Name: generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av finansiering fra National Heart, Lung, og Blood Institute (NHLBI), National Institutes of Health gjennom tilskudd U01HL099656 (P.G. and D.L.F.) og U01HL134696 (P.G. and D.L.F.).

1. design og bygging av guide RNA (gRNA)
Merk: hver gRNA består av 2 60 base pair (BP) oligonukleotider som er glødet til å generere en 100 BP dobbel strandet (DS) oligonukleotid (figur 1a-C). Tidslinjen for gRNA design, generasjon og testing kutte effektivitet er ca 2 uker (figur 2).
<ol><li>Velg DNA-regionen av interesse for å være Genova redigert og identifisere 3-4 23 BP sekvenser som passer formatet, 5 '-G...

<ol>
	<li>Srivastava, D., Dewitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+In+Vivo+Cellular+Reprogramming:+The+Next+Generation.">Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation.</a> Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Review Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Embryonic+Stem+Cells+to+Relevant+Populations:+Lessons+from+Embryonic+Development.">Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 1-6 (2018).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Tiyaboonchai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA6+Plays+an+Important+Role+in+the+Induction+of+Human+Definitive+Endoderm,+Development+of+the+Pancreas,+and+Functionality+of+Pancreatic+&#946;+Cells.">GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic &#946; Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+hESCs+to+Probe+the+Interaction+of+the+Diabetes-Associated+Genes+CDKAL1+and+MT1E.">Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E.</a> Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Isogenic+Human+ESC+Platform+for+Functional+Evaluation+of+Genome-wide-Association-Study-Identified+Diabetes+Genes+and+Drug+Discovery.">An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+with+zinc+finger+nucleases+for+cellular+imaging.">Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging.</a> Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).</li><li>Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Modification+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Homologous+Recombination+and+CRISPR/Cas9+System.">Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System.</a> Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+gene-corrected+adult+beta+globin+protein+in+human+erythrocytes+differentiated+from+patient+iPSCs+after+genome+editing+of+the+sickle+point+mutation.">Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors.">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).</li><li>Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Doxycycline-Inducible+System+for+Genetic+Correction+of+iPSC+Disease+Models.">A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li><li>Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+human+stem+cells.">Genome editing in human stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).</li><li>Zhu, Z., Gonz&#225;lez, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis.">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li><li>Cong, L., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).</li><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+homology+directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA.">Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li><li>Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+crispr+cas9-mediated+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).</li></ol>

I denne protokollen, bruk av CRISPR-CAS9 sammen med to ssODN reparasjon maler for å generere spesifikke heterozygot eller homozygote Genova endringer er demonstrert i humant Pluripotent stamceller. Denne metoden resulterte i en vellykket generasjon av isogenic cellelinjer uttrykker heterozygot genomisk endringer med en virkningsgrad nær 10%. Denne protokollen er optimalisert for både menneskelige ESCs og iPSCs vokst på bestrålt MEFs som støtter cellevekst og overlevelse etter dyrking celler ved lav tetthet etter ce...

Human embryonale stamceller (hESCs) og indusert Pluripotent stamceller (iPSCs) er verdifulle verktøy for modellering menneskelig sykdom på grunn av deres kapasitet for fornyelse, og samtidig opprettholde muligheten til å generere celletyper av forskjellige linjene1,2 ,3,4. Disse modellene åpner muligheten for å forhøre genet funksjon, og forstå hvordan spesifikke mutasjoner og fenotyper er knyttet til ulike sykdommer5,6. Men for å forstå hvordan en bestemt endring er knyttet til en bestemt fenotype, er bruken av en sammenkoblet isogenic kontroll og mutant cellelinjer viktig for å kontrollere for linje til linje variasjon7,8. Transkripsjon aktivator-lignende effektor nukleaser (TALENs) og sink finger nukleaser har blitt brukt til å generere innsetting eller sletting (indeler) mutasjoner i ulike genetiske modeller, inkludert primær celler; men disse nukleaser kan være tungvint å bruke og dyre9,10,11,12,13,14. Oppdagelsen av gruppert regelmessig oppdelt kort palindromic gjenta (CRISPR)-CAS9 nuklease har revolusjonert feltet på grunn av effektivitet i indel formasjon i nesten hvilken som helst region av Genova, enkelhet i bruk, og reduksjon i kostnader15 , 16 flere , 17 i , 18 av år , 19i denne.
En utfordring i å bruke CRISPR-CAS9 baserte Genova redigerings teknologi har vært generering eller korrigering av spesifikke mutasjoner i en allel uten å skape en indel mutasjon i den andre allel20. Hovedmålet med denne protokollen er å overvinne denne utfordringen ved å bruke to enkelt-strandet oligonukleotid (ssODN) reparasjon maler for å redusere indel formasjon i den andre allel. Begge ssODNs er designet for å inneholde tause mutasjoner for å hindre re-skjæring av CAS9 nuklease, men bare en inneholder endring av interesse. Denne metoden øker effektiviteten ved å generere en bestemt heterozygot genetisk modifisering uten å indusere indel formasjon i den andre allel. Ved hjelp av denne protokollen, genredigering eksperimenter i seks uavhengige genomisk steder demonstrere presis innføring av ønsket genomisk endring i en allel uten indel formasjon i andre allel og oppstår med en generell virkningsgrad på ~ 10%. Den beskrevne protokollen er tilpasset fra Maguire et al.21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="705">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap</td>
			<td style="width:145px;">Corning</td>
			<td style="width:124px;">352235</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well polystyrene tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AflII restriction endonuclease</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:124px;">R0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:124px;">N605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">dNTPs</td>
			<td style="width:145px;">Roche</td>
			<td style="width:124px;">11969064001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibson Assembly Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gRNA_Cloning Vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:124px;">41824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar plates containing 50 &#956;g/ml kanamycin</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine Stem Reagent</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">(STEM00001)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine embryonic fibroblasts (MEFs)</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:124px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital shaking incubator</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">pCas9_GFP vector</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:124px;">44719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR strip tubes</td>
			<td style="width:145px;">USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5&#215; Phusion buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:124px;">K210011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:124px;">Qiagen 19133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td style="width:124px;">636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC medium</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9020S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td style="width:124px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells

Humane Pluripotent stamceller tilbyr et kraftig system for å studere gen funksjon og modellspesifikke mutasjoner som er relevante for sykdommen. Generering av presise heterozygot genetiske modifikasjoner er utfordrende på grunn av CRISPR-CAS9 mediert indel formasjon i den andre allel. Her demonstrerer vi en protokoll for å bidra til å overkomme dette problemet ved å bruke to reparasjons maler der bare én uttrykker ønsket sekvens endring, mens begge malene inneholder stille mutasjoner for å forhindre ny skjæring og indel dannelse. Denne metodikken er mest fordelaktig for genredigering koding regioner av DNA for å generere isogenic kontroll og mutant menneskelig stilk cellen linjer for å studere menneskelig sykdom og biologi. I tillegg har optimalisering av transfeksjoner-og screening-metoder blitt utført for å redusere arbeidskraft og kostnader for et gen redigerings eksperiment. Samlet sett er denne protokollen allment aktuelt for mange Genova redigering prosjekter utnytte den menneskelige pluripotent stilk cellen modell.

Generering av gRNAs og screening for indeler
Hver gRNA vil bli klonet i en plasmider vektor og uttrykt ved hjelp av U6 promoter. AFLII restriksjon enzymet brukes til å linearize plasmider (addgene #41824) og er plassert etter U6 arrangøren. Det 100 BP bånd utviklet etter annealing det 2 60 BP oligos er klon inn i gRNA gjengivelsen vektor benytter det DNA samlingen. Når gRNA plasmider er generert, er de transfekterte i hESCs eller iPSCs sammen med en POTETGULL-CAS9...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Denne protokollen gir en metode for å forenkle generering av definerte heterozygot eller homozygote nukleotid endringer ved hjelp av CRISPR-CAS9 i menneskelige Pluripotent stamceller.

Generering av definerte genomisk modifikasjoner bruke CRISPR-CAS9 i Human Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Studien av genfunksjon og sykdom er hemmet av den utavlede naturen til den menneskelige befolkningen. De ulike genetiske bakgrunnene til pasientspesifikke og kontrollerende iPS-cellelinjer kan påvirke differensieringseffektivitet og fenotyper som finnes i en gitt funksjonell analyse. Bruk av genetisk identiske eller isogenic linjer der den eneste forskjellen er den spesielle mutasjonen av interesse er avgjørende for å overvinne disse problemene.Mange menneskelige sykdommer er forårsaket av heterozygous mutasjoner, som kan være vanskelig å generere med CRISPR-Cas9-systemet. Dette skyldes generering av indelmutasjoner i det ikke-målrettede allelet som kan oppstå med svært høy frekvens. Vår teknikk overvinner dette problemet ved å bruke to reparasjonsmaler hvorav bare en har mutasjonen av interesse.Enhver etterforsker som prøver denne teknikken bør være dyktig på menneskelig pluripotent stamcellekultur. Videodemonstrasjonen av koloniplukking vil være nyttig for å vise riktig størrelse og morfologi, samt teknikk som brukes til plukking og screening. Viser denne prosedyren vil være Leo Cardenas.Til å begynne med, plate menneskelige ESCer på bestrålte MEFs i en 6-brønns plate. Forbered transfection master mix. Bland ved pipettering og inkuber ved romtemperatur i 15 minutter.Når cellene når 70 til 80% samløpet, deretter legge transfection master mix drop klok til hver brønn med celler og inkubere ved 37 grader Celsius i 48 timer. Endre mediet hver 24. For å høste cellene, først, inkubere cellene med Triple E i tre minutter ved romtemperatur for å fjerne MEFs enzymatisk.Tilsett 0,5 milliliter HESC medium med 10 mikromose ROCK-hemmer. Pelletceller ved 300 ganger g i tre minutter og re-suspendere i 0,5 milliliter av humant ESC medium med 10 mikromussER ROCK-hemmer. Filtrer celleopphenget i et fem milliliter rør gjennom en 35 mikron cellesilhette.Ved hjelp av fluorescens-aktivert celle sortering, gate på levende celler og sortere de grønne fluorescerende protein-positive celler. Deretter overfører du maksimalt 1,5 ganger 10 til de fire sorterte cellene direkte til en 10 centimeter rett belagt med en til tre kjellermembranmatrise og bestrålte MEFs og humane ESC-medium som inneholder ROCK-hemmer. Bytt medium daglig ved hjelp av det menneskelige ESC-mediet uten ROCK-hemmer.Etter 10 til 15 dager er kolonier omtrent en til to millimeter i diameter. Under et mikroskop bruker du en P200-pipette til å forsiktig skrape en enkelt klone og trekke celler inn i pipetten. Spre cellene i en brønn av en 96-brønns plate ved å forsiktig pipettering tre til fire ganger i mediet utarbeidet med kolonien.Deretter velger du 20 kolonier for hver guide RNA og dispenserer i PCR-striperør for screening. Pellet cellene ved sentrifugering ved 10.000 ganger G i fem minutter. Nå inkubere cellepellets i 20 mikroliter proteinase K buffer for å isolere DNA og virvel kraftig.Sentrifuge ved 10.000 ganger G i fem minutter. Deretter utfører du screening PCR av det redigerte DNA- Legg til rørene 20 mikroliter av en master mix, inkludert fremover og omvendt primere, designet for å forsterke regionen av interesse, samt fem mikroliter av Proteinase K fordøye.Bruk genomisk DNA isolert fra kontrolllinjen iPSC for å bekrefte en ren amplikon når du utfører screening-PCR. Evaluer størrelsesendringer av PCR-produkter etter en time elektroforese ved 70 til 90 volt på en 2,5% vekt etter volum agarose gel. Enhver størrelsesforskjell er et tegn på spalting.For å transfisere enkelt strand oligo DNA og CRISPR-Cas9 plasmids, plate målcellelinjen i en 6-brønns rett på bestrålte MEFs å nå 70 til 80% samløpet etter over en overnatting inkubasjon. Sett opp transfection reaksjonen som beskrevet. Bland reaksjonen ved å pipettere og inkubere i 15 minutter ved romtemperatur.Deretter legger transfection reaksjonblandingen dråpe klokt til cellene. Etter 48 timer forbereder du cellene for cellesortering som tidligere. Omtrent 10 dager etter plating enkeltceller, bruk en 200 mikroliter pipette for å plukke kolonier i PCR stripe rør og inn i en brønn av en 12-brønns plate pre-belagt med gelatin og MEFs.Overfør 100 mikroliter av cellene til hver brønn på en 24- eller 48-brønnsplate, tidligere belagt med gelatin og bestrålte MEFs i humant ESC-medium med ROCK-hemmer. Bruk de resterende 100 mikroliter for DNA-isolasjon. For å se etter vellykket integrering av enkelt strand oligo DNA, ta fem mikroliter av DNA isolert fra hver koloni for å utføre PCR ved hjelp av screening primere tidligere designet.Rens PCR-produktene og klargjør de 40 mikroliter av begrensningsenzymfordøyelse ved hjelp av det unike enzymstedet som er opprettet i enkelt strand oligo DNA. Bland reaksjonen ved å pipettere og inkubere ved produsentens anbefalte temperatur i en til tre timer. Deretter visualisere de fordøyde PCR-produktene som legges til med et lastefargestoff på en 1,5% vekt ved volum ethidiumbromid agarose gel, elektroforese på 80 til 100 volt i 40 minutter.Hvis vellykket integrering av enkelt strand oligo DNA har skjedd, sekvens spesifikke mutasjoner ved hjelp av en nestet primer. I denne studien, for guide RNA konstruksjon, ble en 100 base par band skåret ut fra en 1,5% agarose gel. Etter celletransfeksjon ble validering av guide RNA-skjæring visualisert ved hjelp av en 2,5% agarose gel.Et 180 base pair PCR-produkt viste en uklippet kontroll og forskjellige kloner med båndskift som indikerer indelformasjon. Ulike guide RNA-er hadde forskjellig skjæreeffektivitet. For å unngå at CRISPR-Cas9 kutter de redigerte allelene på nytt, ble PAM-sekvensen endret ved hjelp av en G til A stille mutasjon.En stille mutasjon i PAM-sekvensen genererte et unikt begrensningssted, noe som bidrar til å screene for vellykket integrering i en eller to alleler. Genomredigerte stamcellelinjer kan brukes i nedstrøms differensieringer og funksjonelle analyser for å studere effekten av en gitt mutasjon på menneskelig utvikling og sykdom. Denne metodikken tillater generering av isogene cellelinjer med en bestemt heterozygous eller homozygous mutasjoner, innblandet i et bredt spekter av menneskelige sykdommer.Disse sykdomsmodellene baner vei for utvikling av nye cellulære terapier, samt tilbyr plattformer for narkotikaoppdagelse.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Ved hjelp av en Fluorescent PCR-kapillar-gelelektroforese teknikken for å genotype CRISPR / Cas9-mediert knockout-mutanter i en high-throughput-format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Utvalgsavhengig og uavhengig generasjon av CRISPR / Cas9-medierte Gene Knockouts i mammale celler

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Opprinnelige celletransplantasjon for CRISPR/Cas9-baserte sprang framover i Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining for DNA modifikasjoner: beregningsorientert analyse av AC Confocal bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediert målrettet integrering i Vivo med en homologi-mediert slutten begynte-basert strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Svært effektiv Gene avbrudd i Murine og menneskelig blodkreft stamfar celler av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

En rask og lettvint rørledning for generering Genomic punkt mutanter i C. elegans bruker CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene redigering gjør betinget mutanter av menneskelig malariaparasitten P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein merking i menneskelig indusert Pluripotent stilk celler med CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Lentiviral Vector plattform for effektiv levering av Epigenome-redigeringsverktøy i Human indusert Pluripotent Stamcelle-avledet sykdom modeller

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...