Name: generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Bu araştırma, U01HL099656 (P.G. ve D.L.F.) ve U01HL134696 (P.G. ve D.L.F.) hibeleri yoluyla Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI), Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden fon la desteklenmiştir.

1. Kılavuz RNA'nın (gRNA) tasarımı ve inşası
NOT: Her gRNA, 100 bp çift iplikçikli (ds) oligonükleotid(Şekil 1A-C)oluşturmak için annealed iki 60 baz çifti (bp) oligonükleotid oluşur. gRNA tasarımı, üretimi ve test kesme verimliliği için zaman çizelgesi yaklaşık 2 haftadır(Şekil 2).
<ol><li>Genom düzenlenecek DNA bölgesini seçin ve formata uygun 3-4 23 bp dizileri tanımlayın, 5'-G(N<sub...

<ol>
	<li>Srivastava, D., Dewitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+In+Vivo+Cellular+Reprogramming:+The+Next+Generation.">Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation.</a> Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Review Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Embryonic+Stem+Cells+to+Relevant+Populations:+Lessons+from+Embryonic+Development.">Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 1-6 (2018).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Tiyaboonchai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA6+Plays+an+Important+Role+in+the+Induction+of+Human+Definitive+Endoderm,+Development+of+the+Pancreas,+and+Functionality+of+Pancreatic+&#946;+Cells.">GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic &#946; Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+hESCs+to+Probe+the+Interaction+of+the+Diabetes-Associated+Genes+CDKAL1+and+MT1E.">Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E.</a> Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Isogenic+Human+ESC+Platform+for+Functional+Evaluation+of+Genome-wide-Association-Study-Identified+Diabetes+Genes+and+Drug+Discovery.">An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+with+zinc+finger+nucleases+for+cellular+imaging.">Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging.</a> Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).</li><li>Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Modification+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Homologous+Recombination+and+CRISPR/Cas9+System.">Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System.</a> Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+gene-corrected+adult+beta+globin+protein+in+human+erythrocytes+differentiated+from+patient+iPSCs+after+genome+editing+of+the+sickle+point+mutation.">Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors.">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).</li><li>Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Doxycycline-Inducible+System+for+Genetic+Correction+of+iPSC+Disease+Models.">A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li><li>Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+human+stem+cells.">Genome editing in human stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).</li><li>Zhu, Z., Gonz&#225;lez, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis.">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li><li>Cong, L., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).</li><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+homology+directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA.">Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li><li>Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+crispr+cas9-mediated+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).</li></ol>

Bu protokolde, CRISPR-CAS9'un iki ssODN onarım şablonu ile birlikte belirli heterozigot veya homozigot genom değişiklikleri oluşturmak için kullanılması insan pluripotent kök hücrelerinde gösterilmiştir. Bu yöntem, heterozigot genomik değişiklikleri %10'a yakın bir verimlilikle ifade eden izojenik hücre hatlarının başarılı bir şekilde üretilmesiyle sonuçlandı. Bu protokol, hücre ayrıştırma sonrası düşük yoğunlukta hücre kültürlerinden sonra hücre büyümesini ve sağkalımlarını d...

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESCs) ve indüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs) insan hastalığı yenileme kapasiteleri nedeniyle modelleme için değerli araçlar, farklı soy hücre tipleri oluşturmak için yeteneğini korurken1,2 ,3,4. Bu modeller gen fonksiyonunu sorgulama imkanını açar ve spesifik mutasyonların ve fenotiplerin çeşitli hastalıklarla nasıl ilişkili olduğunuanlarlar 5,6. Ancak, belirli bir değişiklik belirli bir fenotip bağlı nasıl anlamak için, eşleştirilmiş bir iyojenik kontrol ve mutant hücre hatları nın kullanımı çizgi değişkenlik7için kontrol etmek önemlidir7 ,8. Transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleazlar (TALENs) ve çinko parmak nükleazları, birincil hücreler de dahil olmak üzere çeşitli genetik modellerde ekleme veya silme (indels) mutasyonları oluşturmak için kullanılmıştır; ama bu nükleazlar kullanmak için hantal olabilir ve pahalı9,10,11,12,13,14. Kümelenmiş düzenli olarak uzaylanmış kısa palindromik tekrarın (CRISPR)-CAS9 nükleazının keşfi, genomun hemen hemen her bölgesinde indel oluşumundaki verimlilik, kullanım kolaylığı ve maliyet15'teki azalma nedeniyle sahada devrim yarattı15 , 16.02.20 , 17.000 , 18.000 , 19. yıl.
CRISPR-CAS9 tabanlı genom düzenleme teknolojisini kullanmanın zorluğu, ikinci alel20'deindel mutasyonu yaratmadan bir aleldeki spesifik mutasyonların oluşturulması veya düzeltilmesi olmuştur. Bu protokolün temel amacı, ikinci alelinin indel oluşumunu azaltmak için iki tek iplikli oligonükleotit (ssODN) onarım şablonu kullanarak bu zorluğun üstesinden gelmektir. Her iki ssODN'ler, CAS9 nükleazının yeniden kesilmesini önlemek için sessiz mutasyonlar içerecek şekilde tasarlanmıştır, ancak sadece bir tanesi ilgi nin değişimini içerir. Bu yöntem, ikinci alelinin indel oluşumunu indüklemeden belirli bir heterozigot genetik modifikasyon oluşturma nın verimliliğini artırır. Bu protokolü kullanarak, altı bağımsız genomik lokasyonda yapılan gen düzenleme deneyleri, ikinci alelde indel oluşumu olmadan bir alelde istenilen genomik değişimin kesin olarak ortaya çıkarılabilmeyi ve ~%10 genel verimlilikle meydana geldiğini göstermektedir. Açıklanan protokol Maguire ve ark.21uyarlanmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="705">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap</td>
			<td style="width:145px;">Corning</td>
			<td style="width:124px;">352235</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well polystyrene tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AflII restriction endonuclease</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:124px;">R0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:124px;">N605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">dNTPs</td>
			<td style="width:145px;">Roche</td>
			<td style="width:124px;">11969064001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibson Assembly Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gRNA_Cloning Vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:124px;">41824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar plates containing 50 &#956;g/ml kanamycin</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine Stem Reagent</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">(STEM00001)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:124px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine embryonic fibroblasts (MEFs)</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:124px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital shaking incubator</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">pCas9_GFP vector</td>
			<td style="width:145px;">Addgene</td>
			<td style="width:124px;">44719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR strip tubes</td>
			<td style="width:145px;">USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5&#215; Phusion buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:124px;">K210011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:124px;">Qiagen 19133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td style="width:124px;">636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC medium</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9020S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:124px;">12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td style="width:124px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of defined genomic modifications using crispr-cas9 in human pluripotent stem cells

İnsan pluripotent kök hücreleri gen fonksiyonunu incelemek ve hastalığa özgü mutasyonları modellemek için güçlü bir sistem sunar. İkinci alelde CRISPR-CAS9 aracılı indel oluşumu nedeniyle hassas heterozigot genetik modifikasyonların oluşturulması zordur. Burada, her iki şablon da yeniden kesme ve indel oluşumunu önlemek için sessiz mutasyonlar içerirken, yalnızca bir tanesinin istenen sıra değişikliğini ifade ettiği iki onarım şablonu kullanarak bu zorluğun üstesinden gelinmesine yardımcı olacak bir protokol gösteriyoruz. Bu metodoloji, insan hastalığı ve biyoloji sinaması için isojenik kontrol ve mutant insan kök hücre hatları oluşturmak için DNA'nın gen düzenleme kodlama bölgeleri için en avantajlı yöntemdir. Buna ek olarak, transfeksiyon ve tarama metodolojilerinin optimizasyonu, gen düzenleme deneyinin işçiliğini ve maliyetini azaltmak için gerçekleştirilmiştir. Genel olarak, bu protokol yaygın insan pluripotent kök hücre modeli kullanan birçok genom düzenleme projeleri için geçerlidir.

GRNA'ların üretimi ve indels için tarama
Her gRNA bir plazmid vektör içine klonlanmış olacak ve U6 organizatörü kullanılarak ifade edilecektir. AflII restriksiyon enzimi plazmidi doğrusallaştırmak için kullanılır (addgene #41824) ve U6 organizatöründen sonra bulunur. İki 60 bp oligonun karıştırıldıktan sonra oluşturulan 100 bp bandı, DNA montajı kullanılarak gRNA ekspresyon vektörüne klonlanır. GRNA plazmidleri oluşturulduktan sonra CRI...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinde CRISPR-CAS9 kullanılarak tanımlanmış heterozigot veya homozigot nükleotid değişikliklerinin oluşumunu kolaylaştıracak bir yöntem sağlar.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Gen fonksiyonu ve hastalık çalışmaları insan nüfusunun dışlanmış doğası tarafından engellenir. Hastaya özgü ve kontrol iPS hücre hatlarının farklı genetik arka planlar farklılaşma verimliliği ve belirli bir fonksiyonel tetkik bulunan fenotipler etkileyebilir. Tek farkın ilginin belirli mutasyonu olduğu genetik olarak özdeş veya iyojenik çizgilerin kullanımı bu sorunların üstesinden gelmek için önemlidir.Birçok insan hastalığı, CRISPR-Cas9 sistemi ile üretilmesi zor olan heterozigot mutasyonlardan kaynaklanır. Bunun nedeni, çok yüksek frekansta meydana gelebilen hedefsiz alellerdeki indel mutasyonlarının oluşmasıdır. Tekniğimiz, sadece bir tanesinin ilgi çekici mutasyonu barındıran iki onarım şablonu kullanarak bu sorunun üstesinden gelebilmektedir.Bu tekniği deneyen herhangi bir araştırmacı insan pluripotent kök hücre kültüründe yetenekli olmalıdır. Koloni toplama video gösteri doğru boyut ve morfoloji yanı sıra toplama ve tarama için kullanılan tekniği göstermek için yararlı olacaktır. Bu prosedürü gösteren Leo Cardenas olacaktır.Başlamak için, 6 kuyulu bir plaka içinde ışınlanmış MEFs üzerinde plaka insan ESCs. Transfection master karışımını hazırlayın. Pipetleme ile karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.Hücreler % 70-80 biraraya ulaştığında, daha sonra, transfection master karışımı damla hücreleri ile her kuyuya akıllıca damla ekleyin ve 48 saat boyunca 37 santigrat derece kuluçka. Her 24 saatte bir medyayı değiştirin. Hücreleri hasat etmek için, ilk olarak, enzimatik MEFs kaldırmak için oda sıcaklığında üç dakika boyunca Triple E ile hücreleri kuluçka.10 mikromolar ROCK inhibitörü ile HESC orta 0,5 mililitre ekleyin. Pelet hücreleri 300 kez g üç dakika ve 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile insan ESC orta 0,5 mililitre yeniden askıya. Hücre süspansiyonuna 35 mikronluk bir süzgeç kapağından beş mililitrelik bir tüpe süzün.Floresan aktive hücre sıralama kullanarak, canlı hücrelerüzerinde kapı ve yeşil floresan protein-pozitif hücreleri sıralamak. Daha sonra, 1-3 bazal membran matris ve ışınlanmış MEFs ve insan ESC orta ROCK inhibitörü içeren ile kaplanmış 10 santimetre lik bir çanak doğrudan dört sıralanmış hücrelere 1,5 kez 10 maksimum aktarın. ROCK inhibitörü olmadan insan ESC ortamını kullanarak her gün ortayı değiştirin.10-15 gün sonra kolonilerin çapı yaklaşık 1-2 milimetredir. Mikroskop altında, tek bir klonu dikkatlice kazımak ve hücreleri pipetin içine çekmek için P200 pipetkullanın. Hücreleri 96 kuyuluk bir kuyuda, koloniyle birlikte hazırlanan ortamda 3-4 kez hafifçe borulandırarak dağıtın.Sonra, her kılavuz RNA için 20 koloni seçin ve tarama için PCR şerit tüpleri içine dağıtmak. Beş dakika boyunca 10,000 kez G'de santrifüj ile hücreleri pelet. Şimdi, 20 mikrolitre proteinaz K tamponundaki hücre peletlerini kuluçkaya yatırArak DNA ve girdapları şiddetle izole edin.Santrifüj 10,000 kez G beş dakika. Daha sonra, düzenlenmiş DNA'nın PCR taramasını gerçekleştirin. Tüpler içine 20 mikrolitre ana karışımı ekleyin, ileri ve ters astarlar da dahil olmak üzere, ilgi bölgesini yükseltmek için tasarlanmış, yanı sıra Proteinase K sindirimi beş mikrolitre.Tarama PCR yaparken temiz bir amplicon onaylamak için kontrol iPSC hattından izole genomik DNA kullanın. PCR ürünlerinin bir saatlik elektroforezini 70-90 volt tan sonra hacim agarose jeli ile %2,5 ağırlıkta değerlendirin. Herhangi bir boyut farkı dekolte göstergesidir.Tek iplikçik oligo DNA'sını ve CRISPR-Cas9 plazmidlerini nakletmek için, hedef hücre hattını, bir gecede kuluçkadan sonra %70 ila %80'lik bir araya gelmek için ışınlanmış MEF'ler üzerinde 6 kuyulu bir tabakta plakalayın. Transfeksiyon reaksiyonu açıklandığı gibi ayarlayın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca pipetleme ve kuluçka ile reaksiyonu karıştırın.Sonra, hücrelere akıllıca transfection reaksiyon karışımı damla ekleyin. 48 saat sonra, hücreleri daha önce olduğu gibi hücre sıralamaiçin hazırlayın. Tek hücreleri kaplamaktan yaklaşık 10 gün sonra, 200 mikrolitrelik pipet kullanarak PCR şerit tüplere kolonileri ve jelatin ve MEF'lerle önceden kaplanmış 12 kuyulu bir plaka kuyusunun içine yerleştirin.Daha önce jelatin ve ıŞıNlanmış MEF'ler ile daha önce kaplanmış 24 veya 48 kuyulu bir plakanın her kuyuya 100 mikrolitre hücre aktarımı. DNA izolasyonu için kalan 100 mikrolitreyi kullanın. Tek iplikçikli oligo DNA'sının başarılı entegrasyonunu kontrol etmek için, her koloniden izole edilmiş beş mikrolitre DNA alın ve daha önce tasarlanmış tarama astarlarını kullanarak PCR'yi gerçekleştirin.PCR ürünlerini arındırın ve tek iplikçikli oligo DNA'sında oluşturulan benzersiz enzim bölgesini kullanarak 40 mikrolitre kısıtlama enzimi sindirimi hazırlayın. Bir ila üç saat boyunca üreticinin tavsiye edilen sıcaklıkta pipetleme ve kuluçka ile reaksiyonkarıştırın. Daha sonra, hacim ethidium bromür agarose jel, elektrofore 80-100 volt 40 dakika ile% 1.5 ağırlık bir yükleme boya sıyrık ile eklenen sindirilmiş PCR ürünleri görselleştirin.Tek iplikçikli oligo DNA'sının başarılı entegrasyonu gerçekleşmişse, iç içe olmuş bir astar kullanarak diziye özgü mutasyonlar meydana gelir. Bu çalışmada, kılavuz RNA yapımı için 100 baz çifti bandı %1.5 agarose jelden çıkarıldı. Hücre transfeksiyonu sonrasında kılavuz RNA kesiminin doğrulaması %2.5 agarose jel kullanılarak görselleştirildi.180 baz çifti PCR ürünü, kesilmemiş bir kontrol ve bant kaymaları ile indel oluşumunu gösteren farklı klonlar gösterdi. Farklı kılavuz RNA'ların farklı kesme verimleri vardı. CRISPR-Cas9'un düzenlenmiş alellerin yeniden kesilmesini önlemek için PAM dizisi G'den A'ya sessiz mutasyon kullanılarak değiştirildi.PAM dizisindeki sessiz bir mutasyon, bir veya iki alelile başarılı bir entegrasyon için tarama ya da yardımcı benzersiz bir kısıtlama sitesi oluşturdu. Genomda düzenlenmiş kök hücre hatları, belirli bir mutasyonun insan gelişimi ve hastalığı üzerindeki etkisini incelemek için aşağı akım farklılaştırmalarında ve fonksiyonel tahlillerde kullanılabilir. Bu metodoloji, insan hastalıklarının geniş bir yelpazede karıştığı belirli bir heterozigot veya homozigot mutasyonlar ile izojenik hücre hatlarının oluşumunu sağlar.Bu hastalık modelleri yeni hücresel tedavilerin geliştirilmesinin yanı sıra ilaç keşfi için platformlar da sunmaktadır.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

CRISPR genotipine bir Floresan PCR kılcal jel elektroforezi Tekniği / yüksek verimli bir Format Nakavt Mutants Cas9 aracılı

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

CRISPR/Cas9-tabanlı Xenopus Leapfrogging için ilkel Germ hücre transplantasyonu

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

DNA değişiklikler için Immunostaining: Confocal görüntülerin sayısal analiz

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit P. falciparum için

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endojen Protein insan etiketleme Pluripotent kök hücre kullanarak CRISPR/Cas9 indüklenen

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...