطفرات المحددة والأنماط الظاهرية بأمراض مختلفة5،6. ومع ذلك، لفهم كيفية ربط تغيير معين إلى النمط الظاهري معين، واستخدام التحكم isogenic المقترنة وخطوط الخلايا متحولة من المهم للسيطرة على خط لتقلب خط7،8. وقد استخدمت النوكلورات الشبيهة بالمنشطات والزنك لتوليد طفرات الإدراج أو الحذف (indels) في نماذج وراثية متنوعة، بما في ذلك الخلايا الأولية؛ ولكن هذه nucleases يمكن أن تكون مرهقة للاستخدام ومكلفة9،10،11،12،13،14. وقد أحدث اكتشاف تكرار قصير متباعد (CRISPR)-CAS9 nuclease متفاوتة في الميدان بسبب الكفاءة في تكوين الإندل في أي منطقة من الجينوم تقريبا، وبساطة الاستخدام، وخفض التكلفة15 , 16 سنة , 17 سنة , 18 سنة , 19.
وكان التحدي في استخدام تكنولوجيا تحرير الجينوم القائم على CRISPR-CAS9 توليد أو تصحيح طفرات محددة في أليل واحد دون خلق طفرة indel في الأليل الثاني20. الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو التغلب على هذا التحدي باستخدام اثنين من قوالب إصلاح oligonucleotide واحد الذين تقطعت بهم السبل (ssODN) للحد من تشكيل الإندل في الأليل الثاني. تم تصميم كل من ssODNs لاحتواء الطفرات الصامتة لمنع إعادة قطع من قبل NUcLEASE CAS9، ولكن واحد فقط يحتوي على تغيير الفائدة. هذا الأسلوب يزيد من كفاءة توليد تعديل وراثي غير متجانسة دون تحفيز تشكيل indel في الأليل الثاني. باستخدام هذا البروتوكول، تظهر تجارب تحرير الجينات في ستة مواقع جينية مستقلة الإدخال الدقيق للتغيير الجيني المطلوب في الأليل واحد دون تشكيل الإندل في الأليل الثاني ويحدث مع كفاءة عامة من ~ 10٪. وقد تم تكييف البروتوكول الموصوف من ماغواير وآخرون21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="705">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap</td>
			<td style="width:145px;">Corning</td>
			<td style="width:124px;">352235</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well polystyrene tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AflII restriction endonuclease</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:124px;">R0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:124px;">N605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">dNTPs</td>
			<td style="width:145px;">Roche</td>
			<td style="width:124px;">11969064001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibson Assembly Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gRNA_Cloning Vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:124px;">41824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar plates containing 50 &#956;g/ml kanamycin</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine Stem Reagent</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">(STEM00001)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine embryonic fibroblasts (MEFs)</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:124px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital shaking incubator</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">pCas9_GFP vector</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:124px;">44719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR strip tubes</td>
			<td style="width:145px;">USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5&#215; Phusion buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:124px;">K210011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:124px;">Qiagen 19133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td style="width:124px;">636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC medium</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9020S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td style="width:124px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells

توفر الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى نظامًا قويًا لدراسة وظيفة الجينات ونمذجة الطفرات المحددة ذات الصلة بالمرض. إن توليد تعديلات جينية دقيقة غير متجانسة يشكل تحدياً بسبب تشكيل الإندل بوساطة كريسبر-كاس9 في الأليل الثاني. هنا، نقوم بإظهار بروتوكول للمساعدة في التغلب على هذه الصعوبة باستخدام اثنين من قوالب الإصلاح التي واحدة فقط يعبر عن تغيير التسلسل المطلوب، في حين أن كلا النموذجين تحتوي على طفرات صامتة لمنع إعادة قطع وتشكيل indel. هذه المنهجية هي الأكثر فائدة لتحرير الجينات مناطق الترميز من الحمض النووي لتوليد السيطرة المسببة للسرطان ومتحولة خطوط الخلايا الجذعية البشرية لدراسة الأمراض البشرية والبيولوجيا. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحسين منهجيات التغوط والفحص إلى أقصى حد للحد من العمالة وتكلفة تجربة تحرير الجينات. وبشكل عام، ينطبق هذا البروتوكول على نطاق واسع على العديد من مشاريع تحرير الجينوم التي تستخدم نموذج الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القوى.

توليد الـ RNAs وفحص الإندلات
سيتم استنساخ كل gRNA في متجه بلازميد ويعبر عنها باستخدام المروج U6. يتم استخدام إنزيم تقييد AflII لخطي بلازميد (#41824) ويقع بعد المروج U6. يتم استنساخ الفرقة 100 نقطة أساس التي تم إنشاؤها بعد صلب اثنين 60 نقطة أساس oligos في ناقلات التعبير gRNA باستخد?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

يوفر هذا البروتوكول طريقة لتسهيل توليد تغييرات النيوكليوتيدات المتجانسة أو المتجانسة المحددة باستخدام CRISPR-CAS9 في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى.

توليد تعديلات جينية محددة باستخدام CRISPR-CAS9 في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

وتعرقل دراسة وظيفة الجينات والمرض من الطبيعة الأصيلة للسكان البشر. الخلفيات الجينية المختلفة من المريض محددة والسيطرة على خطوط الخلايا iPS يمكن أن تؤثر على كفاءة التمايز والأنماط الظاهرية الموجودة في اختبار وظيفية معينة. استخدام خطوط متطابقة وراثيا أو isogenic حيث الفرق الوحيد هو طفرة معينة من الاهتمام أمر بالغ الأهمية للتغلب على هذه القضايا.ويتسبب العديد من الأمراض البشرية من الطفرات heterozygous، والتي يمكن أن يكون من الصعب توليد مع نظام كريسبر-Cas9. ويرجع ذلك إلى توليد طفرات إندل في أليل غير المستهدفة التي يمكن أن تحدث على تردد عال جدا. أسلوبنا يتغلب على هذه المشكلة باستخدام اثنين من قوالب الإصلاح التي واحدة فقط المرافئ طفرة الفائدة.أي محقق يحاول هذه التقنية يجب أن تكون ماهرة في ثقافة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. سوف مظاهرة الفيديو من قطف مستعمرة تكون مفيدة لإظهار الحجم الصحيح ومورفولوجيا فضلا عن تقنية تستخدم في الانتقاء والفرز. إثبات هذا الإجراء سيكون ليو كارديناس.للبدء، لوحة ESCs الإنسان على MEFs المشعة في لوحة 6-جيدا. إعداد المزيج الرئيسي transfection. تخلط عن طريق الأنابيب واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.عندما تصل الخلايا إلى 70 إلى 80٪ التقاء، ثم، إضافة المزيج سيد transfection إسقاط الحكمة إلى كل بئر مع الخلايا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. تغيير الوسائط كل 24 ساعة. لحصاد الخلايا، أولاً، احتضان الخلايا مع الثلاثي E لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة MEFs الأنزيمية.إضافة 0.5 ملليلتر من HESC المتوسطة مع 10 مثبطات الصخور الدقيقة. خلايا بيليه في 300 مرة ز لمدة ثلاث دقائق وإعادة تعليق في 0.5 ملليلتر من وسط ESC الإنسان مع 10 مثبطات الصخور الدقيقة. تصفية تعليق الخلية في أنبوب خمسة ملليلتر من خلال 35 ميكرون مصفاة الخلية الغطاء.باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلوريسنس، بوابة على الخلايا الحية وفرز الخلايا الخضراء البروتينية الإيجابية. بعد ذلك، نقل بحد أقصى 1.5 مرة 10 إلى الخلايا الأربع فرزها مباشرة إلى طبق 10 سم المغلفة مع 1-3 مصفوفة غشاء الطابق السفلي وMFs المشعة وSES الإنسان المتوسط التي تحتوي على مثبط روك. تغيير متوسط يوميا باستخدام وسيلة ESC الإنسان دون مثبطات روك.بعد 10 إلى 15 يوما، المستعمرات ما يقرب من واحد إلى اثنين ملليمتر في القطر. تحت المجهر، استخدم ماص P200 لكشط بعناية استنساخ واحد ورسم الخلايا في الماصات. تفريق الخلايا في بئر من لوحة 96-جيدا عن طريق الأنابيب بلطف ثلاث إلى أربع مرات في المتوسطة وضعت مع المستعمرة.ثم، واختيار 20 مستعمرات لكل رنا دليل والاستغناء في أنابيب الشريط PCR للفحص. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 10، 000 مرة G لمدة خمس دقائق. الآن، الكريات خلية احتضان في 20 ميكرولترات من البروتينات K العازلة لعزل الحمض النووي ودوامة بقوة.جهاز طرد مركزي في 10،000 مرة G لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بإجراء فحص PCR للحمض النووي المحرر. إضافة إلى أنابيب 20 ميكرولترات من مزيج رئيسي، بما في ذلك التمهيديات إلى الأمام وعكس، مصممة لتضخيم المنطقة ذات الاهتمام، فضلا عن خمسة ميكرولترات من هضم البروتينات K.استخدام الحمض النووي الجينومي معزولة عن خط iPSC التحكم للتأكد من أمبيركون نظيفة عند إجراء الفحص PCR. تقييم التغيرات حجم منتجات PCR بعد ساعة واحدة من الكهرباء في 70 إلى 90 فولت على 2.5٪ الوزن من قبل حجم agarose هلام. أي فرق حجم يدل على الانقسام.لtransfect الحمض النووي oligo حبلا واحد وS CRISPR-Cas9 plasmids، لوحة خط الخلية المستهدفة في طبق 6-جيدا على MEFs المشعة للوصول إلى 70 إلى 80٪ التقاء بعد أكثر من حضانة بين عشية وضحاها. إعداد رد فعل transfection كما هو موضح. اخلط رد الفعل عن طريق التنميب واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.ثم، إضافة الخليط التفاعل transfection إسقاط الحكمة إلى الخلايا. بعد 48 ساعة، قم بإعداد الخلايا لفرز الخلايا كما كان سابقاً. حوالي 10 أيام بعد طلاء الخلايا الفردية، واستخدام ماصة 200 ميكرولتر لاختيار المستعمرات في أنابيب قطاع PCR وإلى بئر من لوحة 12 جيدا المغلفة مسبقا مع الجيلاتين وMIFs.نقل 100 ميكرولترات من الخلايا إلى كل بئر من 24 أو 48 جيدا لوحة، المغلفة سابقا مع الجيلاتين وMIFs المشعة في المتوسط ESC الإنسان مع مثبط روك. استخدم الـ 100 ميكرولترات المتبقية لعزل الحمض النووي. للتحقق من التكامل الناجح للحمض النووي القلوي الخيط واحد، واتخاذ خمسة ميكرولترات من الحمض النووي معزولة عن كل مستعمرة لأداء PCR باستخدام التمهيديات الفرز المصممة سابقا.تنقية المنتجات PCR وإعداد 40 ميكرولتررس من هضم الانزيم تقييد باستخدام موقع انزيم فريدة من نوعها التي تم إنشاؤها في الحمض النووي oligo حبلا واحد. اخلط رد الفعل عن طريق الخفقان واحتضان درجة الحرارة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات. ثم، تصور المنتجات PCR هضم إضافة مع صبغة التحميل على 1.5٪ الوزن من قبل حجم ethidium بروميد agarose هلام، الكهرباء في 80 إلى 100 فولت لمدة 40 دقيقة.إذا كان التكامل الناجح للحمض النووي القلاة وحيد قد حدث، تسلسل طفرات محددة باستخدام التمهيدي متداخلة. في هذه الدراسة، للحصول على دليل RNA البناء، تم استئصال 100 قاعدة زوج الفرقة من هلام agarose 1.5٪. بعد transfection الخلية، تم تصور التحقق من صحة دليل قطع الحمض النووي الريبي باستخدام هلام agarose 2.5٪.وأظهر 180 قاعدة زوج PCR المنتج سيطرة غير المصقول والمستنسخات المختلفة مع التحولات الفرقة تشير إلى تشكيل indel. وكان دليل مختلف RNAs مختلف كفاءات القطع. لتجنب كريسبر كاس9 إعادة قص من أليلات تحريرها، تم تعديل تسلسل PAM باستخدام G إلى A الطفرة الصامتة.ولدت طفرة صامتة في تسلسل PAM موقع تقييد فريد ، مما يساعد على فحص الاندماج الناجح في واحد أو اثنين من الغيلان. ويمكن استخدام خطوط الخلايا الجذعية المحررة من الجينوم في تمايزات المصب والاختزال الوظيفي لدراسة تأثير طفرة معينة على التنمية البشرية والمرض. تسمح هذه المنهجية بتوليد خطوط خلايا ايزوجينية مع طفرات غير مغايرة أو طفرات هُمازيغو، متورطة في مجموعة واسعة من الأمراض البشرية.هذه النماذج المرض تمهد الطريق لتطوير علاجات الخلوية الجديدة، فضلا عن منصات العرض لاكتشاف المخدرات.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

باستخدام تقنية PCR-نيون الشعرية جل الكهربائي إلى التركيب الوراثي كريسبر / Cas9 بوساطة خروج المغلوب المسوخ في تنسيق عالية الإنتاجية

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

جيل يعتمد على الاختيار ومستقل من كريسبر / كاس 9 بوساطة جين نوكوتس في خلايا الثدييات

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

زرع الخلايا البدائية كريسبر/Cas9-تعتمد قفزات واسعة في النمو

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

إيمونوستينينج لإدخال تعديلات على الحمض النووي: التحليل الحسابي للصور [كنفوكل]

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

كريسبر/Cas9-بوساطة التكامل المستهدفة في فيفو استخدام استراتيجية تستند إلى الانضمام إلى التماثل بوساطة نهاية

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

السريع وخط أنابيب سهلة "توليد طفرات نقطة الجينوم" في C. ايليجانس باستخدام كريسبر/Cas9 "ريبونوكليوبروتينس"

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

"جعل طفرات مشروطة طفيل الملاريا البشرية" المنجلية "تحرير الجينات" كريسبر/Cas9

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

البروتين الذاتية في الإنسان التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent باستخدام كريسبر/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

منهاج متجه لينتيفيرال الكفاءة في تقديم أدوات تحرير ابيجينومي إلى الإنسان الناجمة عن نماذج المرض المستمدة من الخلايا الجذعية Pluripotent

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...