Name: generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Dit onderzoek werd gesteund door de financiering van het nationaal hart, het Long-en het bloed Instituut (NHLBI), de National Institutes of Health via subsidies U01HL099656 (P.G. en D.L.F.) en U01HL134696 (P.G. en D.L.F.).

1. ontwerp en constructie van gids RNA (gRNA)
Opmerking: elke gRNA bestaat uit 2 60 base pair (BP) oligonucleotiden die zijn gegloeid om een 100 BP dubbel strandde (DS) oligonucleotide (Figuur 1a-C) te genereren. De tijdlijn voor gRNA ontwerp, generatie en testen snijefficiëntie is ongeveer 2 weken (Figuur 2).
<ol><li>Selecteer het DNA-gebied van belang om genoom te worden bewerkt en Identificeer 3-4 23 BP-sequenti...

<ol>
	<li>Srivastava, D., Dewitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+In+Vivo+Cellular+Reprogramming:+The+Next+Generation.">Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation.</a> Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Review Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Embryonic+Stem+Cells+to+Relevant+Populations:+Lessons+from+Embryonic+Development.">Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 1-6 (2018).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Tiyaboonchai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA6+Plays+an+Important+Role+in+the+Induction+of+Human+Definitive+Endoderm,+Development+of+the+Pancreas,+and+Functionality+of+Pancreatic+&#946;+Cells.">GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic &#946; Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+hESCs+to+Probe+the+Interaction+of+the+Diabetes-Associated+Genes+CDKAL1+and+MT1E.">Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E.</a> Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Isogenic+Human+ESC+Platform+for+Functional+Evaluation+of+Genome-wide-Association-Study-Identified+Diabetes+Genes+and+Drug+Discovery.">An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+with+zinc+finger+nucleases+for+cellular+imaging.">Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging.</a> Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).</li><li>Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Modification+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Homologous+Recombination+and+CRISPR/Cas9+System.">Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System.</a> Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+gene-corrected+adult+beta+globin+protein+in+human+erythrocytes+differentiated+from+patient+iPSCs+after+genome+editing+of+the+sickle+point+mutation.">Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors.">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).</li><li>Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Doxycycline-Inducible+System+for+Genetic+Correction+of+iPSC+Disease+Models.">A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li><li>Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+human+stem+cells.">Genome editing in human stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).</li><li>Zhu, Z., Gonz&#225;lez, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis.">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li><li>Cong, L., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).</li><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+homology+directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA.">Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li><li>Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+crispr+cas9-mediated+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).</li></ol>

In dit protocol wordt het gebruik van CRISPR CAS9 samen met twee ssODN-reparatie sjablonen voor het genereren van specifieke heterozygoot-of homozygoot-genoom veranderingen aangetoond in menselijke pluripotente stamcellen. Deze methode resulteerde in de succesvolle generatie van isogene cellijnen die heterozygoot genomische veranderingen uitdrukken met een efficiëntie dicht bij 10%. Dit protocol is geoptimaliseerd voor zowel menselijke Esc's en iPSCs geteeld op bestraalde Mef's die celgroei en overleving ondersteunen na...

Menselijke embryonale stamcellen (hescs) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (ipscs) zijn waardevolle hulpmiddelen voor het modelleren van menselijke ziekten als gevolg van hun vernieuwings capaciteit, met behoud van de mogelijkheid om celtypen van verschillende lijn afstanden te genereren1,2 ,3,4. Deze modellen openen de mogelijkheid om de genfunctie te interromen en te begrijpen hoe specifieke mutaties en fenotypes gerelateerd zijn aan verschillende ziekten5,6. Echter, om te begrijpen hoe een specifieke wijziging is gekoppeld aan een bepaald fenotype, is het gebruik van een gepaarde isogene controle en Mutante cellijnen belangrijk om te controleren op lijn tot lijn variabiliteit7,8. Transcriptie Activator-achtige Effector nucleasen (TALENs) en zink vinger nucleasen zijn gebruikt voor het genereren van inbrengen of verwijderen (indels) mutaties in diverse genetische modellen, met inbegrip van primaire cellen; maar deze nucleasen kunnen omslachtig te gebruiken en duur9,10,11,12,13,14. De ontdekking van de geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalings (CRISPR)-CAS9 Nuclease heeft het veld veranderd als gevolg van efficiëntie in Indel-vorming in vrijwel elke regio van het genoom, eenvoud van gebruik en reductie in kosten15 , 16 , 17 , 18 , 19.
Een uitdaging bij het gebruik van de op crispr CAS9 gebaseerde genoom Editing-technologie is het genereren of corrigeren van specifieke mutaties in één allel zonder een Indel-mutatie te creëren in het tweede allel20. Het belangrijkste doel van dit protocol is om deze uitdaging te overwinnen door gebruik te maken van twee enkel-streng oligonucleotide (ssODN) reparatie templates om Indel vorming in het tweede allel te verminderen. Beide ssODNs zijn ontworpen om stille mutaties te bevatten om hersnijden door de CAS9 Nuclease te voorkomen, maar slechts één bevat de verandering van belang. Deze methode verhoogt de efficiëntie van het genereren van een specifieke heterozygoot genetische modificatie zonder het induceren van Indel vorming in het tweede allel. Met behulp van dit protocol tonen genbewerkingsexperimenten in zes onafhankelijke genomische locaties de precieze introductie van de gewenste genomische verandering in één allel zonder Indel-vorming in het tweede allel en treedt op met een totale efficiëntie van ~ 10%. Het beschreven protocol is aangepast van Maguire et al.21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="705">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap</td>
			<td style="width:145px;">Corning</td>
			<td style="width:124px;">352235</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well polystyrene tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AflII restriction endonuclease</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:124px;">R0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:124px;">N605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">dNTPs</td>
			<td style="width:145px;">Roche</td>
			<td style="width:124px;">11969064001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibson Assembly Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gRNA_Cloning Vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:124px;">41824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar plates containing 50 &#956;g/ml kanamycin</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine Stem Reagent</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">(STEM00001)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine embryonic fibroblasts (MEFs)</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:124px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital shaking incubator</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">pCas9_GFP vector</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:124px;">44719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR strip tubes</td>
			<td style="width:145px;">USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5&#215; Phusion buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:124px;">K210011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:124px;">Qiagen 19133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td style="width:124px;">636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC medium</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9020S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td style="width:124px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells

Menselijke pluripotente stamcellen bieden een krachtig systeem om de genfunctie te bestuderen en specifieke mutaties te modelleren die relevant zijn voor de ziekte. Het genereren van precieze heterozygoot genetische modificaties is uitdagend als gevolg van CRISPR CAS9 gemedieerde Indel vorming in het tweede allel. Hier demonstreren we een protocol om deze moeilijkheid te helpen overwinnen door twee reparatie sjablonen te gebruiken waarin slechts één de gewenste sequentie wijziging tot uitdrukking brengt, terwijl beide templates stille mutaties bevatten om hersnijden en Indel vorming te voorkomen. Deze methodologie is het meest voordelig voor genbewerkings coderings gebieden van DNA om isogene controle en Mutant menselijke stamcellijnen te genereren voor het bestuderen van menselijke ziekten en biologie. Daarnaast is optimalisatie van transfectie-en screenings methodieken uitgevoerd om de arbeid en de kosten van een genbewerkingsexperiment te verminderen. Over het algemeen is dit protocol algemeen toepasbaar op vele genoom bewerkings projecten met gebruikmaking van het menselijke pluripotente stamcel model.

Generatie gRNAs en screening voor indels
Elke gRNA wordt gekloond in een plasmide vector en uitgedrukt met de promotor U6. Het AFLII restrictie-enzym wordt gebruikt voor het linealiseren van het plasmide (addgene #41824) en bevindt zich na de promotor U6. De 100 BP-band gegenereerd na het gloeien van de 2 60 BP oligos wordt gekloond in de gRNA expressie vector met behulp van de DNA-verzameling. Zodra de gRNA plasmiden worden gegenereerd, worden ze omgezet in hESCs of ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Dit protocol biedt een methode om het genereren van gedefinieerde heterozygoot of homozygoot nucleotide veranderingen te vergemakkelijken met behulp van CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen.

Generatie van gedefinieerde genomische modificaties met CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

De studie van genfunctie en ziekte wordt belemmerd door de outbred aard van de menselijke bevolking. De verschillende genetische achtergronden van patiëntspecifieke en controle-iPS-cellijnen kunnen de differentiatie-efficiëntie en fenotypes in een bepaalde functionele test beïnvloeden. Gebruik van genetisch identieke of isogene lijnen waarbij het enige verschil is dat de specifieke mutatie van belang van cruciaal belang is om deze problemen te overwinnen.Veel menselijke ziekten worden veroorzaakt door heterozygootmutaties, die moeilijk te genereren zijn met het CRISPR-Cas9-systeem. Dit is te wijten aan de generatie van indel mutaties in het niet-gerichte allel dat kan optreden bij zeer hoge frequentie. Onze techniek overwint dit probleem door gebruik te maken van twee reparatiesjablonen waarvan er slechts één de mutatie van belang koestert.Elke onderzoeker probeert deze techniek moet worden bedreven in de menselijke pluripotente stamcelcultuur. De video demonstratie van kolonie plukken zal nuttig zijn om de juiste grootte en morfologie te tonen, evenals de techniek die wordt gebruikt voor het plukken en screening. Het demonstreren van deze procedure zal Leo Cardenas zijn.Om te beginnen, plaat menselijke ESCs op bestraalde MEF's in een 6-put plaat. Bereid de transfectie master mix. Meng door pipetting en incubeer op kamertemperatuur gedurende 15 minuten.Wanneer de cellen bereiken 70 tot 80%samenvloeiing, voeg dan de transfectie master mix drop verstandig om elke put met cellen en uitbroeden op 37 graden Celsius gedurende 48 uur. Verander de media om de 24 uur. Om de cellen te oogsten, broedt eerst de cellen met Triple E gedurende drie minuten bij kamertemperatuur om MEF's enzymatisch te verwijderen.Voeg 0,5 milliliter HESC medium toe met 10 micromolar ROCK remmer. Pelletcellen op 300 keer g gedurende drie minuten en opnieuw op te schorten in 0,5 milliliter menselijk ESC-medium met 10 micromolar ROCK-remmer. Filter de celsuspensie in een buis van vijf milliliter door een 35 micron cel zeefdop.Met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsorde, poort op levende cellen en sorteren van de groene fluorescerende eiwit-positieve cellen. Breng vervolgens maximaal 1,5 keer 10 over naar de vier gesorteerde cellen rechtstreeks in een schaal van 10 centimeter bedekt met één tot drie keldermembraanmatrix en bestraalde MEF's en menselijk ESC-medium met ROCK-remmer. Verander medium dagelijks met behulp van de menselijke ESC medium zonder ROCK remmer.Na 10 tot 15 dagen, kolonies zijn ongeveer een tot twee millimeter in diameter. Gebruik onder een microscoop een P200 pipet om een enkele kloon zorgvuldig te schrapen en cellen in de pipet te trekken. Verspreid de cellen in een put van een 96-put plaat door zachtjes drie tot vier keer pipetten in het medium opgesteld met de kolonie.Kies vervolgens 20 kolonies voor elke gids RNA en afzien in PCR strip buizen voor screening. Pellet de cellen door centrifugatie op 10.000 keer G gedurende vijf minuten. Nu, incubeercelpellets in 20 microliter van Proteinase K buffer om DNA en vortex krachtig te isoleren.Centrifuge op 10.000 keer G gedurende vijf minuten. Voer vervolgens screening PCR van het bewerkte DNA uit. Voeg in de buizen 20 microliters van een master mix, met inbegrip van voorwaartse en omgekeerde primers, ontworpen om het gebied van belang te versterken, evenals vijf microliters van de Proteinase K digest.Gebruik genomisch DNA geïsoleerd van de controle iPSC lijn om een schone amplicon te bevestigen bij het uitvoeren van de screening PCR. Evalueer grootteveranderingen van PCR-producten na een uur elektroforese bij 70 tot 90 volt op een volume van 2,5% agarose gel. Elk verschil in grootte is indicatief voor decolleté.Om de single streng oligo DNA en de CRISPR-Cas9 plasmiden transfecteren, plaat de doelcel lijn in een 6-well schotel op bestraalde MEF's te bereiken 70 tot 80%samenvloeiing na meer dan een nachtelijke incubatie. Stel de transfectiereactie in zoals beschreven. Meng de reactie door pipetting en incubeer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.Voeg vervolgens de transfectiereactie mengsel drop verstandig aan de cellen. Bereid de cellen na 48 uur voor op celsordening zoals voorheen. Ongeveer 10 dagen na het plating van enkele cellen, gebruik maken van een 200 microliter pipet om kolonies te halen in PCR strip buizen en in een put van een 12-well plaat voorgecoat met gelatine en MEFs.Breng 100 microliter van de cellen over naar elke put van een 24- of 48-putplaat, die eerder is bekleed met gelatine en bestraalde MEF's in menselijk ESC-medium met ROCK-remmer. Gebruik de resterende 100 microliter voor DNA-isolatie. Om te controleren op succesvolle integratie van de single streng oligo DNA, neem vijf microliter van DNA geïsoleerd van elke kolonie om PCR uit te voeren met behulp van de screening primers eerder ontworpen.Zuiveren van de PCR-producten en bereid de 40 microliters van beperking enzym spijsvertering met behulp van de unieke enzym site gemaakt in de single streng oligo DNA. Meng de reactie door pipetting en incubbateren op de aanbevolen temperatuur van de fabrikant gedurende een tot drie uur. Visualiseer vervolgens de verteerde PCR-producten die worden toegevoegd met een ladingskleurstof met een volume van 1,5% ethidium bromide agarosegel, elektroforens op 80 tot 100 volt gedurende 40 minuten.Als succesvolle integratie van de single streng oligo DNA heeft plaatsgevonden, sequentie specifieke mutaties met behulp van een geneste primer. In deze studie, voor gids RNA bouw, een 100 base paar band werd verwijderd uit een 1,5%agarose gel. Na celtransfectie werd de validatie van het snijden van gids RNA gevisualiseerd met behulp van een 2,5%agarose gel.Een 180 base pair PCR product toonde een onbesneden controle en verschillende klonen met bandverschuivingen die indelvorming aangeven. Verschillende gids RNAs had verschillende snijden efficiëntie. Om te voorkomen dat CRISPR-Cas9 de bewerkte allelen opnieuw snijdt, werd de PAM-sequentie gewijzigd met behulp van een G tot A stille mutatie.Een stille mutatie in de PAM-sequentie genereerde een unieke beperkingsplaats, die helpt om te screenen op succesvolle integratie in een of twee allelen. Genoom bewerkte stamcellijnen kunnen worden gebruikt in downstream differentiaties en functionele tests om het effect van een bepaalde mutatie op de menselijke ontwikkeling en ziekte te bestuderen. Deze methodologie maakt het mogelijk om isogene cellijnen te genereren met een specifieke heterozygoot of homozygoot mutaties, die betrokken zijn bij een breed scala aan menselijke ziekten.Deze ziektemodellen maken de weg vrij voor de ontwikkeling van nieuwe cellulaire therapieën en bieden platforms voor het ontdekken van geneesmiddelen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Gebruikmaking van een fluorescentie PCR-capillaire gelelektroforese techniek voor CRISPR Genotype / Cas9-gemedieerde knockout mutanten in een High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selectieafhankelijke en onafhankelijke generatie van CRISPR / Cas9-gemedieerde Gene Knockouts in zoogdiercellen

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordiale geslachtscellen transplantatie voor CRISPR/Cas9 gebaseerde sprongen in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunokleuring voor DNA wijzigingen: computationele analyse van Confocal beelden

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-gemedieerde gerichte integratie In Vivo met behulp van een homologie-gemedieerde einde deelname aan gebaseerde strategie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene bewerken te maken voorwaardelijke mutanten van menselijke malariaparasiet P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene eiwit Tagging in mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Lentivirale Vector Platform voor de efficiënte levering van Epigenome-bewerkingsgereedschap in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ziekte modellen

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...