Name: generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Diese Forschung wurde durch Fördermittel des National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), National Institutes of Health durch Die Stipendien U01HL099656 (P.G. und D.L.F.) und U01HL134696 (P.G. und D.L.F.) unterstützt.

1. Entwurf und Konstruktion von Guide RNA (gRNA)
HINWEIS: Jede gRNA besteht aus zwei 60 Basenpaar (bp) Oligonukleotiden, die geglüht werden, um ein 100 bp Doppelsträngiges (ds) Oligonukleotid zu erzeugen (Abbildung 1A-C). Der Zeitplan für die Effizienz des gRNA-Designs, der Erzeugung und des Testens beträgt ca. 2 Wochen (Abbildung 2).
<ol><li>Wählen Sie den DNA-Bereich aus, der für das Genom von Interesse ist,...

<ol>
	<li>Srivastava, D., Dewitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+In+Vivo+Cellular+Reprogramming:+The+Next+Generation.">Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation.</a> Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Review Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Murry, C. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 1-6 (2018).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Tiyaboonchai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA6+Plays+an+Important+Role+in+the+Induction+of+Human+Definitive+Endoderm,+Development+of+the+Pancreas,+and+Functionality+of+Pancreatic+&#946;+Cells.">GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic &#946; Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+hESCs+to+Probe+the+Interaction+of+the+Diabetes-Associated+Genes+CDKAL1+and+MT1E.">Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E.</a> Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Isogenic+Human+ESC+Platform+for+Functional+Evaluation+of+Genome-wide-Association-Study-Identified+Diabetes+Genes+and+Drug+Discovery.">An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+with+zinc+finger+nucleases+for+cellular+imaging.">Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging.</a> Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).</li><li>Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Modification+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Homologous+Recombination+and+CRISPR/Cas9+System.">Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System.</a> Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+gene-corrected+adult+beta+globin+protein+in+human+erythrocytes+differentiated+from+patient+iPSCs+after+genome+editing+of+the+sickle+point+mutation.">Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors.">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).</li><li>Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Doxycycline-Inducible+System+for+Genetic+Correction+of+iPSC+Disease+Models.">A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li><li>Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+human+stem+cells.">Genome editing in human stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).</li><li>Zhu, Z., Gonz&#225;lez, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis.">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li><li>Cong, L., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).</li><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+homology+directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA.">Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li><li>Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+crispr+cas9-mediated+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).</li></ol>

In diesem Protokoll wird die Verwendung von CRISPR-CAS9 zusammen mit zwei ssODN-Reparaturvorlagen zur Erzeugung spezifischer heterozygoter oder homozygoter Genomveränderungen in menschlichen pluripotenten Stammzellen nachgewiesen. Diese Methode führte zur erfolgreichen Erzeugung isogener Zelllinien, die heterozygote genomische Veränderungen mit einer Effizienz von fast 10 % exdrücken. Dieses Protokoll wurde sowohl für menschliche ESCs als auch für iPSCs optimiert, die auf bestrahlten MEFs angebaut werden, die das Z...

Menschliche embryonale Stammzellen (hESCs) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) sind wertvolle Werkzeuge zur Modellierung menschlicher Krankheiten aufgrund ihrer Fähigkeit zur Erneuerung, wobei die Fähigkeit zur Erzeugung von Zelltypen verschiedener Abstammungen beibehalten wird1,2 ,3,4. Diese Modelle eröffnen die Möglichkeit, die Genfunktion zu befragen und zu verstehen, wie spezifische Mutationen und Phänotypen mit verschiedenen Krankheiten zusammenhängen5,6. Um jedoch zu verstehen, wie eine bestimmte Veränderung mit einem bestimmten Phänotyp verbunden ist, ist die Verwendung einer gepaarten isogenen Kontrolle und mutierter Zelllinien wichtig, um die Linien-zu-Linienvariabilität7,8zu steuern. Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen (TALENs) und Zinkfingernukleasen wurden verwendet, um Insertions- oder Deletionsmutationen (Indels) in verschiedenen genetischen Modellen, einschließlich Primärzellen, zu erzeugen; aber diese Nukleasen können umständlich zu bedienen und teuersein 9,10,11,12,13,14. Die Entdeckung der gruppierten regelmäßig interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-CAS9 Nuklease hat das Feld aufgrund der Effizienz in der Indelbildung in praktisch jeder Region des Genoms, der Einfachheit der Anwendung und der Senkung der Kosten revolutioniert15 , 16 , 17 , 18 , 19.
Eine Herausforderung bei der Verwendung der CRISPR-CAS9-basierten Genom-Editing-Technologie war die Erzeugung oder Korrektur spezifischer Mutationen in einem Allel, ohne eine Indelmutation im zweiten Allel20zu erzeugen. Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, diese Herausforderung zu überwinden, indem zwei einsträngige Oligonukleotid (ssODN) Reparaturvorlagen verwendet werden, um die Indelbildung im zweiten Allel zu reduzieren. Beide ssODNs sind so konzipiert, dass sie stille Mutationen enthalten, um ein erneutes Schneiden durch die CAS9-Nuklease zu verhindern, aber nur eine enthält die Veränderung des Interesses. Diese Methode erhöht die Effizienz der Erzeugung einer spezifischen heterozygoten genetischen Veränderung, ohne induzieren Indelbildung im zweiten Allel. Anhand dieses Protokolls zeigen Gen-Editing-Experimente an sechs unabhängigen genomischen Standorten die genaue Einführung der gewünschten genomischen Veränderung in einem Allel ohne Indelbildung im zweiten Allel und treten mit einer Gesamteffizienz von 10 % auf. Das beschriebene Protokoll wurde von Maguire et al.21angepasst.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="705">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap</td>
			<td style="width:145px;">Corning</td>
			<td style="width:124px;">352235</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well polystyrene tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AflII restriction endonuclease</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:124px;">R0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:124px;">N605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">dNTPs</td>
			<td style="width:145px;">Roche</td>
			<td style="width:124px;">11969064001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibson Assembly Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gRNA_Cloning Vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:124px;">41824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar plates containing 50 &#956;g/ml kanamycin</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine Stem Reagent</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">(STEM00001)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine embryonic fibroblasts (MEFs)</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:124px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital shaking incubator</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">pCas9_GFP vector</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:124px;">44719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR strip tubes</td>
			<td style="width:145px;">USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5&#215; Phusion buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:124px;">K210011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:124px;">Qiagen 19133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td style="width:124px;">636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC medium</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9020S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td style="width:124px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells

Menschliche pluripotente Stammzellen bieten ein leistungsfähiges System, um die Genfunktion zu untersuchen und modellspezifische Mutationen zu modellieren, die für Krankheiten relevant sind. Die Erzeugung präziser heterozygoter genetischer Modifikationen ist aufgrund der CRISPR-CAS9-vermittelten Indelbildung im zweiten Allel eine Herausforderung. Hier zeigen wir ein Protokoll, um diese Schwierigkeit zu überwinden, indem wir zwei Reparaturvorlagen verwenden, in denen nur eine die gewünschte Sequenzänderung ausdrückt, während beide Vorlagen stille Mutationen enthalten, um Nachschneiden und Indelbildung zu verhindern. Diese Methode ist am vorteilhaftesten für Gen-Editing-Codierungsregionen der DNA, um isogene Kontrolle und mutierte menschliche Stammzelllinien für die Untersuchung menschlicher Krankheiten und Biologie zu generieren. Darüber hinaus wurden Optimierungen von Transfektions- und Screening-Methoden durchgeführt, um Arbeit und Kosten eines Gen-Editing-Experiments zu reduzieren. Insgesamt ist dieses Protokoll weithin auf viele Genom-Editing-Projekte anwendbar, die das menschliche pluripotente Stammzellmodell verwenden.

Generierung von gRNAs und Screening für Indels
Jede gRNA wird in einen Plasmidvektor geklont und mit dem U6-Promotor exprimiert. Das AflII Restriktionsenzym wird zur Linearisierung des Plasmids (Addgen #41824) verwendet und befindet sich nach dem U6-Promotor. Das nach dem Glühen der beiden 60 bp Oligos erzeugte 100 bp-Band wird mit Hilfe der DNA-Assembly in den gRNA-Expressionsvektor geklont. Sobald die gRNA-Plasmide erzeugt sind, werden sie zusammen mit einem CRISP...

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Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Erleichterung der Erzeugung definierter heterozygoter oder homozygoter Nukleotid-Änderungen mit CRISPR-CAS9 in menschlichen pluripotenten Stammzellen.

Generierung definierter genomischer Modifikationen mit CRISPR-CAS9 in humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Die Untersuchung der Genfunktion und Krankheit wird durch die Auszucht der menschlichen Bevölkerung behindert. Die unterschiedlichen genetischen Hintergründe patientenspezifischer und kontrollierbarer iPS-Zelllinien können die Differenzierungseffizienz und Phänotypen in einem gegebenen funktionellen Test beeinflussen. Die Verwendung genetisch identischer oder isogener Linien, bei denen der einzige Unterschied darin besteht, dass die besondere Mutation von Interesse entscheidend ist, um diese Probleme zu überwinden.Viele menschliche Krankheiten werden durch heterozygote Mutationen verursacht, die mit dem CRISPR-Cas9-System nur schwer zu erzeugen sind. Dies ist auf die Erzeugung von Indelmutationen im nicht zielgerichteten Allel zurückzuführen, die bei sehr hoher Frequenz auftreten können. Unsere Technik überwindet dieses Problem, indem sie zwei Reparaturvorlagen verwendet, von denen nur eine die Mutation des Interesses birgt.Jeder Forscher, der diese Technik ausprobiert, sollte in der menschlichen pluripotenten Stammzellkultur versiert sein. Die Video-Demonstration der Kolonie-Picking wird hilfreich sein, um die richtige Größe und Morphologie sowie Technik für die Kommissionierung und Dassiebung zu zeigen. Die Demonstration dieses Verfahrens wird Leo Cardenas sein.Zu Beginn, Platte menschliche ESCs auf bestrahlte MEFs in einer 6-Well-Platte. Bereiten Sie den Transfektionsmaster-Mix vor. Durch Pipettieren mischen und bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubieren.Wenn die Zellen 70 bis 80% Konfluenz erreichen, dann fügen Sie die Transfektion Master-Mix tropfen klug zu jedem Brunnen mit Zellen und inkubieren bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden. Wechseln Sie die Medien alle 24 Stunden. Um die Zellen zu ernten, bebrüten Sie zunächst die Zellen mit Triple E für drei Minuten bei Raumtemperatur, um MEFs enzymatisch zu entfernen.Fügen Sie 0,5 Milliliter HESC-Medium mit 10 Mikromolaren ROCK-Hemmer hinzu. Pelletzellen bei 300 mal g für drei Minuten und re-suspend in 0,5 Milliliter des menschlichen ESC-Mediums mit 10 Mikromolaren ROCK-Hemmer. Filtern Sie die Zellsuspension durch eine 35-Mikron-Zell-Siebkappe in ein Fünf-Milliliter-Rohr.Mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung, Gate auf lebenden Zellen und sortieren Sie die grünen fluoreszierenden protein-positiven Zellen. Als nächstes übertragen Sie maximal 1,5 mal 10 auf die vier sortierten Zellen direkt in eine 10-Zentimeter-Schale, die mit einer bis drei Kellermembranmatrix und bestrahlten MEFs und menschlichem ESC-Medium mit ROCK-Hemmer beschichtet ist. Täglich mit dem menschlichen ESC-Medium ohne ROCK-Hemmer das Medium wechseln.Nach 10 bis 15 Tagen haben kolonien einen Durchmesser von etwa einem bis zwei Millimetern. Verwenden Sie unter dem Mikroskop eine P200-Pipette, um vorsichtig einen einzelnen Klon zu kratzen und Zellen in die Pipette zu ziehen. Dispergieren Sie die Zellen in einem Brunnen einer 96-Well-Platte, indem Sie drei- bis viermal in dem mit der Kolonie erstellten Medium sanft pipetieren.Dann pflücken Sie 20 Kolonien für jede Führungs-RNA und geben Sie in PCR-Streifenröhren zum Screening aus. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 10.000 mal G für fünf Minuten. Jetzt, inkubieren Zellpellets in 20 Mikroliter Proteinase K Puffer, um DNA und Wirbel kräftig zu isolieren.Zentrifuge bei 10.000 mal G für fünf Minuten. Führen Sie als Nächstes die PPCR der bearbeiteten DNA durch. Fügen Sie in die Röhren 20 Mikroliter einer Master-Mischung, einschließlich Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen, entwickelt, um die Region des Interesses zu verstärken, sowie fünf Mikroliter der Proteinase K Digest.Verwenden Sie genomische DNA, die aus der Kontroll-iPSC-Leitung isoliert ist, um ein sauberes Amplikon zu bestätigen, wenn Sie die Screening-PCR durchführen. Bewerten Sie Größenänderungen von PCR-Produkten nach einer Stunde Elektrophorese bei 70 bis 90 Volt bei einem Volumen-Agarose-Gel von 2,5 % volumenmäßig. Jeder Größenunterschied deutet auf Spaltung hin.Um die einsträngige Oligo-DNA und die CRISPR-Cas9-Plasmide zu transfekten, verfestigen Sie die Zielzelllinie in einer 6-Well-Schale auf bestrahlten MEFs, um nach einer nächtlichen Inkubation 70 bis 80 % Konfluenz zu erreichen. Richten Sie die Transfektionsreaktion wie beschrieben ein. Mischen Sie die Reaktion durch Pipetten und inkubieren Sie für 15 Minuten bei Raumtemperatur.Dann fügen Sie die Transfektion Reaktion Mischung Tropfen klug zu den Zellen. Bereiten Sie die Zellen nach 48 Stunden wie bisher auf die Zellensortierung vor. Etwa 10 Tage nach der Beschichtung einzelner Zellen verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um Kolonien in PCR-Streifenröhren und in einen Brunnen einer 12-Well-Platte zu pflücken, die mit Gelatine und MEFs vorbeschichtet ist.Übertragen Sie 100 Mikroliter der Zellen auf jeden Brunnen einer 24- oder 48-Well-Platte, die zuvor mit Gelatine beschichtet war und bestrahlte MEFs im menschlichen ESC-Medium mit ROCK-Hemmer. Verwenden Sie die restlichen 100 Mikroliter für die DNA-Isolierung. Um die erfolgreiche Integration der einstrangigen Oligo-DNA zu überprüfen, nehmen Sie fünf Mikroliter DNA, die aus jeder Kolonie isoliert sind, um PCR mit den zuvor entwickelten Screening-Primern durchzuführen.Reinigen Sie die PCR-Produkte und bereiten Sie die 40 Mikroliter reparierender Enzymverdauung mit der einzigartigen Enzym-Site vor, die in der Einstrang-Oligo-DNA erstellt wurde. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und inkubieren Sie bei der vom Hersteller empfohlenen Temperatur für ein bis drei Stunden. Dann visualisieren Sie die verdauten PCR-Produkte, die mit einem Ladefarbstoff auf einem Volumenvon 1,5% Gewicht von Ethidiumbromid Agarose Gel, Elektrophorese bei 80 bis 100 Volt für 40 Minuten hinzugefügt.Wenn eine erfolgreiche Integration der einstrangigen Oligo-DNA stattgefunden hat, sequenzspezifische Mutationen mit einem verschachtelten Primer. In dieser Studie wurde für die RNA-Führung ein 100-Basispaar-Band aus einem 1,5%agarose Gel entfernt. Nach der Zelltransfektion wurde die Validierung des RNA-Schnitts mit einem 2,5%agarose Gel visualisiert.Ein PCR-Produkt mit 180 Basenpaaren zeigte eine ungeschnittene Steuerung und verschiedene Klone mit Bandverschiebungen, die auf die Indelbildung hindeuten. Verschiedene Führungs-RNAs hatten unterschiedliche Schnitteffizienzen. Um ein erneutes Schneiden der bearbeiteten Allele durch CRISPR-Cas9 zu vermeiden, wurde die PAM-Sequenz mit einer G-zu-A-Stummmutation modifiziert.Eine stille Mutation in der PAM-Sequenz erzeugte eine eindeutige Einschränkungssite, die eine erfolgreiche Integration in ein oder zwei Allele ermöglicht. Genombearbeitete Stammzelllinien können in nachgelagerten Differenzierungen und funktionellen Assays verwendet werden, um die Wirkung einer bestimmten Mutation auf die menschliche Entwicklung und Krankheit zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung von isogenen Zelllinien mit einer spezifischen heterozygoten oder homozygoten Mutation, die in einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten involviert ist.Diese Krankheitsmodelle ebnen den Weg für die Entwicklung neuer zellulärer Therapien und bieten Plattformen für die Arzneimittelentdeckung.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Forschung

Genetik

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selektionsabhängige und unabhängige Erzeugung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Knockouts in Säugetierzellen

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Keim Urzelle Transplantation für CRISPR/Cas9-basierte in Xenopus überspringen

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung zu machen bedingte Mutanten der menschlichen Malaria-Parasiten p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein Tagging in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Lentivirale Vektor-Plattform für die effiziente Bereitstellung von Epigenom-editing-Tools in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Krankheitsmodelle

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...