Name: generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af midler fra National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), nationale institutter for sundhed gennem Grants U01HL099656 (P.G. og D.L.F.) og U01HL134696 (P.G. og D.L.F.).

1. design og konstruktion af guide RNA (gRNA)
Bemærk: hver gRNA består af 2 60 base pair (BP) oligonukleotider, der er udglødet til at generere en 100 BP dobbelt strandede (DS) oligonukleogentid (figur 1a-C). Tidslinjen for gRNA design, generation og testskæring effektivitet er ca 2 uger (figur 2).
<ol><li>Vælg den DNA-region af interesse at være genomredigeret og identificere 3-4 23 BP sekvenser, der passer t...

<ol>
	<li>Srivastava, D., Dewitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+In+Vivo+Cellular+Reprogramming:+The+Next+Generation.">Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation.</a> Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Review Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Embryonic+Stem+Cells+to+Relevant+Populations:+Lessons+from+Embryonic+Development.">Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 1-6 (2018).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Tiyaboonchai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA6+Plays+an+Important+Role+in+the+Induction+of+Human+Definitive+Endoderm,+Development+of+the+Pancreas,+and+Functionality+of+Pancreatic+&#946;+Cells.">GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic &#946; Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+hESCs+to+Probe+the+Interaction+of+the+Diabetes-Associated+Genes+CDKAL1+and+MT1E.">Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E.</a> Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Isogenic+Human+ESC+Platform+for+Functional+Evaluation+of+Genome-wide-Association-Study-Identified+Diabetes+Genes+and+Drug+Discovery.">An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+with+zinc+finger+nucleases+for+cellular+imaging.">Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging.</a> Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).</li><li>Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Modification+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Homologous+Recombination+and+CRISPR/Cas9+System.">Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System.</a> Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+gene-corrected+adult+beta+globin+protein+in+human+erythrocytes+differentiated+from+patient+iPSCs+after+genome+editing+of+the+sickle+point+mutation.">Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors.">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).</li><li>Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Doxycycline-Inducible+System+for+Genetic+Correction+of+iPSC+Disease+Models.">A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li><li>Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+human+stem+cells.">Genome editing in human stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).</li><li>Zhu, Z., Gonz&#225;lez, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis.">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li><li>Cong, L., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).</li><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+homology+directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA.">Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li><li>Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+crispr+cas9-mediated+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).</li></ol>

I denne protokol, brugen af CRISPR-CAS9 sammen med to ssODN reparation skabeloner til at generere specifikke heterozygot eller homozygot genom ændringer er påvist i humane pluripotente stamceller. Denne metode resulterede i en vellykket generation af isogene cellelinjer, som udtrykker heterozygot genomiske forandringer med en virkningsgrad tæt på 10%. Denne protokol er blevet optimeret til både humane Esc'er og iPSCs dyrket på bestrålede Mef'er, som understøtter cellevækst og overlevelse efter dyrkning af celler...

Humane embryonale stamceller (hESCs) og inducerede pluripotente stamceller (ipscs) er værdifulde værktøjer til modellering af sygdomme hos mennesker på grund af deres evne til fornyelse, samtidig med at evnen til at generere celletyper af forskellige nedstamningens1,2 ,3,4. Disse modeller åbner mulighed for at afhøre gen funktion, og forstå, hvordan specifikke mutationer og fænotyper er relateret til forskellige sygdomme5,6. Men for at forstå, hvordan en specifik ændring er knyttet til en bestemt fænotype, er brugen af en parret isogene kontrol og mutant cellelinjer vigtigt at kontrollere for linje til linje variation7,8. Transskription aktivator-lignende Effector nucleaser (TALENs) og zink finger nucleaser er blevet brugt til at generere indsættelse eller sletning (indels) mutationer i forskellige genetiske modeller, herunder primære celler; men disse nukleaser kan være besværlige at bruge og dyre9,10,11,12,13,14. Opdagelsen af grupperet regelmæssigt hinanden korte palindromiske REPEAT (crispr)-CAS9 nuclease har revolutioneret feltet på grund af effektivitet i Indel dannelse i stort set alle områder af genomet, enkelhed i brug, og reduktion i omkostninger15 , 16 , 17 , 18 , 19.
En udfordring i at bruge CRISPR-CAS9 baseret genomredigerings teknologi har været generering eller korrektion af specifikke mutationer i en allel uden at skabe en indelmutation i den anden allel20. Det vigtigste mål med denne protokol er at overvinde denne udfordring ved at bruge to enkelt-strenget oligonucleotid (ssODN) reparations skabeloner til at reducere Indel dannelse i den anden allel. Begge ssODNs er designet til at indeholde tavse mutationer for at forhindre re-skæring af CAS9 nuclease, men kun én indeholder ændringen af interesse. Denne metode øger effektiviteten af at generere en specifik heterozygot genetisk modifikation uden inducerende Indel dannelse i den anden allel. Ved hjælp af denne protokol viser genredigerende eksperimenter på seks uafhængige genomiske steder den præcise indførelse af den ønskede genomiske ændring i en allel uden indels dannelse i den anden allel og forekommer med en samlet effektivitet på ~ 10%. Den beskrevne protokol er blevet tilpasset fra Maguire et al.21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="705">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap</td>
			<td style="width:145px;">Corning</td>
			<td style="width:124px;">352235</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well polystyrene tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AflII restriction endonuclease</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:124px;">R0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:124px;">N605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">dNTPs</td>
			<td style="width:145px;">Roche</td>
			<td style="width:124px;">11969064001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibson Assembly Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gRNA_Cloning Vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:124px;">41824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar plates containing 50 &#956;g/ml kanamycin</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine Stem Reagent</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">(STEM00001)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine embryonic fibroblasts (MEFs)</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:124px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital shaking incubator</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">pCas9_GFP vector</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:124px;">44719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR strip tubes</td>
			<td style="width:145px;">USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5&#215; Phusion buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:124px;">K210011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:124px;">Qiagen 19133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td style="width:124px;">636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC medium</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9020S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td style="width:124px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells

Humane pluripotente stamceller tilbyder et stærkt system til at studere genfunktion og modelspecifikke mutationer, der er relevante for sygdom. Dannelsen af præcise heterozygot genetiske modifikationer er udfordrende på grund af CRISPR-CAS9 medieret Indel dannelse i den anden alleler. Her demonstrerer vi en protokol for at hjælpe med at overvinde dette problem ved at bruge to reparations skabeloner, hvor kun én udtrykker den ønskede sekvens ændring, mens begge skabeloner indeholder tavse mutationer for at forhindre re-skæring og Indel dannelse. Denne metode er mest fordelagtig for genredigering kodning regioner af DNA til at generere isogene kontrol og mutant menneskelige stamceller linjer til at studere sygdomme hos mennesker og biologi. Derudover er optimering af transfektering og screeningmetoder blevet udført for at reducere arbejdskraft og omkostninger ved et genredigerings eksperiment. Samlet set denne protokol er almindeligt gældende for mange genomredigering projekter udnytte den menneskelige pluripotente stamcelle model.

Generation af gRNAs og screening for indels
Hver gRNA vil blive klonet ind i en plasmid vektor og udtrykkes ved hjælp af U6 promotoren. AflII -begrænsnings enzymet bruges til at linearisere plasmid (addgene #41824) og er placeret efter U6-arrangøren. 100 BP-båndet genereret efter Udglødning af 2 60 BP oligonukleotider er klonet ind i grna Expression vektor ved hjælp af DNA-samlingen. Når grna plasmider genereres, de er transficeret i hESCs eller ipscs sammen me...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Denne protokol giver en metode til at lette genereringen af definerede heterozygot eller homozygot nukleotid ændringer ved hjælp af CRISPR-CAS9 i humane pluripotente stamceller.

Generation af definerede genomiske modifikationer med CRISPR-CAS9 i humane pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Studiet af genfunktion og sygdom hæmmes af den udavlede karakter af den menneskelige befolkning. De forskellige genetiske baggrunde af patientspecifikke og kontrol iPS-cellelinjer kan påvirke differentieringseffektivitet og fænotyper, der findes i en given funktionel analyse. Anvendelse af genetisk identiske eller isogene linjer, hvor den eneste forskel er den særlige mutation af interesse er afgørende for at overvinde disse spørgsmål.Mange sygdomme hos mennesker er forårsaget af heterozygode mutationer, som kan være svære at generere med CRISPR-Cas9-systemet. Dette skyldes generering af indel mutationer i den ikke-målrettede allel, der kan forekomme ved meget høj frekvens. Vores teknik overvinder dette problem ved hjælp af to reparation skabeloner, hvoraf kun én havne mutation af interesse.Enhver efterforsker forsøger denne teknik bør være dygtige til menneskelige pluripotent stamcellekultur. Videoen demonstration af koloni plukning vil være nyttigt at vise korrekt størrelse og morfologi samt teknik, der anvendes til plukning og screening. Demonstration af denne procedure vil være Leo Cardenas.Til at begynde, plade menneskelige ESC'er på bestrålet MEFs i en 6-brønd plade. Forbered transfektion master mix. Bland ved pipettering og inkubering ved stuetemperatur i 15 minutter.Når cellerne når 70 til 80% sammenløb, derefter tilføje transfektion master mix dråbe klogt til hver brønd med celler og inkubere ved 37 grader Celsius i 48 timer. Skift medie hvert 24. For at høste cellerne, først, inkubere cellerne med Triple E i tre minutter ved stuetemperatur for at fjerne MEFs enzymatisk.Tilsæt 0,5 milliliter HESC-medium med 10 micromolar ROCK-hæmmer. Pelletceller ved 300 gange g i tre minutter og re-suspension i 0,5 milliliter humant ESC medium med 10 mikromolar ROCK-hæmmer. Cellerefjedringen filtreres i et fem milliliterrør gennem en 35 mikrocellestænhætte.Brug fluorescens-aktiveret cellesortering, gate på levende celler og sortere de grønne fluorescerende protein-positive celler. Dernæst overføres maksimalt 1,5 gange 10 til de fire sorterede celler direkte ind i en 10 centimeter skål belagt med en til tre kældermembranmatrix og bestrålede MEF'er og humant ESC-medium, der indeholder ROCK-hæmmer. Skift dagligt medium ved hjælp af det menneskelige ESC-medie uden ROCK-hæmmer.Efter 10 til 15 dage, kolonier er cirka en til to millimeter i diameter. Under et mikroskop skal du bruge en P200-pipette til forsigtigt at skrabe en enkelt klon og trække celler ind i pipetten. Spred cellerne i en brønd af en 96-brønd plade ved forsigtigt pipettering tre til fire gange i mediet udarbejdet med kolonien.Vælg derefter 20 kolonier for hver guide RNA og dispenseres i PCR striprør til screening. Pellet cellerne ved centrifugering ved 10,000 gange G i fem minutter. Nu inkubere celle pellets i 20 mikroliter af Proteinase K buffer til at isolere DNA og vortex kraftigt.Centrifuge ved 10.000 gange G i fem minutter. Dernæst udføre screening PCR af den redigerede DNA. Tilføj i rørene 20 mikroliter af en master mix, herunder frem og tilbage primere, designet til at forstærke regionen af interesse, samt fem mikroliter af Proteinase K fordøje.Brug genomisk DNA isoleret fra kontrol iPSC linje for at bekræfte en ren amplicon, når du udfører screening PCR. Vurder størrelsesændringer af PCR-produkter efter en times elektroforese ved 70 til 90 volt på en 2,5% vægt efter volumen agarosegel. Enhver størrelse forskel er tegn på spaltning.At transfect enkelt streng oligo DNA og CRISPR-Cas9 plasmider, plade målet cellelinje i en 6-brønd fad på bestrålede MEF'er at nå 70 til 80% sammenløb efter over en overnatning inkubation. Opsæt transfektionsreaktionen som beskrevet. Reaktionen blandes ved pipettering og inkubering i 15 minutter ved stuetemperatur.Derefter tilsættes transfektion reaktion blandingen falde klogt til cellerne. Efter 48 timer forberedes cellerne til cellesortering som tidligere. Omkring 10 dage efter plating enkelte celler, bruge en 200 mikroliter pipette til at plukke kolonier i PCR striprør og ind i en brønd af en 12-brønd plade forbelagt med gelatine og MEFs.Cellernes 100 mikroliter overføres til hver brønd af en 24- eller 48-brøndplade, der tidligere var belagt med gelatine og bestrålede MEF'er i humant ESC-medium med ROCK-hæmmer. Brug de resterende 100 mikroliter til DNA-isolering. For at kontrollere for en vellykket integration af enkelt streng oligo DNA, tage fem mikroliter af DNA isoleret fra hver koloni til at udføre PCR ved hjælp af screening primere tidligere designet.Rengør PCR-produkterne og forbered de 40 mikroliter af begrænsningenzymfordøjelse ved hjælp af det unikke enzymsted, der er skabt i det enkelte oligo-DNA i strengen. Reaktionen blandes ved at pipettere og inkubere ved producentens anbefalede temperatur i en til tre timer. Derefter visualisere de fordøjede PCR produkter tilsat med en lastning farvestof på en 1,5% vægt i volumen ethidium bromid agarose gel, elektrofokroser ved 80 til 100 volt i 40 minutter.Hvis en vellykket integration af den enkelte streng oligo DNA har fundet sted, sekvens specifikke mutationer ved hjælp af en indlejret primer. I denne undersøgelse, for guide RNA konstruktion, en 100 base par band blev fjernet fra en 1,5% agarose gel. Efter celletransfektion blev validering af guide RNA-skæring visualiseret ved hjælp af en 2,5% agarosegel.Et 180 basispar PCR-produkt viste en uklippet kontrol og forskellige kloner med båndskift, der indikerer uddel dannelse. Forskellige guide RNA'er havde forskellige skæreeffektivitet. For at undgå CRISPR-Cas9 re-skæring af de redigerede alleler, PAM sekvens blev ændret ved hjælp af en G til A tavs mutation.En tavs mutation i PAM-sekvensen genererede et unikt begrænsningssted, som hjælper med at screene for vellykket integration i en eller to alleler. Genom redigerede stamcellelinjer kan anvendes i downstream differentiering og funktionelle analyser til at undersøge effekten af en given mutation på menneskelig udvikling og sygdom. Denne metode tillader generering af isogene cellelinjer med en specifik heterozygot eller homozygot mutationer, impliceret i en bred vifte af sygdomme hos mennesker.Disse sygdomsmodeller baner vejen for udviklingen af nye cellulære behandlingsformer samt tilbyde platforme for opdagelse af lægemidler.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Under anvendelse af et fluorescerende PCR-kapillær gelelektroforese Teknik til genotype CRISPR / Cas9-medieret Knockout Mutanter i et format med høj kapacitet

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Udvælgelsesafhængig og uafhængig generering af CRISPR / Cas9-medierede Gene Knockouts i Pattedyrceller

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordiale kønsceller Transplantation til CRISPR/Cas9-baserede kvantespring i Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunfarvning for DNA ændringer: beregningsmæssige analyse af Konfokal billeder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-medieret målrettede Integration In Vivo ved hjælp af en homologi-medieret End at deltage-baseret strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Højeffektive gen afbrydelse af Murine og menneskelige hæmatopoietisk stamceller ved CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

En hurtig og letkøbt Pipeline for generering af genomisk punkt mutanter i C. elegans bruger CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen redigering at gøre betinget mutanter af menneskelige Malaria parasitten, P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein Tagging i menneskelige induceret pluripotente stamceller ved hjælp af CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Lentiviral vektor Platform for effektiv levering af Epigenome-redigeringsværktøjer i menneskelige induceret pluripotente stamceller-afledt sygdomsmodeller

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...