Name: generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Denna forskning stöddes av finansiering från National Heart, lung, och blod Institute (NHLBI), National Institutes of Health genom bidrag U01HL099656 (P.G. och D.L.F.) och U01HL134696 (P.G. och D.L.F.).

1. design och konstruktion av guide RNA (gRNA)
Anmärkning: varje gRNA består av 2 60 bas par (BP) oligonukleotides som glödgas för att generera en 100 BP dubbel Stranded (DS) oligonukleotid (figur 1a-C). Tidslinjen för gRNA design, generation och testning skär verkningsgrad är cirka 2 veckor (figur 2).
<ol><li>Välj DNA-regionen av intresse att genomredigera och identifiera 3-4 23 BP sekvenser som passar form...

<ol>
	<li>Srivastava, D., Dewitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+In+Vivo+Cellular+Reprogramming:+The+Next+Generation.">Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation.</a> Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Review Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Embryonic+Stem+Cells+to+Relevant+Populations:+Lessons+from+Embryonic+Development.">Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 1-6 (2018).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Tiyaboonchai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA6+Plays+an+Important+Role+in+the+Induction+of+Human+Definitive+Endoderm,+Development+of+the+Pancreas,+and+Functionality+of+Pancreatic+&#946;+Cells.">GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic &#946; Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+hESCs+to+Probe+the+Interaction+of+the+Diabetes-Associated+Genes+CDKAL1+and+MT1E.">Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E.</a> Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Isogenic+Human+ESC+Platform+for+Functional+Evaluation+of+Genome-wide-Association-Study-Identified+Diabetes+Genes+and+Drug+Discovery.">An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+with+zinc+finger+nucleases+for+cellular+imaging.">Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging.</a> Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).</li><li>Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Modification+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Homologous+Recombination+and+CRISPR/Cas9+System.">Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System.</a> Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+gene-corrected+adult+beta+globin+protein+in+human+erythrocytes+differentiated+from+patient+iPSCs+after+genome+editing+of+the+sickle+point+mutation.">Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors.">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).</li><li>Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Doxycycline-Inducible+System+for+Genetic+Correction+of+iPSC+Disease+Models.">A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li><li>Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+human+stem+cells.">Genome editing in human stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).</li><li>Zhu, Z., Gonz&#225;lez, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis.">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li><li>Cong, L., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).</li><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+homology+directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA.">Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li><li>Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+crispr+cas9-mediated+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).</li></ol>

I detta protokoll, användning av CRISPR-CAS9 tillsammans med två ssODN reparationsmallar för att generera specifika heterozygot eller homozygot genom förändringar påvisas i humana pluripotenta stamceller. Denna metod resulterade i en lyckad generering av isogena cellinjer som uttrycker heterozygot genomiska förändringar med en verkningsgrad nära 10%. Detta protokoll har optimerats för både mänskliga ESCs och iPSCs som odlas på bestrålade MEFs som stöder celltillväxt och överlevnad efter odling av celler ...

Mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och inducerad pluripotenta stamceller (iPSCs) är värdefulla verktyg för modellering av mänskliga sjukdomar på grund av deras förmåga till förnyelse, samtidigt som förmågan att generera celltyper av olika härstamningar1,2 ,3,4. Dessa modeller öppnar möjligheten att förhöra genfunktion, och förstå hur specifika mutationer och fenotyper är relaterade till olika sjukdomar5,6. För att förstå hur en specifik förändring är kopplad till en viss fenotyp är dock användningen av en parkopplad ISOGEN kontroll och muterade cellinjer viktig för att kontrollera linje-till-linjevariationen7,8. Transkription Activator-liknande effektor nukleaser (talens) och zink finger nukleaser har använts för att generera insättning eller radering (indels) mutationer i olika genetiska modeller, inklusive primära celler; men dessa nukleaser kan vara besvärligt att använda och dyra9,10,11,12,13,14. Upptäckten av den grupperade regelbundet interfördelade korta palindrom REPEAT (CRISPR)-CAS9 Nuclease har revolutionerat området på grund av effektivitet i indel formation i praktiskt taget alla regioner i arvsmassan, enkelhet i användning, och minskning av kostnaderna15 , 16 , 17 , 18 , 19.
En utmaning i att använda den CRISPR-CAS9 baserade genom-redigeringsteknik har varit generering eller korrigering av specifika mutationer i en allel utan att skapa en indel-mutation i den andra allelen20. Det stora målet med detta protokoll är att övervinna denna utmaning genom att använda två enkelsträngade oligonukleotid (ssODN) reparationsmallar för att minska indel formation i den andra allelen. Båda ssODNs är utformade för att innehålla tysta mutationer för att förhindra omskärning av CAS9 Nuclease, men bara en innehåller förändringen av intresse. Denna metod ökar effektiviteten av att generera en specifik heterozygot genetisk modifiering utan att inducera indel formation i den andra allelen. Med hjälp av detta protokoll, genredigering experiment i sex oberoende genomisk platser visar exakt införandet av önskad genomisk förändring i en allel utan indel formation i den andra allelen och sker med en totalverkningsgrad på ~ 10%. Det beskrivna protokollet har anpassats från Maguire et al.21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="705">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap</td>
			<td style="width:145px;">Corning</td>
			<td style="width:124px;">352235</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well polystyrene tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AflII restriction endonuclease</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:124px;">R0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:124px;">N605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">dNTPs</td>
			<td style="width:145px;">Roche</td>
			<td style="width:124px;">11969064001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibson Assembly Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gRNA_Cloning Vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:124px;">41824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar plates containing 50 &#956;g/ml kanamycin</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine Stem Reagent</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">(STEM00001)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine embryonic fibroblasts (MEFs)</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:124px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital shaking incubator</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">pCas9_GFP vector</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:124px;">44719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR strip tubes</td>
			<td style="width:145px;">USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5&#215; Phusion buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:124px;">K210011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:124px;">Qiagen 19133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td style="width:124px;">636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC medium</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9020S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td style="width:124px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells

Humana pluripotenta stamceller erbjuder ett kraftfullt system för att studera genfunktion och modellspecifika mutationer relevanta för sjukdom. Generationen av exakta heterozygot genetiska modifikationer är utmanande på grund av CRISPR-CAS9 medierad indel formation i den andra allelen. Här demonstrerar vi ett protokoll för att hjälpa till att övervinna denna svårighet genom att använda två reparationsmallar där endast en uttrycker önskad sekvens förändring, medan båda mallarna innehåller tysta mutationer för att förhindra omskärning och indel formation. Denna metod är mest fördelaktig för genredigering kodnings regioner av DNA för att generera ISOGEN kontroll och muterade mänskliga stamcellslinjer för att studera mänskliga sjukdomar och biologi. Dessutom har optimering av transfektion och screeningmetoder utförts för att minska arbete och kostnader för ett genredigering experiment. Sammantaget är detta protokoll allmänt tillämpligt på många genom redigering projekt som utnyttjar den mänskliga pluripotenta stamcells modellen.

Generering av gRNAs och screening för indels
Varje gRNA kommer att klonas till en Plasmid vektor och uttrycks med hjälp av U6 promotorn. AFLII -restriktionsenzymen används för att linearisera plasmiden (addgene #41824) och ligger efter U6-arrangören. Den 100 BP band genereras efter glödgning den 2 60 BP oligos är klonade i gRNA Expression Vector med hjälp av DNA-församlingen. När grna plasmider genereras, de är transfekterade till hESCs eller iPSCs tillsamm...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Detta protokoll ger en metod för att underlätta generering av definierade heterozygot eller homozygot nukleotidförändringar med hjälp av CRISPR-CAS9 i humana pluripotenta stamceller.

Generering av definierade genomiska modifikationer med CRISPR-CAS9 i humana pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Studiet av genfunktion och sjukdom hämmas av den utavlade naturen hos den mänskliga befolkningen. De olika genetiska bakgrunderna av patient-specifika och kontroll iPS cellinjer kan påverka differentiering effektivitet och fenotyper som finns i en given funktionell analys. Användning av genetiskt identiska eller isogena linjer där den enda skillnaden är den särskilda mutation av intresse är avgörande för att övervinna dessa frågor.Många mänskliga sjukdomar orsakas av heterozygösa mutationer, som kan vara svåra att generera med CRISPR-Cas9-systemet. Detta beror på generering av indel mutationer i den icke-riktade allel som kan uppstå vid mycket hög frekvens. Vår teknik övervinner detta problem genom att använda två reparation mallar varav endast en hamnar mutationen av intresse.Varje utredare försöker denna teknik bör vara skicklig på mänskliga pluripotenta stamcellskultur. Videodemonstrationen av koloniplockning kommer att vara till hjälp för att visa korrekt storlek och morfologi samt teknik som används för plockning och screening. Demonstrera detta förfarande kommer att Leo Cardenas.Till att börja med plattan mänskliga ESCs på bestrålade MEFs i en 6-väl platta. Förbered transfektionsmästarblandningen. Blanda genom pipettering och inkubera i rumstemperatur i 15 minuter.När cellerna når 70 till 80%konfluency, sedan, tillsätt transfektion master mix droppe klokt till varje brunn med celler och inkubera vid 37 grader Celsius i 48 timmar. Byt media var 24:e timme. För att skörda cellerna, först, inkubera cellerna med Triple E i tre minuter i rumstemperatur för att ta bort MEFs enzymatiskt.Tillsätt 0,5 milliliter HESC-medium med 10 mikromolär ROCK-hämmare. Pelletsceller vid 300 gånger g i tre minuter och åter avbryta i 0,5 milliliter av humant ESC-medium med 10 mikromolar ROCK-hämmare. Filtrera cellupphängningen i ett fem milliliterrör genom en 35 mikroncellsillock.Med hjälp av fluorescens-aktiverad cellsortering, gate på levande celler och sortera de gröna fluorescerande protein-positiva cellerna. Därefter överför du maximalt 1,5 gånger 10 till de fyra sorterade cellerna direkt i en 10 centimeters skål belagd med en till tre källarmembranmatris och bestrålade MEF och humant ESC-medium som innehåller ROCK-hämmare. Byt medium dagligen med hjälp av det mänskliga ESC-mediet utan ROCK-hämmare.Efter 10 till 15 dagar är kolonier ungefär en till två millimeter i diameter. Under ett mikroskop, använd en P200-pipett för att noggrant skrapa en enda klon och dra celler in i pipetten. Skingra cellerna i en brunn av en 96-brunnsplatta genom att försiktigt pipettera tre till fyra gånger i mediet som dras upp med kolonin.Välj sedan 20 kolonier för varje guide RNA och dispensera i PCR-bandrör för screening. Pellet cellerna genom centrifugering vid 10, 000 gånger G i fem minuter. Nu, inkubera cell pellets i 20 mikroliter proteinas K buffert för att isolera DNA och virvel kraftigt.Centrifugera vid 10, 000 gånger G i fem minuter. Därefter utför screening PCR av det redigerade DNA. Lägg i rören 20 mikroliter av en master mix, inklusive framåt och omvänd primers, som syftar till att förstärka den region av intresse, samt fem mikroliter av Proteinase K smälta.Använd genomiskt DNA isolerat från kontroll iPSC-linjen för att bekräfta en ren amplicon när du utför screeningen PCR. Utvärdera storleksförändringar av PCR-produkter efter en timmes elektrofores vid 70 till 90 volt på en 2,5%vikt i volym agarosgel. Varje storleksskillnad är ett tecken på klyvning.För att transfekta den enda strängen oligo DNA och CRISPR-Cas9 plasmider, platta mållinjen i en 6-brunns skålen på bestrålade MEFs att nå 70 till 80%konfluency efter över en övernattning inkubation. Ställ in transfektionsreaktionen enligt beskrivningen. Blanda reaktionen genom pipettering och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.Tillsätt sedan transfektionsreaktionsblandningen droppe klokt till cellerna. Efter 48 timmar, förbereda cellerna för cellsortering som tidigare. Ca 10 dagar efter plätering enstaka celler, använd en 200 microliter pipett för att plocka kolonier i PCR bandrör och i en brunn av en 12-brunn tallrik pre-coated med gelatin och MEFs.Överför 100 mikroliter av cellerna till varje brunn av en 24 eller 48-brunnsplatta, som tidigare var belagd med gelatin och bestrålade MEF-filer i humant ESC-medium med ROCK-hämmare. Använd de återstående 100 mikrolitererna för DNA-isolering. För att kontrollera om den enda strängen oligo DNA integreras framgångsrikt, ta fem mikroliter DNA som isolerats från varje koloni för att utföra PCR med hjälp av de screeningprimrar som tidigare utformats.Rena PCR-produkterna och bered de 40 mikrolitererna av restriktionsenzymspjältsättning med hjälp av den unika enzymstället som skapas i den enda strängen oligo DNA. Blanda reaktionen genom pipettering och inkubera vid tillverkarens rekommenderade temperatur i en till tre timmar. Sedan visualiserar de smälta PCR-produkter som tillsätts med ett lastfärgämne på en 1,5%vikt i volymprocent ethidiumbromid agarose gel, elektrofores vid 80 till 100 volt i 40 minuter.Om framgångsrik integrering av den enda strängen oligo DNA har inträffat, sekvens specifika mutationer med hjälp av en kapslad primer. I denna studie, för guide RNA konstruktion, en 100 baspar band var strukits från en 1,5%agaros gel. Efter cell transfection, validering av guide RNA skärning visualiserades med hjälp av en 2,5%agaros gel.En 180 bas par PCR produkt visade en uncut kontroll och olika kloner med bandet skift som anger indel bildas. Olika guide RNAs hade olika nedskärningar effektivitetsvinster. För att undvika CRISPR-Cas9 re-cutting av de redigerade allelerna, ändrades PAM-sekvensen med hjälp av en G till A-tyst mutation.En tyst mutation i PAM-sekvensen genererade en unik begränsningsplats, vilket hjälper till att skärmen för framgångsrik integration i en eller två alleler. Genomredigerade stamcellslinjer kan användas i nedströmsdifferentieringar och funktionella analyser för att studera effekten av en viss mutation på människans utveckling och sjukdom. Denna metodik gör det möjligt för generering av isogena cellinjer med en specifik heterozygous eller homozygous mutationer, inblandad i en mängd olika mänskliga sjukdomar.Dessa sjukdomsmodeller banar väg för utveckling av nya cellulära terapier samt erbjuder plattformar för läkemedelsupptäckt.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Med hjälp av en fluorescerande PCR-kapillärgelelektrofores Technique att genotypa CRISPR / Cas9-medierad Knockout mutanter i en hög kapacitet Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Urval-beroende och oberoende generering av CRISPR / Cas9-medierade genknockouts i däggdjursceller

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordiala könsceller Transplantation för CRISPR/Cas9-baserade bli ledande i Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunfärgning för DNA ändringar: tillämpad analys av Confocal bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-medierad riktade Integration In Vivo som använder en homologi-medierad slutet att gå-baserad strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Högeffektiva gen störningar av murina och mänskliga hematopoetiska stamceller av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

En snabb och lättköpt Pipeline för generera genomisk punkt mutanter i C. elegans med CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen redigering till göra villkorlig mutanter av humana malariaparasiten P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogen Protein taggning i mänskliga inducerade pluripotenta stamceller med CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Lentiviral Vector plattform för effektiv distribution av epigenomet-redigeringsverktyg i mänskliga inducerade pluripotenta stamceller-derived sjukdomsmodeller

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...