Name: generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

इस शोध के राष्ट्रीय दिल, फेफड़े, और रक्त संस्थान (NHLBI), अनुदान U01HL099656 (P.G. और D.L.F.) और U01HL134696 (पी.जी. और D.L.F.) के माध्यम से स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से धन द्वारा समर्थित किया गया था.

1. डिजाइन और गाइड आरएनए (gRNA) का निर्माण
नोट: प्रत्येक gRNA दो 60 आधार जोड़ी से बना है (bp) oligonucleotides कि एक 100 bp डबल फंसे (ds) ओलिगोन्यूक्लिओटाइड उत्पन्न करने के लिए annealed हैं (चित्र 1ए-सी). gRNA डिजाइन, ?...

<ol>
	<li>Srivastava, D., Dewitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+In+Vivo+Cellular+Reprogramming:+The+Next+Generation.">Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation.</a> Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Review Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Embryonic+Stem+Cells+to+Relevant+Populations:+Lessons+from+Embryonic+Development.">Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 1-6 (2018).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Tiyaboonchai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA6+Plays+an+Important+Role+in+the+Induction+of+Human+Definitive+Endoderm,+Development+of+the+Pancreas,+and+Functionality+of+Pancreatic+&#946;+Cells.">GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic &#946; Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+hESCs+to+Probe+the+Interaction+of+the+Diabetes-Associated+Genes+CDKAL1+and+MT1E.">Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E.</a> Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Isogenic+Human+ESC+Platform+for+Functional+Evaluation+of+Genome-wide-Association-Study-Identified+Diabetes+Genes+and+Drug+Discovery.">An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+with+zinc+finger+nucleases+for+cellular+imaging.">Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging.</a> Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).</li><li>Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Modification+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Homologous+Recombination+and+CRISPR/Cas9+System.">Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System.</a> Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+gene-corrected+adult+beta+globin+protein+in+human+erythrocytes+differentiated+from+patient+iPSCs+after+genome+editing+of+the+sickle+point+mutation.">Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors.">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).</li><li>Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Doxycycline-Inducible+System+for+Genetic+Correction+of+iPSC+Disease+Models.">A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li><li>Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+human+stem+cells.">Genome editing in human stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).</li><li>Zhu, Z., Gonz&#225;lez, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis.">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li><li>Cong, L., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).</li><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+homology+directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA.">Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li><li>Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+crispr+cas9-mediated+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल में, दो ssODN मरम्मत टेम्पलेट्स के साथ CRISPR-CAS9 का उपयोग विशिष्ट विषमयुग्मज या समयुग्मज जीनोम परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं में प्रदर्शन किया है. इस विधि के परिणामस्वरूप i...

मानव भ्रूण स्टेम सेल (ESCs) और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) नवीकरण के लिए अपनी क्षमता के कारण मानव रोग मॉडलिंग के लिए मूल्यवान उपकरण हैं, जबकि विभिन्न वंशों के सेल प्रकार उत्पन्न करने की क्षमता को बनाए रखने1,2 ,3,4. ये मॉडल जीन फलन से पूछताछ करने की संभावना को खोलते हैं और यह समझते हैं कि विशिष्ट उत्परिवर्तन तथा फीनोटाइप विभिन्नरोगोंसे किस प्रकार संबंधितहैं। हालांकि, यह समझने के लिए कि किसी विशिष्ट परिवर्तन को किसी विशेष फीनोटाइप से कैसे जोड़ा जाता है, युग्मित समजनिक नियंत्रण और उत्परिवर्ती सेल लाइनों का उपयोग लाइन परिवर्तनशीलता7,8के लिए लाइन के लिए नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर की तरह effector nucleases (TALENs) और जस्ता उंगली nucleases के लिए प्राथमिक कोशिकाओं सहित विविध आनुवंशिक मॉडल में प्रविष्टि या विलोपन (indels) उत्परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है; लेकिन ये न्यूक्लिएस का उपयोग करना और महंगा हो सकता है9,10,11,12,13,14. संकुल की खोज नियमित रूप से अंतराल कम palindromic दोहराने (CRISPR)-CAS9 nuclease जीनोम के लगभग किसी भी क्षेत्र में indel गठन में दक्षता के कारण क्षेत्र में क्रांति ला दी है, उपयोग की सादगी, और लागत में कमी15 , 16 , 17 , 18 , 19.
CRISPR-CAS9 आधारित जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी का उपयोग करने में एक चुनौती दूसरी एलीले20में एक अदल उत्परिवर्तन बनाने के बिना एक allele में विशिष्ट उत्परिवर्तनों के उत्पादन या सुधार किया गया है. इस प्रोटोकॉल का प्रमुख लक्ष्य दो एकल-स्लेड ओलिगोन्यूक्लिओटाइड (sODN) मरम्मत टेम्पलेट्स का उपयोग करके इस चुनौती को दूर करने के लिए दूसरे allele में अदल गठन को कम करने के लिए है. दोनों ssODNs CAS9 nuclease द्वारा फिर से काटने को रोकने के लिए चुप उत्परिवर्तनों को रोकने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं, लेकिन केवल एक ब्याज की परिवर्तन होता है. इस विधि दूसरे एलील में अदल गठन को प्रेरित किए बिना एक विशिष्ट विषमयुग्मज आनुवंशिक संशोधन पैदा करने की दक्षता बढ़ जाती है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, छह स्वतंत्र जीनोमिक स्थानों में जीन संपादन प्रयोगों दूसरे allele में indel गठन के बिना एक allele में वांछित जीनोमिक परिवर्तन का सटीक परिचय प्रदर्शित करता है और $ 10% की एक समग्र दक्षता के साथ होता है. वर्णित प्रोटोकॉल Maguire एट अल21से अनुकूलित किया गया है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="705">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap</td>
			<td style="width:145px;">Corning</td>
			<td style="width:124px;">352235</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well polystyrene tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AflII restriction endonuclease</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:124px;">R0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:124px;">N605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">dNTPs</td>
			<td style="width:145px;">Roche</td>
			<td style="width:124px;">11969064001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibson Assembly Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gRNA_Cloning Vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:124px;">41824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar plates containing 50 &#956;g/ml kanamycin</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine Stem Reagent</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">(STEM00001)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine embryonic fibroblasts (MEFs)</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:124px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital shaking incubator</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">pCas9_GFP vector</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:124px;">44719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR strip tubes</td>
			<td style="width:145px;">USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5&#215; Phusion buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:124px;">K210011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:124px;">Qiagen 19133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td style="width:124px;">636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC medium</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9020S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td style="width:124px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells

मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं जीन समारोह और मॉडल विशिष्ट रोग के लिए प्रासंगिक उत्परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली प्रदान करते हैं. सटीक विषमयुग्मज आनुवंशिक संशोधनों की पीढ़ी दूसरे एलेले में CRISPR-CAS9 मध्यस्थता अदल गठन के कारण चुनौतीपूर्ण है। यहाँ, हम दो मरम्मत टेम्पलेट्स जिसमें केवल एक वांछित अनुक्रम परिवर्तन व्यक्त करता है का उपयोग करके इस कठिनाई को दूर करने में मदद करने के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन, जबकि दोनों टेम्पलेट्स चुप उत्परिवर्तनों को रोकने के लिए फिर से काटने और indel गठन होते हैं. इस पद्धति मानव रोग और जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए isogenic नियंत्रण और उत्परिवर्ती मानव स्टेम सेल लाइनों उत्पन्न करने के लिए डीएनए के जीन संपादन कोडिंग क्षेत्रों के लिए सबसे अधिक फायदेमंद है. इसके अलावा, ट्रांसफेक्शन और स्क्रीनिंग के तरीकों का अनुकूलन श्रम और एक जीन संपादन प्रयोग की लागत को कम करने के लिए किया गया है। कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल व्यापक रूप से मानव pluripotent स्टेम सेल मॉडल का उपयोग कई जीनोम संपादन परियोजनाओं के लिए लागू है.

जी.आर.एन.ए. का उत्पादन और इन्डलों के लिए स्क्रीनिंग
प्रत्येक gRNA एक प्लाज्मिड वेक्टर में क्लोन किया जाएगा और U6 प्रमोटर का उपयोग कर व्यक्त किया. Aflद्वितीय प्रतिबंध एंजाइम प्लाज्मिड linearize...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

इस प्रोटोकॉल मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं में CRISPR-CAS9 का उपयोग कर परिभाषित विषमयुग्मज न्यूक्लिओटाइड परिवर्तन की पीढ़ी को सुविधाजनक बनाने के लिए एक विधि प्रदान करता है।

मानव Pluripotent स्टेम सेल में CRISPR-CAS9 का उपयोग कर परिभाषित जीनोमिक संशोधनों का उत्पादन

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

जीन समारोह और रोग का अध्ययन मानव आबादी की आउटब्रीड प्रकृति से बाधित होता है । रोगी-विशिष्ट और नियंत्रण आईपीएस सेल लाइनों की विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि किसी दिए गए कार्यात्मक परख में पाए जाने वाले भेदभाव दक्षता और फेनोटाइप को प्रभावित कर सकती है। आनुवंशिक रूप से समान या आइसोजेनिक लाइनों का उपयोग जहां केवल अंतर ब्याज का विशेष उत्परिवर्तन है इन मुद्दों को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है ।कई मानव रोग विषम उत्परिवर्तनों के कारण होते हैं, जिन्हें CRISPR-Cas9 प्रणाली के साथ उत्पन्न करना मुश्किल हो सकता है। यह गैर-लक्षित एलील में इनडेल म्यूटेशन के उत्पादन के कारण है जो बहुत अधिक आवृत्ति पर हो सकता है। हमारी तकनीक दो मरम्मत टेम्पलेट्स का उपयोग करके इस समस्या पर काबू पा रही है जिसमें से केवल एक ब्याज के उत्परिवर्तन को आश्रय देता है।इस तकनीक की कोशिश कर रहे किसी भी अन्वेषक को मानव pluripotent स्टेम सेल संस्कृति में कुशल होना चाहिए । कॉलोनी उठा के वीडियो प्रदर्शन सही आकार और आकृति विज्ञान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उठा और स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल तकनीक दिखाने के लिए उपयोगी हो जाएगा । इस प्रक्रिया का प्रदर्शन लियो कार्डेनास होगा।शुरू करने के लिए, एक 6-अच्छी तरह से प्लेट में विकिरणित MEFs पर मानव ESCs प्लेट। ट्रांसफेक्शन मास्टर मिक्स तैयार करें। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पाइपिंग और इनक्यूबेट द्वारा मिलाएं।जब कोशिकाएं 70 से 80% तक पहुंच जाती हैं, तो, कोशिकाओं के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से ट्रांसफैक्शन मास्टर मिक्स ड्रॉप वार जोड़ें और 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। हर 24 घंटे में मीडिया बदलें। कोशिकाओं को फसल करने के लिए, सबसे पहले, कमरे के तापमान पर तीन मिनट के लिए ट्रिपल ई के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करने के लिए MEFs एंजाइमेटिक रूप से हटा दें ।10 माइक्रोमोलर रॉक अवरोधक के साथ एचईएससी माध्यम के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। तीन मिनट के लिए 300 गुना ग्राम पर पैलेट सेल और 10 माइक्रोमोलर रॉक अवरोधक के साथ मानव ईएससी माध्यम के 0.5 मिलीलीटर में फिर से निलंबित करें। सेल सस्पेंशन को 35 माइक्रोन सेल छन्नी टोपी के माध्यम से पांच मिलीलीटर ट्यूब में फ़िल्टर करें।फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई, जीवित कोशिकाओं पर गेट का उपयोग करना और हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन-सकारात्मक कोशिकाओं को सॉर्ट करना। इसके बाद, चार क्रमित कोशिकाओं को अधिकतम 1.5 गुना 10 सीधे एक 10 सेंटीमीटर डिश में स्थानांतरित करें, जिसमें एक से तीन तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स और विकिरणित एमईएफ और मानव ईएससी माध्यम रॉक अवरोधक युक्त है। रॉक अवरोधक के बिना मानव ईएससी माध्यम का उपयोग करके दैनिक माध्यम बदलें।10 से 15 दिनों के बाद, कॉलोनियों का व्यास लगभग एक से दो मिलीमीटर होता है। एक माइक्रोस्कोप के तहत, एक P200 पिपेट का उपयोग ध्यान से एक क्लोन परिमार्जन और पिपेट में कोशिकाओं को आकर्षित करने के लिए । कॉलोनी के साथ तैयार किए गए माध्यम में तीन से चार बार धीरे-धीरे पाइपिंग करके 96-अच्छी प्लेट के कुएं में कोशिकाओं को तितर-बितर करें।फिर, प्रत्येक गाइड आरएनए के लिए 20 कॉलोनियों को चुनें और स्क्रीनिंग के लिए पीसीआर स्ट्रिप ट्यूब में वितरित करें। पांच मिनट के लिए 10, 000 बार जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को गोली मार । अब, डीएनए और भंवर को सख्ती से अलग करने के लिए प्रोटीनेज के बफर के 20 माइक्रोलीटर में सेल छर्रों को इनक्यूबेट करें।पांच मिनट के लिए 10, 000 बार जी पर सेंट्रलाइज। इसके बाद, संपादित डीएनए की स्क्रीनिंग पीसीआर करें। ट्यूबों में जोड़ें एक मास्टर मिश्रण के 20 माइक्रोलीटर, आगे और रिवर्स प्राइमर सहित, ब्याज के क्षेत्र को बढ़ाना करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, साथ ही प्रोटीनेज कश्मीर डाइजेस्ट के पांच माइक्रोलीटर ।स्क्रीनिंग पीसीआर प्रदर्शन करते समय एक साफ एम्प्लिकॉन की पुष्टि करने के लिए नियंत्रण आईपीएससी लाइन से अलग जीनोमिक डीएनए का उपयोग करें। वॉल्यूम एगरेज जेल द्वारा 2.5% वजन पर 70 से 90 वोल्ट पर इलेक्ट्रोफोरेसिस के एक घंटे के बाद पीसीआर उत्पादों के आकार परिवर्तनों का मूल्यांकन करें। किसी भी आकार का अंतर दरार का संकेत है।एकल कतरा ओलिगो डीएनए और CRISPR-Cas9 प्लाज्मिड्स को स्थानांतरित करने के लिए, एक रात भर के इनक्यूबेशन के बाद 70 से 80% तक पहुंचने के लिए विकिरणित एमईएफ पर 6-अच्छी तरह से पकवान में लक्ष्य सेल लाइन को प्लेट करें। वर्णित ट्रांसफेक्शन रिएक्शन सेट करें। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पाइपिंग और इनक्यूबेट द्वारा प्रतिक्रिया मिलाएं।फिर, कोशिकाओं में ट्रांसफेक्शन रिएक्शन मिश्रण ड्रॉप वार जोड़ें। 48 घंटे के बाद, कोशिकाओं को पहले की तरह सेल छंटाई के लिए तैयार करें। एकल कोशिकाओं को चढ़ाना के लगभग 10 दिन बाद, पीसीआर स्ट्रिप ट्यूबों में कालोनियों को लेने के लिए 200 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करें और जिलेटिन और एमईएफ के साथ प्री-लेपित 12-अच्छी प्लेट के कुएं में।कोशिकाओं के 100 माइक्रोलीटर को 24 या 48-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें, जो पहले रॉक अवरोधक के साथ मानव ईएससी माध्यम में जिलेटिन और विकिरणित एमईएफ के साथ लेपित होता है। डीएनए अलगाव के लिए शेष 100 माइक्रोलीटर का उपयोग करें। एकल कतरा ओलिगो डीएनए के सफल एकीकरण के लिए जांच करने के लिए, पहले से डिजाइन स्क्रीनिंग प्राइमर का उपयोग कर पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए प्रत्येक कॉलोनी से अलग डीएनए के पांच माइक्रोलीटर ले लो ।पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करें और एकल स्ट्रैंड ओलिगो डीएनए में बनाई गई अनूठी एंजाइम साइट का उपयोग करके प्रतिबंध एंजाइम पाचन के 40 माइक्रोलीटर तैयार करें। निर्माता के अनुशंसित तापमान पर एक से तीन घंटे के लिए पाइपिंग और इनक्यूबेट द्वारा प्रतिक्रिया मिलाएं। फिर, पचा पीसीआर उत्पादों की कल्पना करें जो वॉल्यूम एथिडियम ब्रोमाइड एगरेग जेल द्वारा 1.5% वजन पर लोडिंग डाई के साथ जोड़ा गया है, 40 मिनट के लिए 80 से 100 वोल्ट पर इलेक्ट्रोफोरेस।यदि एकल स्ट्रैंड ओलिगो डीएनए का सफल एकीकरण हुआ है, तो नेस्टेड प्राइमर का उपयोग करके अनुक्रम विशिष्ट उत्परिवर्तन। इस अध्ययन में, गाइड आरएनए निर्माण के लिए, 100 बेस पेयर बैंड को 1.5% एगर उठे जेल से उत्पादित किया गया था। सेल ट्रांसफैक्शन के बाद, गाइड आरएनए कटिंग के सत्यापन को 2.5% एगरेग्याइआर जेल का उपयोग करके कल्पना की गई थी।एक १८० बेस जोड़ी पीसीआर उत्पाद एक अनकट नियंत्रण और बैंड बदलाव के साथ अलग क्लोन दिखाया इंडेल गठन का संकेत है । अलग-अलग गाइड आरएनए में अलग-अलग कटिंग क्षमता थी। CRISPR-Cas9 से बचने के लिए संपादित alleles के फिर से काटने, पाम अनुक्रम एक मूक उत्परिवर्तन के लिए एक जी का उपयोग कर संशोधित किया गया था ।पाम अनुक्रम में एक मूक उत्परिवर्तन ने एक अद्वितीय प्रतिबंध साइट उत्पन्न की, जो सफल एकीकरण के लिए एक या दो एलील्स में स्क्रीन करने में मदद करती है। जीनोम संपादित स्टेम सेल लाइनों का उपयोग मानव विकास और रोग पर दिए गए उत्परिवर्तन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए डाउनस्ट्रीम भेदभाव और कार्यात्मक परख में किया जा सकता है। यह पद्धति मानव रोगों की एक विस्तृत विविधता में फंसाए गए एक विशिष्ट विषमता या होमोज़िगस म्यूटेशन के साथ आइसोजेनिक सेल लाइनों की पीढ़ी की अनुमति देती है।ये रोग मॉडल नए सेलुलर चिकित्सा के विकास के साथ-साथ दवा की खोज के लिए प्लेटफार्मों की पेशकश का मार्ग प्रशस्त करते हैं।

Research

JoVE Journal

Genetics

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

एक उच्च throughput प्रारूप में / Cas9 की मध्यस्थता नॉकआउट म्यूटेंट CRISPR जीनोटाइप के लिए एक फ्लोरोसेंट पीसीआर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन तकनीक का उपयोग करते हुए

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में सीआरआईएसपीआर / कैस 9-मध्यस्थता वाली जीन नॉकआउट्स के चयन-आश्रित और स्वतंत्र जनरेशन

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Xenopus में CRISPR/Cas9-आधारित Leapfrogging के लिए मौलिक रोगाणु कोशिका प्रत्यारोपण

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

डीएनए संशोधनों के लिए Immunostaining: फोकल छवियों की गणना विश्लेषण

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-मध्यस्थता एक समरूपता-मध्यस्थ अंत में शामिल होने की रणनीति का उपयोग कर Vivo में लक्षित एकीकरण

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Murine और मानव टेम जनक कोशिकाओं के अत्यधिक कुशल जीन व्यवधान CRISPR द्वारा Cas9/

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

C. एलिगेंस में जीनोमिक पॉइंट म्यूटेंट पैदा करने के लिए एक रैपिड और सतही पाइपलाइन का उपयोग CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 जीन संपादन मानव मलेरिया परजीवी पी. फाल्सीपेरम की सशर्त म्यूटेंट बनाने के लिए

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

अंतर्जात प्रोटीन टैगिंग में मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं का उपयोग CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न रोग मॉडल में Epigenome संपादन उपकरण के कुशल वितरण के लिए मसूरी वायरल वेक्टर मंच

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...