Name: generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00
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Esta investigación fue apoyada por fondos del Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre (NHLBI), Institutos Nacionales de Salud a través de subvenciones U01HL099656 (P.G. y D.L.F.) y U01HL134696 (P.G. y D.L.F.).

1. Diseño y construcción de ARN guía (gRNA)
NOTA: Cada gRNA se compone de dos oligonucleótidos de 60 pares base (bp) que se recocidos para generar un oligonucleótido de doble cadena (ds) de 100 bp(figura 1A-C). La cronología para el diseño, la generación y la eficiencia de corte de gRNA es de aproximadamente 2 semanas(Figura 2).
<ol><li>Seleccione la región de ADN de interés que se va a editar en el genoma...

<ol>
	<li>Srivastava, D., Dewitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+In+Vivo+Cellular+Reprogramming:+The+Next+Generation.">Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation.</a> Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Review Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Embryonic+Stem+Cells+to+Relevant+Populations:+Lessons+from+Embryonic+Development.">Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 1-6 (2018).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Tiyaboonchai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA6+Plays+an+Important+Role+in+the+Induction+of+Human+Definitive+Endoderm,+Development+of+the+Pancreas,+and+Functionality+of+Pancreatic+&#946;+Cells.">GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic &#946; Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+hESCs+to+Probe+the+Interaction+of+the+Diabetes-Associated+Genes+CDKAL1+and+MT1E.">Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E.</a> Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Isogenic+Human+ESC+Platform+for+Functional+Evaluation+of+Genome-wide-Association-Study-Identified+Diabetes+Genes+and+Drug+Discovery.">An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+with+zinc+finger+nucleases+for+cellular+imaging.">Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging.</a> Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).</li><li>Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Modification+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Homologous+Recombination+and+CRISPR/Cas9+System.">Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System.</a> Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+gene-corrected+adult+beta+globin+protein+in+human+erythrocytes+differentiated+from+patient+iPSCs+after+genome+editing+of+the+sickle+point+mutation.">Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors.">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).</li><li>Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Doxycycline-Inducible+System+for+Genetic+Correction+of+iPSC+Disease+Models.">A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li><li>Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+human+stem+cells.">Genome editing in human stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).</li><li>Zhu, Z., Gonz&#225;lez, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis.">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li><li>Cong, L., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).</li><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+homology+directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA.">Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li><li>Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+crispr+cas9-mediated+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).</li></ol>

En este protocolo, se demuestra el uso de CRISPR-CAS9 junto con dos plantillas de reparación ssODN para generar cambios específicos del genoma heterocigoto u homocigoto en células madre pluripotentes humanas. Este método dio lugar a la generación exitosa de líneas celulares isogénicas que expresan cambios genómicos heterocigotos con una eficiencia cercana al 10%. Este protocolo ha sido optimizado tanto para ESC seres humanos como para iPSC cultivados en MEF irradiados que apoyan el crecimiento celular y la superv...

Las células madre embrionarias humanas (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son herramientas valiosas para modelar enfermedades humanas debido a su capacidad de renovación, manteniendo al mismo tiempo la capacidad de generar tipos celulares de diferentes linajes1,2 ,3,4. Estos modelos abren la posibilidad de interrogar la función génica, y entender cómo las mutaciones y fenotipos específicos están relacionados con diversas enfermedades5,6. Sin embargo, para entender cómo una alteración específica está vinculada a un fenotipo particular, el uso de un control isogénico emparejado y líneas celulares mutantes es importante controlar para la variabilidad de línea a línea7,8. Las nucleasas de efector similares a los activadores de transcripción (TALENs) y las nucleasas de dedos de zinc se han utilizado para generar mutaciones de inserción o deleción (indels) en diversos modelos genéticos, incluidas las células primarias; pero estas nucleasas pueden ser engorrosas de usar y caras9,10,11,12,13,14. El descubrimiento de la nuclearo de repetición palindrómica corta (CRISPR)-CAS9, regularmente interespaciada, ha revolucionado el campo debido a la eficiencia en la formación de indel en prácticamente cualquier región del genoma, la simplicidad de uso y la reducción del costo15 , 16 , 17 , 18 , 19.
Un desafío en el uso de la tecnología de edición del genoma basada en CRISPR-CAS9 ha sido la generación o corrección de mutaciones específicas en un alelo sin crear una mutación indel en el segundo alelo20. El objetivo principal de este protocolo es superar este desafío mediante el uso de dos plantillas de reparación de oligonucleótidos de una sola cadena (ssODN) para reducir la formación de indel en el segundo alelo. Ambos ssODN están diseñados para contener mutaciones silenciosas para evitar el re-corte por la nucleasa CAS9, pero sólo uno contiene la alteración del interés. Este método aumenta la eficiencia de generar una modificación genética heterocigota específica sin inducir la formación de indel en el segundo alelo. Usando este protocolo, los experimentos de edición de genes en seis ubicaciones genómicas independientes demuestran la introducción precisa del cambio genómico deseado en un alelo sin formación indel en el segundo alelo y se produce con una eficiencia general del 10 %. El protocolo descrito ha sido adaptado de Maguire et al.21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="705">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap</td>
			<td style="width:145px;">Corning</td>
			<td style="width:124px;">352235</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well polystyrene tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AflII restriction endonuclease</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:124px;">R0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:124px;">N605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">dNTPs</td>
			<td style="width:145px;">Roche</td>
			<td style="width:124px;">11969064001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibson Assembly Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gRNA_Cloning Vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:124px;">41824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar plates containing 50 &#956;g/ml kanamycin</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine Stem Reagent</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">(STEM00001)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine embryonic fibroblasts (MEFs)</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:124px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital shaking incubator</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">pCas9_GFP vector</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:124px;">44719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR strip tubes</td>
			<td style="width:145px;">USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5&#215; Phusion buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:124px;">K210011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:124px;">Qiagen 19133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td style="width:124px;">636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC medium</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9020S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td style="width:124px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells

Las células madre pluripotentes humanas ofrecen un potente sistema para estudiar la función génica y modelar mutaciones específicas relevantes para la enfermedad. La generación de modificaciones genéticas heterocigotos precisas es difícil debido a la formación de indel mediada por CRISPR-CAS9 en el segundo alelo. Aquí, demostramos un protocolo para ayudar a superar esta dificultad mediante el uso de dos plantillas de reparación en las que sólo una expresa el cambio de secuencia deseado, mientras que ambas plantillas contienen mutaciones silenciosas para evitar el re-corte y la formación de indel. Esta metodología es más ventajosa para que las regiones de codificación de genes del ADN generen control isogénico y líneas de células madre humanas mutantes para el estudio de enfermedades humanas y biología. Además, se han realizado metodologías de optimización de la transfección y el cribado para reducir el trabajo de parto y el costo de un experimento de edición de genes. En general, este protocolo es ampliamente aplicable a muchos proyectos de edición del genoma que utilizan el modelo de células madre pluripotentes humanas.

Generación de gRNAs y cribado para indels
Cada gRNA se clonará en un vector plásmido y se expresará utilizando el promotor U6. La enzima de restricción AflII se utiliza para linealizar el plásmido (adigeno #41824) y se encuentra después del promotor U6. La banda de 100 bp generada después de recocido los dos oligos de 60 bp se clona en el vector de expresión gRNA utilizando el ensamblaje de ADN. Una vez que se generan los plásmidos del ARNG, se transinfectan...

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Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Este protocolo proporciona un método para facilitar la generación de cambios de nucleótidos heterocigotos u homocigotos definidos utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas.

Generación de modificaciones genómicas definidas utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

El estudio de la función genética y la enfermedad se ven obstaculizados por la naturaleza de la raza de la población humana. Los diferentes antecedentes genéticos de las líneas celulares iPS específicas del paciente y del control pueden afectar la eficiencia de la diferenciación y los fenotipos que se encuentran en un ensayo funcional determinado. El uso de líneas genéticamente idénticas o isogénicas donde la única diferencia es la mutación particular de interés es fundamental para superar estos problemas.Muchas enfermedades humanas son causadas por mutaciones heterocigotas, que pueden ser difíciles de generar con el sistema CRISPR-Cas9. Esto se debe a la generación de mutaciones indel en el alelo no dirigido que pueden ocurrir a muy alta frecuencia. Nuestra técnica supera este problema mediante el uso de dos plantillas de reparación de las cuales sólo uno alberga la mutación de interés.Cualquier investigador que intente esta técnica debe ser experto en el cultivo de células madre pluripotentes humanas. La demostración en vídeo de la recolección de colonias será útil para mostrar el tamaño y la morfología correctos, así como la técnica utilizada para la recolección y el cribado. Demostrar este procedimiento será Leo Cárdenas.Para empezar, placa ESCs humanos en MEF irradiados en una placa de 6 pozos. Prepare la mezcla maestra de transfección. Mezclar en pipeteo e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.Cuando las células alcanzan 70 a 80% de confluencia, entonces, agregue la mezcla maestra de transfección gota sabia a cada pozo con las células y la incubación a 37 grados Celsius durante 48 horas. Cambie los medios cada 24 horas. Para cosechar las células, primero, incubar las células con Triple E durante tres minutos a temperatura ambiente para eliminar los MEF enzimáticamente.Añadir 0,5 mililitros de medio HESC con 10 inhibidores de ROCK micromolar. Células de pellets a 300 veces g durante tres minutos y re-suspender en 0,5 mililitros de medio ESC humano con 10 inhibidores de ROCK micromolar. Filtre la suspensión celular en un tubo de cinco mililitros a través de una tapa de colador celular de 35 micras.Usando la clasificación celular activada por fluorescencia, atenuse en las células vivas y clasifique las células positivas de proteína fluorescente verde. A continuación, transfiera un máximo de 1,5 veces 10 a las cuatro células ordenadas directamente en un plato de 10 centímetros recubierto con una a tres matrices de membrana de sótano y MEF irradiado y un medio ESC humano que contiene inhibidor de ROCK. Cambie el medio diario utilizando el medio ESC humano sin inhibidor de ROCK.Después de 10 a 15 días, las colonias tienen aproximadamente de uno a dos milímetros de diámetro. Bajo un microscopio, utilice una pipeta P200 para raspar cuidadosamente un solo clon y dibujar células en la pipeta. Dispersar las células en un pozo de una placa de 96 pozos pipeteando suavemente de tres a cuatro veces en el medio elaborado con la colonia.A continuación, escoja 20 colonias para cada ARN guía y prescinda en tubos de tira de PCR para su cribado. Pele las células por centrifugación a 10.000 veces G durante cinco minutos. Ahora, incubar gránulos celulares en 20 microlitros de proteinasa K tamponado para aislar el ADN y el vórtice vigorosamente.Centrifugar a 10.000 veces G durante cinco minutos. A continuación, realice la detección de PCR del ADN editado. Añadir en los tubos 20 microlitros de una mezcla maestra, incluyendo imprimaciones hacia adelante y hacia atrás, diseñadas para amplificar la región de interés, así como cinco microlitros del digesto Proteinase K.Utilice ADN genómico aislado de la línea iPSC de control para confirmar un amplicon limpio al realizar la PCR de cribado. Evaluar los cambios de tamaño de los productos de PCR después de una hora de electroforesis a 70 a 90 voltios en un 2,5% de peso en gel de agarosa de volumen. Cualquier diferencia de tamaño es indicativa de escote.Para transfecar el ADN oligo de una sola hebra y los plásmidos CRISPR-Cas9, plancha la línea celular diana en un plato de 6 pocillos en MEF irradiados para alcanzar el 70 a 80% de confluencia después de una incubación durante la noche. Configure la reacción de transfección como se describe. Mezclar la reacción por pipeteo e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.Luego, agregue la mezcla de reacción de transfección gota sabia a las células. Después de 48 horas, prepare las celdas para la clasificación celular como anteriormente. Aproximadamente 10 días después de enchapar células individuales, utilice una pipeta de 200 microlitros para recoger colonias en tubos de tira de PCR y en un pozo de una placa de 12 pozos pre-recubierta con gelatina y MEF.Transfiera 100 microlitros de las células a cada pozo de una placa de 24 o 48 pozos, previamente recubierta con gelatina y MEF irradiado en medio ESC humano con inhibidor de ROCK. Utilice las 100 microlitros restantes para el aislamiento del ADN. Para comprobar la integración exitosa del ADN oligo de una sola cadena, tome cinco microlitros de ADN aislados de cada colonia para realizar pcR utilizando las imprimaciones de cribado previamente diseñadas.Purificar los productos de PCR y preparar los 40 microlitros de la digestión de enzimas de restricción utilizando el sitio enzimático único creado en el ADN oligo de una sola hebra. Mezclar la reacción por pipeteo e incubar a la temperatura recomendada por el fabricante durante una a tres horas. A continuación, visualice los productos de PCR digeridos añadidos con un tinte de carga en un gel de agarosa de bromuro de etidio por volumen de 1,5% de peso, electroforese a 80 a 100 voltios durante 40 minutos.Si se ha producido una integración exitosa del ADN oligo de una sola hebra, secuenciar mutaciones específicas utilizando una imprimación anidada. En este estudio, para la construcción de ARN guía, una banda de 100 pares base fue extirpada de un gel de agarosa del 1,5%. Después de la transfección celular, se visualizó la validación del corte de ARN guía utilizando un gel de agarosa del 2,5%.Un producto PCR de par base 180 mostró un control sin cortar y diferentes clones con turnos de banda que indican la formación de indel. Diferentes ARN guía tenían diferentes eficiencias de corte. Para evitar el re-corte CRISPR-Cas9 de los alelos editados, la secuencia PAM se modificó utilizando una mutación silenciosa de G a A.Una mutación silenciosa en la secuencia PAM generó un sitio de restricción único, que ayuda a detectar una integración exitosa en uno o dos alelos. Las líneas de células madre editadas por el genoma se pueden utilizar en diferencias posteriores y ensayos funcionales para estudiar el efecto de una mutación dada en el desarrollo humano y la enfermedad. Esta metodología permite la generación de líneas celulares isogénicas con mutaciones heterocigotas o homocigotas específicas, implicadas en una amplia variedad de enfermedades humanas.Estos modelos de enfermedades allanan el camino para el desarrollo de nuevas terapias celulares, así como ofrecen plataformas para el descubrimiento de fármacos.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Usando una técnica fluorescente PCR-capilar Electroforesis en gel con el genotipo CRISPR / Cas9 mediada Knockout mutantes en un formato de alto rendimiento

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Investigación

Genética

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Generación dependiente de la selección y independiente de CRISPR / Cas9-mediada Gene Knockouts en células de mamíferos

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Trasplante de células de germen primordiales para basada en CRISPR/Cas9 Leapfrogging en Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining para modificaciones de ADN: análisis computacional de imágenes confocales

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Integración dirigida CRISPR/Cas9-mediada In Vivo mediante una estrategia basada en unirse a final mediada por homología

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Un rápido y fácil tubería para generar genómica punto mutantes de C. elegans utilizando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene edición para hacer condicionales mutantes de humano parásito de la Malaria por p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Proteína endógena Tagging en humanos inducida por células madre pluripotentes utilizando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Plataforma de vectores lentivirales para la entrega eficiente de las herramientas de edición de epigenoma en humanos inducida por modelos de enfermedad derivados de células madre pluripotentes

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...