Name: generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

이 연구는 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소 (NHLBI), 보조금 U01HL099656 (P.G. 및 D.L.F.) 및 U01HL134696 (P.G. 및 D.L.F.)를 통해 건강의 국립 연구소에서 자금지원되었다.

1. 가이드 RNA (gRNA)의 설계 및 건설
참고: 각 gRNA는 100 bp 이중 연선(ds) 올리고뉴클레오티드(그림1A-C)를생성하기 위해 어닐링되는 2개의 60염기쌍(bp) 올리고뉴클레오티드로 구성된다. gRNA 설계, 생성 및 테스트 절단 효율에 대한 타임라인은 약 2주입니다(그림2).
<ol><li>유전체 편집할 관심 있는 DNA 영역을 선택하고 형식에 ?...

<ol>
	<li>Srivastava, D., Dewitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+In+Vivo+Cellular+Reprogramming:+The+Next+Generation.">Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation.</a> Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Review Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Embryonic+Stem+Cells+to+Relevant+Populations:+Lessons+from+Embryonic+Development.">Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 1-6 (2018).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Tiyaboonchai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA6+Plays+an+Important+Role+in+the+Induction+of+Human+Definitive+Endoderm,+Development+of+the+Pancreas,+and+Functionality+of+Pancreatic+&#946;+Cells.">GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic &#946; Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+hESCs+to+Probe+the+Interaction+of+the+Diabetes-Associated+Genes+CDKAL1+and+MT1E.">Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E.</a> Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Isogenic+Human+ESC+Platform+for+Functional+Evaluation+of+Genome-wide-Association-Study-Identified+Diabetes+Genes+and+Drug+Discovery.">An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+with+zinc+finger+nucleases+for+cellular+imaging.">Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging.</a> Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).</li><li>Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Modification+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Homologous+Recombination+and+CRISPR/Cas9+System.">Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System.</a> Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+gene-corrected+adult+beta+globin+protein+in+human+erythrocytes+differentiated+from+patient+iPSCs+after+genome+editing+of+the+sickle+point+mutation.">Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors.">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).</li><li>Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Doxycycline-Inducible+System+for+Genetic+Correction+of+iPSC+Disease+Models.">A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li><li>Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+human+stem+cells.">Genome editing in human stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).</li><li>Zhu, Z., Gonz&#225;lez, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis.">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li><li>Cong, L., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).</li><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+homology+directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA.">Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li><li>Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+crispr+cas9-mediated+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).</li></ol>

이 프로토콜에서, CRISPR-CAS9를 2개의 ssODN 수리 템플릿과 함께 사용하여 특정 이형이능 또는 동형접합체 게놈 변화를 생성하는 것은 인간 다능성 줄기 세포에서 입증된다. 이 방법은 10%에 가까운 효율로 이형게놈 변화를 발현하는 이소제세포주를 성공적으로 생성시켰다. 이 프로토콜은 세포 선별 후 저밀도에서 세포를 배양한 후 세포 성장과 생존을 지원하는 조사된 MEF에서 성장한 인간 ESCs 및 iPSCs ...

인간 배아 줄기 세포 (hESCs) 및 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 다른 혈통의 세포 유형을 생성하는 능력을 유지하면서 재생 능력으로 인해 인간 질병을 모델링하기위한 귀중한도구입니다1,2 ,3,4. 이들 모델은 유전자 기능을 심문할 수 있는 가능성을 열어주며, 특정 돌연변이와 표현형이 다양한질병과어떻게 관련되어 있는지 를 이해한다5,6. 그러나, 특정 변경이 특정 표현형에 어떻게 연결되는지 이해하기 위하여, 쌍이성 등소제 학적 제어 및 돌연변이 세포주의 사용은 라인 대 라인 가변성7,8에대한 제어에 중요하다. 전사 활성제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALENs) 및 아연 핑거 뉴클레아제는 1차 세포를 포함한 다양한 유전 모델에서 삽입 또는 결실(indels) 돌연변이를 생성하는데 사용되어 왔다; 그러나 이 뉴클레아제는 9,10,11,12,13,14를사용하는 것이 번거로울 수 있습니다. 클러스터된 정기적인 간격짧은 palindromic 반복 (CRISPR)-CAS9 뉴클레아제의 발견은 게놈의 거의 모든 영역에서 인델 형성의 효율성, 사용의 단순성 및 비용 절감으로 인해 분야에 혁명을 일으켰습니다15 , 16세 , 17세 , 18세 , 19.
CRISPR-CAS9 기반 게놈 편집 기술을 사용하는 데 있어 도전과제는 제2 대문자20에서인델 돌연변이를 생성하지 않고 하나의 대문자에서 특정 돌연변이의 생성 또는 보정이었다. 이 프로토콜의 주요 목표는 두 개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(ssODN) 수리 템플릿을 사용하여 제2 대문에서 의인 형성을 감소시킴으로써 이러한 과제를 극복하는 것이다. 두 ssODN은 CAS9 뉴클레아제에 의한 재절단을 방지하기 위해 자동 돌연변이를 포함하도록 설계되었지만, 오직 하나만이 관심의 변경을 포함하고 있다. 이 방법은 제2 대문예에서 인델 형성을 유도하지 않고 특정 이형 유전적 변형을 생성하는 효율을 증가시킨다. 이 프로토콜을 사용하여, 6개의 독립적인 게놈 위치에서의 유전자 편집 실험은 두 번째 알레르에서 인델 형성없이 하나의 대틀에서 원하는 게놈 변화의 정확한 도입을 입증하고 ~ 10%의 전반적인 효율로 발생한다. 기재된 프로토콜은 Maguire 외21에서적응되었습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="705">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap</td>
			<td style="width:145px;">Corning</td>
			<td style="width:124px;">352235</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well polystyrene tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AflII restriction endonuclease</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:124px;">R0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:124px;">N605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">dNTPs</td>
			<td style="width:145px;">Roche</td>
			<td style="width:124px;">11969064001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibson Assembly Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gRNA_Cloning Vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:124px;">41824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar plates containing 50 &#956;g/ml kanamycin</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine Stem Reagent</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">(STEM00001)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine embryonic fibroblasts (MEFs)</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:124px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital shaking incubator</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">pCas9_GFP vector</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:124px;">44719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR strip tubes</td>
			<td style="width:145px;">USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5&#215; Phusion buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:124px;">K210011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:124px;">Qiagen 19133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td style="width:124px;">636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC medium</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9020S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td style="width:124px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells

인간의 다능성 줄기 세포는 유전자 기능을 연구하고 질병과 관련된 특정 돌연변이를 모델링하는 강력한 시스템을 제공합니다. 정확한 이형 유전 적 변형의 생성은 CRISPR-CAS9가 두 번째 알레일에서 인델 형성을 매개했기 때문에 도전적입니다. 여기서는 두 템플릿 모두 재절단 및 인델 형성을 방지하기 위해 자동 돌연변이를 포함하는 반면, 하나의 복구 템플릿만 이 문제를 극복하는 데 도움이 되는 프로토콜을 시연합니다. 이 방법론은 인간 질병 및 생물학을 공부하기 위한 이원성 제어 및 돌연변이 인간 줄기 세포주를 생성하는 DNA의 유전자 편집 코딩 영역에 가장 유리하다. 또한 유전자 편집 실험의 인건비와 비용을 줄이기 위해 형질전환 및 스크리닝 방법론의 최적화가 수행되었습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포 모델을 활용하는 많은 게놈 편집 프로젝트에 널리 적용가능하다.

인델에 대한 gRNA 생성 및 스크리닝
각 gRNA는 플라스미드 벡터로 복제되고 U6 프로모터를 사용하여 발현될 것이다. AflII 제한 효소는 플라스미드(addgene #41824)를 선형화하는 데 사용되며 U6 프로모터 의 후에 위치한다. 2개의 60 bp 올리고를 어닐링한 후에 생성된 100 bp 대역은 DNA 조립체를 사용하여 gRNA 발현 벡터내로 복제된다. gRNA 플라스미드가 생성되면, 그들은...

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Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 이형 이형 또는 동형접합 뉴클레오티드 변화의 생성을 용이하게 하는 방법을 제공한다.

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

유전자 기능 과 질병의 연구는 인간 인구의 근간 특성에 의해 방해된다. 환자 특이적 및 제어 iPS 세포주의 다른 유전 적 배경은 주어진 기능적 분석에서 발견되는 분화 효율 및 표현형에 영향을 미칠 수 있습니다. 유일한 차이점은 관심의 특정 돌연변이는 이 문제점을 극복하기 위하여 중요한 유전으로 동일하거나 동소성 선의 사용은 중요합니다.많은 인간 질병은 CRISPR-Cas9 시스템으로 생성하기 어려울 수 있는 이종화구 돌연변이에 기인합니다. 이것은 매우 높은 주파수에서 발생할 수있는 비 표적 적 진상선에서 인델 돌연변이의 생성에 기인한다. 우리의 기술은 하나의 관심의 돌연변이를 항구두 수리 템플릿을 사용하여이 문제를 극복.이 기술을 시도하는 모든 구문은 인간 다능성 줄기 세포 배양에 숙련되어야합니다. 식민지 따기의 비디오 데모는 정확한 크기와 형태뿐만 아니라 따기 및 스크리닝에 사용되는 기술을 표시하는 데 도움이 될 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 레오 카르데나스입니다.먼저, 6웰 플레이트에 조사된 MEF에 인간 ESC를 플레이트합니다. 트랜스펙트 마스터 믹스를 준비합니다. 파이펫팅으로 섞고 실온에서 15분간 배양합니다.세포가 70 ~80%의 합류에 도달하면, 세포와 잘 현명하게 수축하는 형질 전환 마스터 믹스를 추가하고 48시간 동안 섭씨 37도에서 배양한다. 24시간마다 미디어를 변경합니다. 세포를 수확하려면 먼저 실온에서 3 분 동안 트리플 E로 세포를 배양하여 MEF를 효소적으로 제거합니다.10 마이크로 몰라 ROCK 억제제와 HESC 배지의 0.5 밀리리터를 추가합니다. 펠릿 세포는 3분 동안 300배 g로, 10개의 마이크로몰러 ROCK 억제제로 인간 ESC 배지의 0.5 밀리리터에서 다시 중단한다. 세포 현탁액을 35 미크론 세포 스트레이너 캡을 통해 5 밀리리터 튜브로 필터링합니다.형광 활성화 세포 분류를 사용하여 살아있는 세포에 게이트와 녹색 형광 단백질 양성 세포를 정렬합니다. 다음으로, 최대 1.5배 10회 를 10센티미터 의 정산세포로 직접 10센티미터 의 접시로 이송하여 1~3개의 지하 막 매트릭스로 코팅하고, ROCK 억제제가 함유된 MEF및 인간 ESC 배지를 조사하였다. ROCK 억제제 없이 인간 ESC 배지를 사용하여 매일 배지를 변경합니다.10 내지 15일 후에, 식민지는 직경이 대략 1 2 밀리미터입니다. 현미경으로 P200 파이펫을 사용하여 단일 클론을 조심스럽게 긁어 내고 세포를 파이펫으로 그립니다. 콜로니와 함께 작성된 배지에서 3~4회 부드럽게 파이프를 사용하여 96웰 플레이트의 우물에 세포를 분산시한다.그런 다음 각 가이드 RNA에 대해 20 개의 콜로니를 선택하고 검사를 위해 PCR 스트립 튜브로 분배하십시오. 5 분 동안 10, 000 배 G에서 원심 분리에 의해 세포를 펠렛. 이제, DNA와 소용돌이를 적극적으로 격리하기 위해 Proteinase K 버퍼의 20 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 배양합니다.원심분리기는 10, 000배 G에서 5분간. 다음으로, 편집된 DNA의 PCR 스크리닝을 수행한다. 관심 영역을 증폭하도록 설계된 전방 및 역 프라이머를 포함한 마스터 믹스의 20 마이크로리터와 Proteinase K 다이제스트의 5개의 마이크로리터를 튜브에 추가합니다.대조군 iPSC 라인에서 분리된 게놈 DNA를 사용하여 스크리닝 PCR을 수행할 때 깨끗한 앰플리콘을 확인합니다. 부피 아가로즈 젤에 의해 2.5 %의 무게에 70 ~ 90 볼트에서 전기 전구의 1 시간 다음 PCR 제품의 크기 변화를 평가합니다. 모든 크기 차이는 분열을 나타냅니다.단일 가닥 올리고 DNA와 CRISPR-Cas9 플라스미드를 변형시키기 위해, 조사된 MEF에 대한 6웰 접시에 표적 세포주를 플레이트하여 하룻밤 동안 인큐베이션을 통해 70~80%의 인플루언스에 도달합니다. 설명된 바와 같이 형질 전환 반응을 설정합니다. 파이펫팅으로 반응을 혼합하고 실온에서 15 분 동안 배양하십시오.그런 다음, 세포에 현명하게 떨어지는 형질 전환 반응 혼합물을 추가한다. 48 시간 후에, 이전과 같이 세포 분류를 위한 세포를 준비합니다. 단일 세포를 도금 한 후 약 10 일, PCR 스트립 튜브에 식민지를 선택하고 젤라틴과 MEF로 미리 코팅 된 12 웰 플레이트의 우물에 200 마이크로 리터 파이펫을 사용합니다.이전에 는 젤라틴으로 코팅되고 ROCK 억제제와 인간 ESC 배지에서 조사 MEFs24 또는 48 웰 플레이트의 각 우물에 세포의 100 마이크로 리터를 전송합니다. DNA 격리를 위해 나머지 100 마이크로리터를 사용합니다. 단일 가닥 올리고 DNA의 성공적인 통합을 확인하려면 이전에 설계된 스크리닝 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하기 위해 각 식민지에서 분리 된 DNA의 5 마이크로 리터를 복용하십시오.PCR 제품을 정화하고 단일 스트랜드 올리고 DNA에서 생성 된 독특한 효소 부위를 사용하여 제한 효소 소화의 40 마이크로 리터를 준비합니다. 제조업체의 권장 온도에서 파이펫팅및 인큐베이션을 사용하여 반응을 1~3시간 동안 섞습니다. 이어서, 에디듐 브로마이드 아가로즈 젤, 전기전도80~100볼트에 40분 동안 1.5%의 중량으로 로딩 염료로 첨가된 소화PCR 제품을 시각화한다.단일 가닥 올리고 DNA의 성공적인 통합이 발생한 경우 중첩 된 프라이머를 사용하여 서열 특정 돌연변이가 발생합니다. 이 연구에서는, 가이드 RNA 시공을 위해, 100개의 베이스 쌍 밴드가 1.5%의 아가로즈 젤로부터 절제되었다. 세포 형질전환 에 이어, 가이드 RNA 절단의 유효성 검사는 2.5%의 아가로즈 젤을 사용하여 시각화하였다.180베이스 페어 PCR 제품은 인델 형성을 나타내는 밴드 시프트가 있는 절단되지 않은 컨트롤과 다른 클론을 보여주었습니다. 다른 가이드 RNA는 다른 절단 효율성을 했다. 편집된 알레일의 CRISPR-Cas9 재절단을 피하기 위해, PAM 서열은 G를 사용하여 자동 돌연변이로 수정하였다.PAM 서열의 자동 돌연변이는 하나의 또는 두 개의 모두에 성공적인 통합을 위해 스크리딩하는 데 도움이 되는 고유한 제한 사이트를 생성했습니다. 게놈 편집 줄기 세포주 다운스트림 분화 및 기능적 분석은 인간의 발달과 질병에 주어진 돌연변이의 효과를 연구하기 위해 사용될 수있다. 이 방법론은 다양한 인간 질병에 연루된 특정 이종화구 또는 동종질 돌연변이를 가진 동종 세포주의 생성을 허용합니다.이 질병 모형은 새로운 세포 치료의 발달을 위한 도로를 포장하고 약 발견을 위한 발판을 제안합니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

연구

유전학

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Xenopus 에 Leapfrogging CRISPR/Cas9-기반에 대 한 원시 생식 세포 이식

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

DNA 수정에 대 한 Immunostaining: 공초점 이미지의 계산 분석

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 유전자 인간 말라리아 기생충의 조건부 돌연변이 게 P. falciparum 에 편집

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...