Name: generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מימון של הלב הלאומי, הריאות, ובדם המכון (NHLBI), המכונים הלאומיים לבריאות באמצעות מענקים U01HL099656 (מ. פ. D.L.F.) ו U01HL134696 (למעלה ו D.L.F.).

1. עיצוב ובנייה של מדריך RNA (gRNA)
הערה: כל gRNA מורכב של 2 60 בסיס זוג (bp) oligונוגראודים, כי הם מוגלים כדי ליצור 100 bp כפול תקוע (ds) oligונואוטייד (איור 1א-ג). ציר הזמן עבור העיצוב gRNA, הדור, ויעילות חיתוך בדיקות הוא כ 2 שבועות (איור 2).
<ol><li>בחר את אזור ה-...

<ol>
	<li>Srivastava, D., Dewitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+In+Vivo+Cellular+Reprogramming:+The+Next+Generation.">Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation.</a> Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Review Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Embryonic+Stem+Cells+to+Relevant+Populations:+Lessons+from+Embryonic+Development.">Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 1-6 (2018).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Tiyaboonchai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA6+Plays+an+Important+Role+in+the+Induction+of+Human+Definitive+Endoderm,+Development+of+the+Pancreas,+and+Functionality+of+Pancreatic+&#946;+Cells.">GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic &#946; Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+hESCs+to+Probe+the+Interaction+of+the+Diabetes-Associated+Genes+CDKAL1+and+MT1E.">Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E.</a> Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Isogenic+Human+ESC+Platform+for+Functional+Evaluation+of+Genome-wide-Association-Study-Identified+Diabetes+Genes+and+Drug+Discovery.">An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+with+zinc+finger+nucleases+for+cellular+imaging.">Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging.</a> Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).</li><li>Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Modification+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Homologous+Recombination+and+CRISPR/Cas9+System.">Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System.</a> Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+gene-corrected+adult+beta+globin+protein+in+human+erythrocytes+differentiated+from+patient+iPSCs+after+genome+editing+of+the+sickle+point+mutation.">Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors.">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).</li><li>Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Doxycycline-Inducible+System+for+Genetic+Correction+of+iPSC+Disease+Models.">A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li><li>Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+human+stem+cells.">Genome editing in human stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).</li><li>Zhu, Z., Gonz&#225;lez, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis.">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li><li>Cong, L., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).</li><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+homology+directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA.">Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li><li>Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+crispr+cas9-mediated+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).</li></ol>

בפרוטוקול זה, את השימוש CRISPR-CAS9 יחד עם שני ssODN לתקן תבניות כדי לייצר heterozygous מסוימים או שינויים הגנום homozygous מוצג בתאי גזע האדם pluriפוטנטי. שיטה זו הביאה את הדור המצליח של קווי התא isogenic המבטא heterozygous גנומית שינויים עם יעילות קרוב ל 10%. פרוטוקול זה כבר אופטימיזציה עבור ESCs האנושית ו iPSCs גדל על MEFs הקר?...

האדם תאים גזע עובריים (hESCs) והמושרה תאים גזע pluriפוטנטי (iPSCs) הם כלים יקרי ערך למידול מחלות האדם בשל יכולתם להתחדשות, תוך שמירה על היכולת ליצור סוגי תאים של שונות לושלות1,2 ,3,4. מודלים אלה לפתוח את האפשרות לחקור פונקציה גנטית, ולהבין כיצד מוטציות ספציפיות פנוטיפים קשורים מחלות שונות5,6. עם זאת, כדי להבין כיצד שינוי מסוים מקושר לפנוטיפ מסוים, שימוש בפקד איזוגניים משויך ובקווי תא של מוטציה חשוב לשלוט בשורה לשונות שורה7,8. תמלול activator כמו נוקלאוסיס (TALENs) והנוקלאוסים אצבע אבץ שימשו כדי ליצור הוספה או מחיקה (indels) מוטציות במודלים גנטיים מגוונים, כולל תאים ראשוניים; אבל הנוקלאוסים האלה יכולים להיות מסורבל לשימוש ויקר9,10,11,12,13,14. הגילוי של באשכולות באופן קבוע הכולל מרווחים לחזור קצר palindromic (crispr)-CAS9 נוקלאז יש מהפכה בשדה בשל יעילות היווצרות indel כמעט בכל אזור של הגנום, פשטות השימוש, וצמצום עלות15 , מיכל בן 16 , מיכל בן 17 , מיכל בן 18 , . בן 19
אתגר בשימוש crispr-CAS9 מבוסס הגנום לעריכת הטכנולוגיה כבר הדור או תיקון של מוטציות ספציפיות אלל אחד בלי ליצור מוטציה indel ב אלל השני20. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא להתגבר על האתגר הזה על ידי שימוש בשני משתמשים בעלי התקן בודד ומבודד (ssODN) תיקון תבניות כדי להפחית את היווצרות indel ב allele השני. שני ssODNs נועדו להכיל מוטציות שתיקה כדי למנוע חיתוך מחדש על ידי CAS9 nuclease, אבל רק אחד מכיל שינוי של עניין. שיטה זו מגבירה את היעילות של יצירת שינוי גנטי מסוים heterozygous מבלי לגרימת היווצרות indel ב allele השני. באמצעות פרוטוקול זה, הניסויים בעריכת גנים בשישה מיקומים גנומית עצמאית להפגין את המבוא המדויק של שינוי גנומית הרצוי באחד אלל ללא היווצרות indel ב אלל השני ומתרחשת עם יעילות כוללת של ~ 10%. הפרוטוקול המתואר הותאם מ מגווייר ואח '21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="705">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap</td>
			<td style="width:145px;">Corning</td>
			<td style="width:124px;">352235</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well polystyrene tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AflII restriction endonuclease</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:124px;">R0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:124px;">N605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">dNTPs</td>
			<td style="width:145px;">Roche</td>
			<td style="width:124px;">11969064001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibson Assembly Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gRNA_Cloning Vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:124px;">41824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar plates containing 50 &#956;g/ml kanamycin</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine Stem Reagent</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">(STEM00001)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine embryonic fibroblasts (MEFs)</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:124px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital shaking incubator</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">pCas9_GFP vector</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:124px;">44719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR strip tubes</td>
			<td style="width:145px;">USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5&#215; Phusion buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:124px;">K210011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:124px;">Qiagen 19133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td style="width:124px;">636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC medium</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9020S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td style="width:124px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells

תאי גזע האדם בעלי עוצמה מציעים מערכת חזקה כדי לחקור את תפקוד הגנים ואת המודל מוטציות ספציפיות הרלוונטיות למחלה. הדור של שינויים גנטיים heterozygous מדויק מאתגר בשל CRISPR-CAS9 מתווך indel היווצרות ב allele השני. כאן, אנו להדגים פרוטוקול כדי לסייע להתגבר על הקושי הזה באמצעות שתי תבניות תיקון שבו רק אחד מבטא את שינוי הרצף הרצוי, בעוד שתי התבניות מכילות מוטציות שקטות כדי למנוע גזירה מחדש ומבנה indel. מתודולוגיה זו היא היתרון היעיל ביותר עבור הקוד לעריכת גנים באזורים של DNA כדי ליצור שליטה איזוגניים וקווי גזע האדם האנושי ללמוד מחלות אנושיות וביולוגיה. בנוסף, אופטימיזציה של העברת החצייה ומתודולוגיות ההקרנה בוצעו כדי להפחית את העבודה והעלות של ניסוי בעריכת גנים. בסך הכל, הפרוטוקול הזה הוא ישים נרחב לעריכת הגנום רבים באמצעות המודל האנושי pluriפוטנטי.

דור של gRNAs והקרנה עבור אינדלים
כל gRNA ישוכפל לתוך וקטור פלמיד וביטא באמצעות מקדם U6. האנזים AflII הגבלה משמש כדי לאתר את הפלסמיד (addgene #41824) והוא ממוקם לאחר מקדם U6. הלהקה 100 bp שנוצר לאחר הריפוי של 2 60 bp oligos משוכפל לתוך הביטוי gRNA ביטוי באמצעות הרכבה DNA. לאחר הפקת פלמידים של...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

פרוטוקול זה מספק שיטה כדי להקל על הדור של heterozygous או homozygous נוקלאוטיד שינויים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם pluripotent.

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

המחקר של תפקוד גנים ומחלות מעוכבים על ידי הטבע החיצוני של האוכלוסייה האנושית. הרקעים הגנטיים השונים של קווי תאי iPS ספציפיים למטופל ושליטה יכולים להשפיע על יעילות ההידול ועל פנוטיפים שנמצאו בהקשה תפקודית נתונה. השימוש בקווים זהים גנטית או isogenic שבו ההבדל היחיד הוא מוטציה מסוימת של עניין הוא קריטי כדי להתגבר על נושאים אלה.מחלות אנושיות רבות נגרמות על ידי מוטציות הטרוזיגיות, אשר יכול להיות קשה ליצור עם מערכת CRISPR-Cas9. זאת בשל הדור של מוטציות indel ב allele לא ממוקד שיכול להתרחש בתדירות גבוהה מאוד. הטכניקה שלנו מתגברת על בעיה זו באמצעות שתי תבניות תיקון שרק אחת מהן מטפחת את המוטציה של עניין.כל חוקר שמנסה טכניקה זו צריך להיות מיומן בתרבות תאי גזע פלוריפוטנטית אנושית. הדגמת וידאו של קטיף המושבה יהיה מועיל להראות גודל נכון מורפולוגיה, כמו גם טכניקה המשמשת לקטוף הקרנה. הוכחת הליך זה יהיה ליאו קרדנס.כדי להתחיל, צלחת ESCs אנושי על MEFs מוקרן בצלחת 6-well. הכינו את תערובת המאסטר של ההטרמפים. מערבבים על ידי צינורות ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.כאשר התאים מגיעים 70 עד 80%confluency, ולאחר מכן, מוסיפים את תערובת מאסטר transfection טיפה חכם לכל באר עם תאים דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. לשנות את המדיה כל 24 שעות. כדי לקצור את התאים, הראשון, דגירה התאים עם טריפל E במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר MEFs אנזימטית.הוסף 0.5 מיליליטר של מדיום HESC עם 10 מעכבי רוק מיקרומולר. תאי גלולה ב 300 פעמים g במשך שלוש דקות ולהשעות מחדש 0.5 מיליליטר של מדיום ESC אנושי עם 10 מעכבי רוק micromolar. לסנן את ההשעיה התא לתוך צינור חמישה מיליליטר דרך כובע מסננת תא 35 מיקרון.באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות, שער על תאים חיים ומיין את התאים הירוקים פלורסנט חלבון חיובי. לאחר מכן, להעביר מקסימום של 1.5 פעמים 10 לארבעת התאים ממוינים ישירות לתוך צלחת 10 ס"מ מצופה מטריצת קרום מרתף אחד עד שלושה MEFs מוקרן ומדיום ESC אנושי המכיל מעכבי רוק. שינוי בינוני מדי יום באמצעות מדיום ESC האנושי ללא מעכבי ROCK.לאחר 10 עד 15 ימים, המושבות הן בקוטר של מילימטר עד שני מילימטרים בקירוב. תחת מיקרוסקופ, השתמש פיפטה P200 כדי לגרד בזהירות שיבוט יחיד ולמשוך תאים לתוך פיפטה. מפזרים את התאים באר של צלחת 96 באר על ידי צינור בעדינות שלוש עד ארבע פעמים במדיום נערך עם המושבה.לאחר מכן, לבחור 20 מושבות עבור כל מדריך RNA ולחלק לתוך צינורות פס PCR להקרנה. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך חמש דקות. עכשיו, כדורי תא דגירה ב20 microliters של חיץ Proteinase K לבודד DNA ומערבולת במרץ.צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך חמש דקות. לאחר מכן, בצע הקרנת PCR של ה-DNA הערוך. הוסיפו לצינורות 20 מיקרוליטרים של תערובת אב, כולל פריימרים קדמיים והפוךים, שנועדו להגביר את אזור העניין, כמו גם חמישה מיקרוליטרים של תקציר Proteinase K.השתמש ב- DNA גנומי מבודד מהקו iPSC הבקרה כדי לאשר אמפייקון נקי בעת ביצוע PCR ההקרנה. להעריך את שינויי הגודל של מוצרי PCR לאחר שעה אחת של אלקטרופורזה ב 70 עד 90 וולט על 2.5% משקל לפי נפח אגרוז ג'ל. כל הבדל גודל מעיד על מחשוף.כדי לשנות את הדנ"א של אוליגו הגדיל הבודד ואת פלסמיד CRISPR-Cas9, צלחת קו תא היעד בצלחת 6 באר על MEFs מוקרן להגיע 70 עד 80% confluency לאחר יותר מדי דגירה לילה. הגדר את תגובת ההמרה כמתואר. מערבבים את התגובה על ידי צינורות ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, מוסיפים את תערובת התגובה transfection טיפה חכם לתאים. לאחר 48 שעות, הכן את התאים למיון תאים כבעבר. כ-10 ימים לאחר ציפוי תאים בודדים, השתמשו בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לקטוף מושבות בצינורות פס PCR ולתוך באר של צלחת של 12 בארות מצופה מראש בג'לטין ו- MEFs.להעביר 100 microliters של התאים לכל באר של צלחת 24 או 48 באר, מצופה בעבר עם ג'לטין ו MEFs מוקרן במדיום ESC אנושי עם מעכבי רוק. השתמש ב-100 המיקרוליטרים הנותרים לבידוד דנ"א. כדי לבדוק אינטגרציה מוצלחת של ה-DNA אוליגו גדיל יחיד, לקחת חמישה microliters של DNA מבודד מכל מושבה לבצע PCR באמצעות פריימרים ההקרנה תוכנן בעבר.לטהר את מוצרי PCR ולהכין את 40 microliters של עיכול אנזים הגבלה באמצעות אתר האנזים הייחודי שנוצר ב- DNA אוליגו גדיל יחיד. מערבבים את התגובה על ידי צינורות ודגירה בטמפרטורה המומלצת של היצרן במשך שעה עד שלוש שעות. לאחר מכן, לדמיין את מוצרי PCR מתעכל הוסיף עם צבע טעינה על 1.5% משקל לפי נפח אתידיום ברומיד אגרוז ג'ל, אלקטרופורזה ב 80 כדי 100 וולט במשך 40 דקות.אם אינטגרציה מוצלחת של הדנ"א אוליגו גדיל יחיד התרחשה, רצף מוטציות ספציפיות באמצעות פריימר מקונן. במחקר זה, לבניית RNA מדריך, רצועת זוג בסיס 100 הוצאה מג'ל אגרוז 1.5%. לאחר החיתוך התאי, אימות של חיתוך RNA מדריך היה חזותי באמצעות ג'ל 2.5%agarose.מוצר PCR של זוג בסיס 180 הראה בקרה לא חתוכות ושכפולים שונים עם משמרות פס המציינות היווצרות indel. למדריך שונה RNAs היו יעילות חיתוך שונה. כדי למנוע חיתוך מחדש של CRISPR-Cas9 של אללים ערוכים, רצף PAM שונה באמצעות מוטציה G ל- A שקטה.מוטציה שקטה ברצף PAM יצרה אתר הגבלה ייחודי, המסייע לסנן שילוב מוצלח לאלל אחד או שניים. ניתן להשתמש בקווי תאי גזע ערוכים בגנום בהבינות במורד הזרם ובמסיונות תפקודיים כדי לחקור את ההשפעה של מוטציה נתונה על ההתפתחות האנושית והמחלות. מתודולוגיה זו מאפשרת לדור של קווי תאים איזוגניים עם מוטציות הטרוזיגיות או הומוזיגיות ספציפיות, המעורבות במגוון רחב של מחלות אנושיות.מודלים אלה של מחלות סוללים את הדרך לפיתוח טיפולים תאיים חדשים, כמו גם מציעים פלטפורמות לגילוי תרופות.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

באמצעות טכניקה ג&#39;ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של צפרדע רפואית

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining עבור שינויים DNA: ניתוח חישובית של תמונות קונפוקלי

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי להפוך מותנה מוטציות של בני אדם טפיל המלריה falciparum פ

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

וקטור lentiviral פלטפורמה למסירה יעיל של כלי עריכת Epigenome לתוך האדם המושרה מודלים המחלה נגזר תאי גזע Pluripotent

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...