Name: generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Questa ricerca è stata sostenuta da finanziamenti del National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), National Institutes of Health attraverso sovvenzioni U01HL099656 (P.G. e D.L.F.) e U01HL134696 (P.G. e D.L.F.).

1. Progettazione e costruzione dell'RNA guida (gRNA)
NOTA: ogni gRNA è costituito da due oligonucleotidi della coppia di basi (bp) 60 che vengono anneali per generare un doppio filato (ds) oligonucleotide (Figura 1A-C). La tempistica per la progettazione, la generazione e l'efficienza di taglio dei gRNA è di circa 2 settimane (Figura 2).
<ol><li>Selezionare la regione del DNA di interesse da modificare nel genoma ...

<ol>
	<li>Srivastava, D., Dewitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+In+Vivo+Cellular+Reprogramming:+The+Next+Generation.">Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation.</a> Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Review Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Embryonic+Stem+Cells+to+Relevant+Populations:+Lessons+from+Embryonic+Development.">Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 1-6 (2018).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Tiyaboonchai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA6+Plays+an+Important+Role+in+the+Induction+of+Human+Definitive+Endoderm,+Development+of+the+Pancreas,+and+Functionality+of+Pancreatic+&#946;+Cells.">GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic &#946; Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+hESCs+to+Probe+the+Interaction+of+the+Diabetes-Associated+Genes+CDKAL1+and+MT1E.">Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E.</a> Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Isogenic+Human+ESC+Platform+for+Functional+Evaluation+of+Genome-wide-Association-Study-Identified+Diabetes+Genes+and+Drug+Discovery.">An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+with+zinc+finger+nucleases+for+cellular+imaging.">Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging.</a> Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).</li><li>Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Modification+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Homologous+Recombination+and+CRISPR/Cas9+System.">Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System.</a> Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+gene-corrected+adult+beta+globin+protein+in+human+erythrocytes+differentiated+from+patient+iPSCs+after+genome+editing+of+the+sickle+point+mutation.">Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors.">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).</li><li>Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Doxycycline-Inducible+System+for+Genetic+Correction+of+iPSC+Disease+Models.">A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li><li>Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+human+stem+cells.">Genome editing in human stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).</li><li>Zhu, Z., Gonz&#225;lez, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis.">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li><li>Cong, L., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).</li><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+homology+directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA.">Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li><li>Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+crispr+cas9-mediated+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).</li></ol>

In questo protocollo, l'uso di CRISPR-CAS9 insieme a due modelli di riparazione ssODN per generare specifici cambiamenti del genoma eterozigoo o omozigo è dimostrato nelle cellule staminali pluripotenti umane. Questo metodo ha portato alla generazione di successo di linee cellulari isogeniche che esprimono cambiamenti genomici eterozie con un'efficienza vicina al 10%. Questo protocollo è stato ottimizzato sia per le ESC umane che per gli iPSC cresciuti su MEF irradiati che supportano la crescita e la sopravvivenza dell...

Le cellule staminali embrionali umane (HESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono strumenti preziosi per modellare le malattie umane a causa della loro capacità di rinnovamento, pur mantenendo la capacità di generare tipi di cellule di linee diverse1,2 ,3,4. Questi modelli aprono la possibilità di interrogare la funzione genica e capiscono come mutazioni e fenotipi specifici siano correlati a varie malattie5,6. Tuttavia, per capire come una specifica alterazione sia collegata a un particolare fenotipo, l'uso di un controllo isogenico accoppiato e di linee cellulari mutanti è importante controllare per la variabilità da linea a linea7,8. Le nucleasi (TALEN) e le nucleasi di dita di zinco sono state utilizzate per generare mutazioni di inserimento o delezione (indels) in diversi modelli genetici, comprese le cellule primarie; ma queste nucleasi possono essere ingombranti da usare e costosi9,10,11,12,13,14. La scoperta della nuclea a breve ripetizione palindromica corta (CRISPR)-CAS9 del cluster regolarmente interspazio ha rivoluzionato il campo grazie all'efficienza nella formazione dell'indel in praticamente in qualsiasi regione del genoma, semplicità d'uso e riduzione dei costi15 , 16 , 17 mi lato , 18 mi lato , 19.
Una sfida nell'utilizzo della tecnologia di editing genomico basata su CRISPR-CAS9 è stata la generazione o la correzione di mutazioni specifiche in un allele senza creare una mutazione indel nel secondo allele20. L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di superare questa sfida utilizzando due modelli di riparazione di oligonucleotidi a filamento singolo (ssODN) per ridurre la formazione dell'indel nel secondo allele. Entrambi gli ssODN sono progettati per contenere mutazioni silenziose per prevenire il re-taglio da parte della nucleacanda CAS9, ma solo uno contiene l'alterazione dell'interesse. Questo metodo aumenta l'efficienza di generare una specifica modifica genetica eterozigola senza indurre la formazione dell'indele nel secondo allele. Utilizzando questo protocollo, gli esperimenti di editing genico in sei luoghi genomici indipendenti dimostrano l'introduzione precisa del cambiamento genomico desiderato in un allele senza formazione dell'indele nel secondo allele e si verifica con un'efficienza complessiva del 10%. Il protocollo descritto è stato adattato da Maguire et al.21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="705">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap</td>
			<td style="width:145px;">Corning</td>
			<td style="width:124px;">352235</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well polystyrene tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AflII restriction endonuclease</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:124px;">R0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:124px;">N605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">dNTPs</td>
			<td style="width:145px;">Roche</td>
			<td style="width:124px;">11969064001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibson Assembly Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gRNA_Cloning Vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:124px;">41824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar plates containing 50 &#956;g/ml kanamycin</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine Stem Reagent</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">(STEM00001)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine embryonic fibroblasts (MEFs)</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:124px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital shaking incubator</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">pCas9_GFP vector</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:124px;">44719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR strip tubes</td>
			<td style="width:145px;">USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5&#215; Phusion buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:124px;">K210011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:124px;">Qiagen 19133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td style="width:124px;">636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC medium</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9020S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td style="width:124px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells

Le cellule staminali pluripotenti umane offrono un potente sistema per studiare la funzione genica e modellare mutazioni specifiche rilevanti per la malattia. La generazione di precise modifiche genetiche eterozigole è impegnativa a causa della formazione indel mediata da CRISPR-CAS9 nel secondo allele. Qui, dimostriamo un protocollo per aiutare a superare questa difficoltà utilizzando due modelli di riparazione in cui solo uno esprime il cambiamento di sequenza desiderato, mentre entrambi i modelli contengono mutazioni silenziose per prevenire il taglio e la formazione dell'indel. Questa metodologia è più vantaggiosa per la codifica genica delle regioni del DNA per generare il controllo isogenico e linee di cellule staminali umane mutanti per lo studio delle malattie umane e della biologia. Inoltre, sono state eseguite ottimizzazioni delle metodologie di trasfezione e screening per ridurre il lavoro e il costo di un esperimento di editing genico. Nel complesso, questo protocollo è ampiamente applicabile a molti progetti di editing del genoma che utilizzano il modello di cellule staminali pluripotenti umane.

Generazione di gRNA e screening per indele
Ogni gRNA sarà clonato in un vettore plasmide ed espresso usando il promotore U6. L'enzima di restrizione AflII viene utilizzato per linearizzare il plasmide (addgene #41824) e si trova dopo il promotore U6. La banda di 100 bp generata dopo l'annealing delle due oligos da 60 bp viene clonata nel vettore di espressione gRNA utilizzando l'assieme DNA. Una volta generati, i plasmidi gRNA vengono trasfettati in hESC o iPSC insie...

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Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Questo protocollo fornisce un metodo per facilitare la generazione di cambiamenti di nucleotidi eterozio o omozigo utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane.

Generazione di modifiche genomiche definite utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Lo studio della funzione genica e delle malattie è ostacolato dalla natura di razza della popolazione umana. I diversi background genetici delle linee cellulari iPS specifiche del paziente e di controllo possono influenzare l'efficienza di differenziazione e i fenotipi trovati in un dato test funzionale. L'uso di linee geneticamente identiche o isogeniche in cui l'unica differenza è la particolare mutazione di interesse è fondamentale per superare questi problemi.Molte malattie umane sono causate da mutazioni eterozigoti, che possono essere difficili da generare con il sistema CRISPR-Cas9. Ciò è dovuto alla generazione di mutazioni indeli nell'allele non mirato che possono verificarsi ad altissima frequenza. La nostra tecnica supera questo problema utilizzando due modelli di riparazione di cui solo uno ospita la mutazione di interesse.Qualsiasi ricercatore che prova questa tecnica dovrebbe essere abile nella coltura di cellule staminali pluripotenti umane. La dimostrazione video della selezione della colonia sarà utile per mostrare le dimensioni e la morfologia corrette, nonché la tecnica utilizzata per la raccolta e lo screening. A dimostrare questa procedura sarà Leo Cardenas.Per cominciare, placcare gli ESC umani su MEF irradiati in una piastra a 6 poc. Preparare il mix di master di trasfezione. Mescolare con pipettazione e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.Quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, quindi, aggiungere la miscela master di trasfezione goccia saggia ad ogni pozzo con le cellule e incubare a 37 gradi Celsius per 48 ore. Cambia il supporto ogni 24 ore. Per raccogliere le cellule, in primo luogo, incubare le cellule con Tripla E per tre minuti a temperatura ambiente per rimuovere i MEF enzimaticamente.Aggiungere 0,5 millilitri di mezzo HESC con 10 inibitori ROCK micromolari. Celle a pellet a 300 volte g per tre minuti e sospensione in 0,5 millilitri di mezzo ESC umano con inibitore ROCK micromolare 10. Filtrare la sospensione cellulare in un tubo da cinque millilitri attraverso un tappo filtrante a celle da 35 micron.Usando lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, gate su cellule vive e ordinare le cellule positive alle proteine fluorescenti verdi. Successivamente, trasferire un massimo di 1,5 per 10 alle quattro cellule smistate direttamente in un piatto di 10 centimetri rivestito con matrice di membrana basale da uno a tre e MEF irradiati e mezzo ESC umano contenente inibitore ROCK. Cambiare mezzo ogni giorno utilizzando il mezzo ESC umano senza inibitore ROCK.Dopo 10-15 giorni, le colonie hanno un diametro di circa uno o due millimetri. Al microscopio, utilizzare una pipetta P200 per raschiare con cura un singolo clone e disegnare cellule nella pipetta. Disperdere le cellule in un pozzo di una piastra di 96 po 'coniando delicatamente da tre a quattro volte nel mezzo redatto con la colonia.Quindi, scegli 20 colonie per ogni RNA guida e dispensa in tubi a strisce PCR per lo screening. Pellettò le cellule per centrifugazione a 10.000 volte G per cinque minuti. Ora, incubare pellet cellulari in 20 microlitri di proteinasi K tampone per isolare vigorosamente DNA e vortice.Centrifuga a 10.000 volte G per cinque minuti. Successivamente, eseguire lo screening PCR del DNA modificato. Aggiungere nei tubi 20 microlitri di un master mix, compresi i primer avanti e indietro, progettati per amplificare la regione di interesse, così come cinque microlitri del digest Proteinase K.Utilizzare DNA genomico isolato dalla linea iPSC di controllo per confermare un'amplicon pulita durante l'esecuzione della PCR di screening. Valutare le variazioni di dimensione dei prodotti PCR dopo un'ora di elettroforesi a 70-90 volt con un peso del 2,5% in volume in gel di agarosio. Qualsiasi differenza di dimensione è indicativa della scissione.Per trasfetto il DNA dell'oligo a singolo filamento e i plasmidi CRISPR-Cas9, placcare la linea cellulare bersaglio in un piatto da 6 po 'su MEF irradiati per raggiungere la confluenza dal 70 all'80% dopo un'incubazione durante la notte. Impostare la reazione di trasfezione come descritto. Mescolare la reazione con pipettazione e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.Quindi, aggiungere la miscela di reazione di trasfezione cadere saggiamente alle cellule. Dopo 48 ore, preparare le celle per l'ordinamento delle celle come in precedenza. Circa 10 giorni dopo aver placcato singole cellule, utilizzare una pipetta da 200 microliter per raccogliere colonie in tubi di strisce PCR e in un pozzo di una piastra da 12 pozzetti pre-rivestita con gelatina e MEF.Trasferire 100 microlitri delle cellule in ogni pozzo di una piastra da 24 o 48 porri, precedentemente rivestita con gelatina e MEF irradiati nel mezzo ESC umano con inibitore ROCK. Utilizzare i restanti 100 microlitri per l'isolamento del DNA. Per verificare la riuscita integrazione del DNA dell'oligo a singolo filamento, prendere cinque microlitri di DNA isolati da ogni colonia per eseguire la PCR utilizzando i primer di screening precedentemente progettati.Purificare i prodotti PCR e preparare i 40 microlitri della digestione enzimatica di restrizione utilizzando l'esclusivo sito enzimatico creato nel DNA dell'oligo a singolo filamento. Mescolare la reazione con pipettazione e incubare alla temperatura raccomandata dal produttore per una o tre ore. Quindi, visualizzare i prodotti PCR digeriti aggiunti con un colorante di carico su un gel di agaro al bromuro di etidio dell'1,5% in volume, elettroforescente a 80-100 volt per 40 minuti.Se si è verificata un'integrazione riuscita del DNA dell'oligo a singolo filamento, sequenziare mutazioni specifiche usando un primer annidato. In questo studio, per la costruzione dell'RNA guida, una banda di 100 coppie di basi è stata asportata da un gel di agarosio dell'1,5%. Dopo la trasfezione cellulare, la convalida del taglio dell'RNA guida è stata visualizzata utilizzando un gel di agarosio al 2,5%.Un prodotto PCR a 180 coppie di basi mostrava un controllo non tagliato e diversi cloni con turni di banda che indicavano la formazione di indele. Diverse RNA guida avevano diverse efficienze di taglio. Per evitare il ritaglio CRISPR-Cas9 degli alleli modificati, la sequenza PAM è stata modificata usando una mutazione silenziosa da G a A.Una mutazione silenziosa nella sequenza PAM ha generato un sito di restrizione univoco, che aiuta a schermare per un'integrazione riuscita in uno o due alleli. Le linee di cellule staminali modificate dal genoma possono essere utilizzate nelle differenziazioni a valle e nei saggi funzionali per studiare l'effetto di una data mutazione sullo sviluppo umano e sulle malattie. Questa metodologia consente la generazione di linee cellulari isogeniche con specifiche mutazioni eterozigoti o omozigoti, implicate in un'ampia varietà di malattie umane.Questi modelli di malattia aprono la strada allo sviluppo di nuove terapie cellulari e offrono piattaforme per la scoperta di farmaci.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Usando una tecnica fluorescente PCR-capillare elettroforesi su gel al genotipo CRISPR / Cas9 mediata Knockout Mutants in un formato high-throughput

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Ricerca

Genetica

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selezione-dipendente e generazione indipendente di CRISPR / Cas9-mediata Gene Knockouts nelle cellule di mammiferi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Trapianto di cellule germinali primordiali per basati su CRISPR/Cas9 rincorsa in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining per modificazioni del DNA: analisi computazionale delle immagini Confocal

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Integrazione mirata CRISPR/Cas9-mediata In Vivo usando una strategia basata su unendo fine omologia-mediata

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Un veloce e Facile Pipeline per generazione di mutanti di punto Genomic in c. elegans utilizzando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing per rendere la mutanti condizionali del parassita di Malaria umana da p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Piattaforma di vettore lentivirale per la consegna efficiente di strumenti di editing Epigenome nelle umane indotte da modelli di malattia derivati da cellule staminali pluripotenti

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...