Name: a simple approach to perform teer measurements using a self-made volt-amperemeter with programmable output frequency
Uploaded: 2019-10-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency at JoVE.com

Die Autoren danken Herman Liggesmeyer und Marvin Bende für ihre fachkundige Beratung in Elektrotechnik und Informatik.

1. Montage eines Grundvolt-Amperemeters zur TEER-Messung
<ol><li>Bereiten Sie ein Standard-USB-Ladegerät als 5 V D.C. Netzteil, ein USB-Verlängerungskabel, ein Mikrocontroller, der als programmierbarer Rechteckgenerator verwendet werden, zwei Standard-Multimeter, die in der Lage sind, Wechselstrom und Spannung als Wurzel mittelförmiges Quadrat zu messen ( True-RMS), vier Kabel mit Bananensteckern, ein Telefonverlängerungskabel mit rJ14-Buchse mit sechs Pins mit den inneren vier verdrahteten (6P4C), zwei kurzen Kabe...

<ol>
	<li>Matter, K., Balda, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+tight+junctions.">Functional analysis of tight junctions.</a> Methods. 30, 228-234 (2003).</li><li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems.">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).</li><li>Daniels, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+human+cerebral+microvascular+endothelial+cells+maintain+the+properties+of+primary+cells+in+an+in+vitro+model+of+immune+migration+across+the+blood+brain+barrier.">Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier.</a> Journal of Neuroscience Methods. 212, 173-179 (2013).</li><li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 19, 1872-1874 (2005).</li><li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-enhanced,+multicellular+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+stem+cell+sources.">A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources.</a> Scientific Reports. 4, 4160 (2014).</li><li>Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+invasion+and+transcytosis+in+transfected+human+brain+microvascular+endothelial+cells.">Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells.</a> Microbial Pathogenesis. 30, 19-28 (2001).</li><li>Muruganandam, A., Herx, L. M., Monette, R., Durkin, J. P., Stanimirovic, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+immortalized+human+cerebromicrovascular+endothelial+cell+line+as+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier.">Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 11, 1187-1197 (1997).</li><li>Ishiwata, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+malignant+choroids+plexus+papilloma+cell+line+(HIBCPP).">Establishment and characterization of a human malignant choroids plexus papilloma cell line (HIBCPP).</a> Human Cell. 18, 67-72 (2005).</li><li>Dinner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Choroid+Plexus+Epithelial+Cell-based+Model+of+the+Human+Blood-Cerebrospinal+Fluid+Barrier+to+Study+Bacterial+Infection+from+the+Basolateral+Side.">A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li><li>Schwerk, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+invasion+and+translocation+of+Neisseria+meningitidis+and+Streptococcus+suis+in+a+novel+human+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier.">Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in a novel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> PLoS One. 7, e30069 (2012).</li><li>Tenenbaum, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+bacterial+invasion+and+translocation+of+Streptococcus+suis+across+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+vitro.">Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro.</a> Cellular Microbiology. 11, 323-336 (2009).</li><li>Gath, U., Hakvoort, A., Wegener, J., Decker, S., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+choroid+plexus+cells+in+culture:+expression+of+polarized+phenotype,+maintenance+of+barrier+properties+and+apical+secretion+of+CSF-components.">Porcine choroid plexus cells in culture: expression of polarized phenotype, maintenance of barrier properties and apical secretion of CSF-components.</a> European Journal of Cell Biology. 74, 68-78 (1997).</li><li>Haselbach, M., Wegener, J., Decker, S., Engelbertz, C., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+Choroid+plexus+epithelial+cells+in+culture:+regulation+of+barrier+properties+and+transport+processes.">Porcine Choroid plexus epithelial cells in culture: regulation of barrier properties and transport processes.</a> Microscopy Research and Technique. 52, 137-152 (2001).</li><li>Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+blood-brain+interfaces+in+relation+to+brain+disposition+of+small+compounds+and+macromolecules.">Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules.</a> Molecular Pharmaceutics. 10, 1473-1491 (2013).</li><li>Hilgendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caco-2+versus+Caco-2/HT29-MTX+co-cultured+cell+lines:+permeabilities+via+diffusion,+inside-+and+outside-directed+carrier-mediated+transport.">Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 89, 63-75 (2000).</li><li>Mathia, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+characteristics+of+calu-3+human+bronchial+epithelial+cells:+in+vitro-in+vivo+correlation+to+predict+lung+absorption+in+rats.">Permeability characteristics of calu-3 human bronchial epithelial cells: in vitro-in vivo correlation to predict lung absorption in rats.</a> Journal of Drug Targeting. 10, 31-40 (2002).</li><li>Fuchs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+alveolar+epithelial+cells+in+primary+culture:+morphological+characterization+and+synthesis+of+caveolin-1+and+surfactant+protein-C.">Differentiation of human alveolar epithelial cells in primary culture: morphological characterization and synthesis of caveolin-1 and surfactant protein-C.</a> Cell and Tissue Research. 311, 31-45 (2003).</li><li>Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+endothelial+cell+monolayers+that+restrict+the+transendothelial+passage+of+macromolecules+and+electrical+current.">Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1033-1041 (1984).</li><li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+(Caco-2)+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability.">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).</li><li>Yeste, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+correction+factor+for+transepithelial+electrical+resistance+measurements+in+Transwell+and+microfluidic+cell+cultures.">Geometric correction factor for transepithelial electrical resistance measurements in Transwell and microfluidic cell cultures.</a> Journal of Physics D Applied Physics. 49 (37), 3754 (2016).</li><li>Northrup, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VI:+The+Measurement+of+Low+Resistance.">VI: The Measurement of Low Resistance.</a> Methods of Measuring Electrical Resistance. , 100-131 (1912).</li><li>Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+electrical+measurements+with+the+Ussing+chamber.">Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 3 (Suppl 2), 123-126 (2004).</li><li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BBB+on+chip:+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function.">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15, 145-150 (2013).</li><li>Esch, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+chip+porous+polymer+membranes+for+integration+of+gastrointestinal+tract+epithelium+with+microfluidic+'body-on-a-chip'+devices.">On chip porous polymer membranes for integration of gastrointestinal tract epithelium with microfluidic 'body-on-a-chip' devices.</a> Biomedical Microdevices. 14, 895-906 (2012).</li><li>. Arduino Web Editor Available from: <a target="_blank" href="https://www.arduino.cc/en/Main/Software">https://www.arduino.cc/en/Main/Software</a> (2019)</li><li>Benson, K., Cramer, S., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance-based+cell+monitoring:+barrier+properties+and+beyond.">Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10, 5 (2013).</li><li>Hufnagl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Time Resolved Transepithelial Impedance Spectroscopy Of Caco 2 Monolayers Relying on Lithographically Patterned Basolateral Electrode Cell Arrays. , (2010).</li><li>Guimer&#224;, A., Gabriel, G., Parramon, D., Calder&#243;n, E., Villa, R., D&#246;ssel, O., Schlegel, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable+4+Wire+Bioimpedance+Meter+with+Bluetooth+Link.">Portable 4 Wire Bioimpedance Meter with Bluetooth Link.</a> World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. International Federation of Medical and Biological Engineering Proceedings. 25/7, (2009).</li></ol>

Bevor ein selbstgebautes Voltammeter in einer täglichen Routine verwendet werden kann, ist es wichtig, das Gerät auf die ordnungsgemäße Funktion zu überprüfen. In unserem Fall wurde eine Halbzeitschwingung von 40 ms (12,5 Hz) programmiert, aber die effektive Schwingungszeit betrug 60 ms (16,7 Hz). Diese Ungenauigkeit des Zeitemitters des Mikrocontrollers hatte keine nachweisbaren Auswirkungen auf TEER-Messungen. Es könnte am besten sein, die tatsächliche Frequenz mithilfe der Frequenzeinstellung eines der Multime...

Epithel- und Endothelzellen fungieren als zelluläre Grenzen, die die apikalen und basolateralen Seiten des Körpers trennen. Wenn sie durch enge Knoten verbunden sind, wird die passive Substanzdiffusion durch die parazellulären Räume eingeschränkt1, was zur Bildung einer selektiv durchlässigen Barriere führt. Mehrere künstliche Barrieresysteme wurden2 mit mikrovaskulären Endothelzellen (HBMEC, Blut-Hirn-Schranke3,4,5,6,7), Aderhautplexus entwickelt Epithelzellen (HIBCPP/PCPEC, Blut-Zerebrospinalflüssigkeitsbarriere8,9,10,11,12,13,14), kolorektalen Adenokarzinomzellen (Caco-2, Gastrointestinale Modelle15), oder Atemwegs-/Alveolarzelllinien (Lungenmodelle16,17). Diese Systeme bestehen in der Regel aus Zellen, die in einer Monoschicht auf durchlässigen Membranen (d. h. Filtereinsatzsystemen) angebaut werden, um den Zugang zu den apikalen und basolateralen Seiten zu ermöglichen. Es ist wichtig, dass die Integrität des Modellsystems den in vivo-Bedingungen entspricht. Daher wurden verschiedene Techniken entwickelt, um die Barrierefunktion zu analysieren, indem parazelluläre Diffusion von Tracerverbindungen über die Zellschicht gemessen wird. Zu diesen Stoffen gehören radioaktiv markierte Saccharose, farbstoffmarkiertes Albumin, FITC-markiertes Inulin oder mit Farbstoff gekennzeichnetes Dextrans2. Chemische Farbstoffe können jedoch Zellen für weitere Experimente unbrauchbar machen. Zur Nichtinvasiven Überwachung von Barrieresystemen kann die Messung des transepitheliaalen/transendotheliaalen elektrischen Widerstands (TEER) über eine zelluläre Monoschicht2,18,19verwendet werden. Da bipolare Elektrodensysteme durch die Elektrodenpolarisationsimpedanz an der Elektroden-Elektrolyt-Schnittstelle beeinflusst werden, werden tetrapolare Messungen in der Regel verwendet, um diese Einschränkung zu überwinden20. Die Unterlagetechnik ist eine vierterminale Sensorik (4T), die erstmals 1861 von William Thomson (Lord Kelvin)21beschrieben wurde. Kurz gesagt, wird der Strom durch ein Paar stromtragender Elektroden injiziert, während ein zweites Paar spannungsempfindlicher Elektroden verwendet wird, um den Spannungsabfall20zu messen. Heute bestehen sogenannte Essstäbchenelektroden aus einem Paar Doppelelektroden, die jeweils ein Silber/Silberchlorid-Pellet zur Spannungsmessung und eine Silberelektrode zum Passieren des Stroms2enthalten. Die elektrische Impedanz wird zwischen dem apikalen und dem basolateralen Fach mit der Zellschicht dazwischen gemessen (Abbildung 1). An den äußeren Elektroden wird ein Rechtecksignal mit einer Frequenz von typischerweise 12,5 Hz aufgebracht und der resultierende Wechselstrom (AC) gemessen. Zusätzlich wird der potenzielle Tropfen über die Zellschicht durch das zweite (innere) Elektrodenpaar gemessen. Die elektrische Impedanz wird dann nach Ohms Gesetz berechnet. TEER-Werte werden durch Multiplikation der Impedanz und der Zellschichtoberfläche normalisiert und werden in der Regel in der Zeit als cm2ausgedrückt.
Es gibt Systeme, in denen Zellen und Elektroden ausgefeilter angeordnet sind, aber auch auf dem 4T-Messprinzip basieren und mit den gleichen Messgeräten eingesetzt werden können. EndOhm-Systeme, bei denen der Filter eingesetzt wird, enthalten beispielsweise eine Kammer und eine Kappe mit einem Paar konzentrischer Elektroden mit der gleichen Struktur wie die Esssstiftelektrode. Die Form der Elektroden ermöglicht einen gleichmäßigeren Stromdichtefluss über die Membran, wodurch die Streuung zwischen den Messwerten reduziert wird. Noch komplexer (aber auch genauer) ist eine Ussing-Kammer, in der eine Zellschicht zwei Kammern trennt, die mit Ringers Lösung22gefüllt sind. Die Kammer selbst kann mit Sauerstoff,CO2oderN2vergast und gerührt oder mit Experimentellen Stoffen ergänzt werden. Wenn der Ionentransport über die Zellschicht erfolgt, kann ein potenzieller Unterschied durch zwei spannungsempfindliche Elektroden in der Nähe des Gewebes gemessen werden. Diese Spannung wird durch zwei stromführende Elektroden, die neben der Zellschicht platziert werden, aufgehoben. Der gemessene Strom gibt dann den Netzionentransport und der transepitheliale Widerstand, der die Barriereintegrität widerspiegelt, kann bestimmt werden22. TEER-Messungen können auch auf Body-on-a-Chip-Systeme angewendet werden, die Barrieregewebemodelle23,24darstellen. Diese Systeme imitieren in vivo Bedingungen der Zellen und bestehen oft aus mehreren Arten von Zellen, übereinander in Schichten gestapelt.
Im folgenden Protokoll wird erläutert, wie ein kostengünstiges und zuverlässiges Voltammeter mit programmierbarer Ausgangsfrequenz eingerichtet wird, das keine statistisch signifikanten Unterschiede in TEER im Vergleich zu handelsüblichen Messsystemen erzeugt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>120 kOhm resistor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Banana plug cables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chopstick electrode</td>
			<td>Merck Millicell</td>
			<td>MERSSTX01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chopstick electrode (alternative)</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>STX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crimping tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digispark / ATtiny85</td>
			<td>AZ-Delivery Vertriebs GmbH</td>
			<td>Digispark Rev.3 Kickstarter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco (Thermo Fisher)</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter inserts 3&#181;m translucent</td>
			<td>Greiner Bioone</td>
			<td>662631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIBCPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulation stripper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luster terminal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>HAMEG</td>
			<td>Digital Storage Scope HM 208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plotter</td>
			<td>PHILIPS</td>
			<td>PM 8143 X-Y recorder</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Arduino</td>
			<td>https://www.arduino.cc</td>
			<td>Arduino 1.8.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering lugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test resistor</td>
			<td>Merck Millicell</td>
			<td>MERSSTX04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True-RMS multimeters</td>
			<td>VOLTCRAFT</td>
			<td>VC185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB charger</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB extension cord</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltohmmeter for TEER measurement</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltohmmeter for TEER measurement (alternative)</td>
			<td>Merck Millicell</td>
			<td>ERS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire end ferrules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple approach to perform teer measurements using a self-made volt-amperemeter with programmable output frequency

Transepitheliale/endotheliale elektrische Beständigkeit (TEER) wird seit den 1980er Jahren verwendet, um die Konfluenz und Durchlässigkeit von In-vitro-Barrieremodellsystemen zu bestimmen. In den meisten Fällen werden Essstäbchenelektroden verwendet, um die elektrische Impedanz zwischen dem oberen und unteren Fach eines Zellkulturfiltereinsatzsystems zu bestimmen, das zelluläre Monolayer enthält. Die Filtermembran ermöglicht es den Zellen, durch den Bau enger Knoten zu haften, zu polarisieren und zu interagieren. Diese Technik wurde mit einer Vielzahl von verschiedenen Zelllinien beschrieben (z. B. Zellen der Blut-Hirn-Schranke, Blut-Zerebrospinal-Flüssigkeitsbarriere, oder Magen-Darm-und Lungentrakt). TEER Messgeräte können leicht von verschiedenen Laborgerätelieferanten bezogen werden. Es gibt jedoch kostengünstigere und anpassbare Lösungen, die sich vorstellen können, wenn ein geeignetes Voltammeter selbst montiert wird. Das übergeordnete Ziel dieser Publikation ist die Einrichtung eines zuverlässigen Gerätes mit programmierbarer Ausgangsfrequenz, das mit handelsüblichen Essstäbchenelektroden für die TEER-Messung verwendet werden kann.

Um den Betrieb eines selbstmontierten Voltammeters mit seinem handelsüblichen Pendant zu vergleichen, wurde ein Spannungs-Oszillatometer beider Geräte aufgezeichnet.
Wie in Abbildung 2Adargestellt, erzeugte das Referenzinstrument ein Rechtecksignal mit einer Amplitude von 80 mV und einer Schwingungszeit von 80 ms, was einer Frequenz von 12,5 Hz entspricht, wenn es mit einem 1 k-Testwiderstand ...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency at JoVE.com

A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency

Hier zeigen wir, wie man ein kostengünstiges Volt-Amperemeter mit programmierbarer Ausgangsfrequenz aufstellt, das mit handelsüblichen Essstäbchenelektroden für transepitheliale/endotheliale elektrische Widerstandsmessungen verwendet werden kann.

Ein einfacher Ansatz zur Durchführung von TEER-Messungen mit einem selbst gefertigten Volt-Amperemeter mit programmierbarer Ausgangsfrequenz

Transepithelial/endothelial electrical resistance (TEER) has been used since the 1980s to determine confluency and permeability of in vitro barrier model ...

Die Messung der transepitheliaalen elektrischen Impedanz wird seit den 1980er Jahren verwendet, um die Konfluenz und Barrierefunktion von epitheliaalen Monolayern in der Zellkultur zu bestimmen. Die zugrunde liegende Technik ist eine vier-Terminal-Sensorik, die verschiedene Paare von stromführenden und spannungsführenden Elektroden verwendet, um genauere Messungen zu machen. Es gibt mehrere handelsübliche Geräte zur Messung der transepitheliale Impedanz, aber trotz der Benutzerfreundlichkeit und der hohen Zuverlässigkeit gibt es auch einige Nachteile wie die nicht übersetzbare Ausgangsfrequenz und ihre Teuerkeit.So stellen wir dar, wie man ein kostengünstiges und programmierbares Volt-Amperemeter baut. Zunächst wollen wir zeigen, wie TEER-Messungen mit handelsüblichen Geräten funktionieren. Dazu hatten wir eine Zellschicht aus Aderhautplexusepithelioal-Papillomazellen auf Transwell-Filtern mit einer Porengröße von drei Mikrometern kultiviert.Diese Einstellung wurde von Schroten et al. als In-vitro-Modell der Blut-Zerebrospinal-Flüssigkeitsbarriere beschrieben. Nun ist eine Essstäbchenelektrode mit einem Epithelvoltammeter verbunden.Das Gerät ist eingeschaltet und eingestellt, um den Widerstand zu messen. Die Elektrode wird in 80% Ethanol sterilisiert und anschließend in einem geeigneten Medium ausglichen. Die zu messende Impedanz dient als Referenzwert, um die Zuverlässigkeit des Volt-Amperemeters zu bewerten, das anschließend montiert wird.In diesem Beispiel zeichnen wir eine Impedanz von 680 Ohm auf. Beginnen wir mit der Montage eines Low-Budget-Volt-Amperemeters mit programmierbarer Ausgangsfrequenz. Zuallererst benötigen Sie ein Standard-USB-Ladegerät und ein USB-Verlängerungskabel als Gleichstrom-Netzteil mit fünf Volt.Ein 8-Bit-Mikrocontroller auf einem USB-Entwicklungsboard wird dann verwendet, um einen quadratischen Wellenstrom zu erzeugen. Vier Kabel mit Bananensteckern sind an zwei Standardmultimeter angeschlossen, um Spannung und Strom zu messen. Bitte stellen Sie sicher, dass die Multimeter in der Lage sind, Strom in einem Bereich von einigen Mikroamperen mit TrueRMS zu messen.Ein buchser RJ14-Stecker befindet sich auf Standard-Telefonkabeln. Stellen Sie einfach sicher, dass der Stecker sechs Stifte hat, von denen mindestens die inneren vier verdrahtet sind. Schließlich benötigen Sie einige Standardausrüstung, wie unsere Kabel, ein Glanzterminal, einen 120 Kiloohm Widerstand und einige Werkzeuge als Isolationstripper, ein Crimpwerkzeug, Drahtende-Ferrules und Lötkolben.Das Gerät wird genau wie im Layout-Diagramm dargestellt montiert. Zunächst wird die USB-Erweiterung an den Mikrocontroller angeschlossen. Während des normalen Betriebs wird es von einem Fünf-Volt-DC-USB-Ladegerät angetrieben, das leicht an einen PC zur Programmierung angeschlossen werden kann.Zwei Kabel werden auf einer Seite abgestreift und mit Drahtend-Ferrules gekräust. Die andere Seite wird entweder direkt an Pin Null und zwei des Mikrocontrollers oder an Lötschuhe gelötet, die wiederum auf die jeweiligen Stifte geknipst werden. Als nächstes werden die stromliefernden Kabel an ein Glanzterminal angeschlossen.Das erste Multimeter wird zur Messung des Stroms verwendet und ist in Reihe mit 120 Kiloohm Widerstand und einer stromdurchlaufenden Essstäbchenelektroden verbunden. Diese Anordnung stellt sicher, dass der Ausgangsstrom begrenzt ist, so dass die Messung keine Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit hat. Die vier Leiter des Telefonverlängerungskabels werden demontiert und wie zuvor gezeigt an Ferrules gekräuscht.Sobald das Kabel vorbereitet ist, müssen Sie die Kontinuität der Leiter und Stifte testen. In unserem Beispiel sind Pin drei bis sechs mit dem weißen, braunen, grünen und gelben Leiter verbunden. Jetzt sind Pin fünf und sechs, also grün und gelb, mit der Glanzklemme verbunden, um Spannung auf das äußere Elektrodenpaar anzuwenden.Schließlich müssen Sie das zweite Multimeter, das verwendet wird, um den transepitheliale Spannungsabfall zu messen, an die Pins drei und vier anschließen, d. h. in unserem Beispiel an den weißen und braunen Leiter. Wir haben uns entschieden, die Installation in einem billigen Kunststoff-Chassis zu montieren. Vor der ersten Verwendung muss der Mikrocontroller programmiert werden.Der Quellcode ist in C+ geschrieben und kann über einen USB-Stick hochgeladen werden. Kurz gesagt, pin zero in einen mittleren Ausgabemodus. Wenn eingeschaltet, beginnt die Funktionsschleife als Pins zwischen Masse und plus fünf Volt mit variabler Verzögerung zu wechseln.In unserem Beispiel haben wir eine theoretische Halbschwingungszeit von 40 Millisekunden verwendet. Sehen wir uns an, wie sich die Messergebnisse mit den zuvor ermittelten Referenzwerten vergleichen. Die Essstäbchenelektrode wird auf das kürzlich montierte Volt-Ammeter neu positioniert.Das Gerät wird in drei Schritten eingeschaltet. Das heißt, ein USB-Ladegerät anschließen, das linke Multimeter auf AC-Spannungsmessung umstellen und das zweite Multimeter auf Mikroampere umschalten. Achten Sie darauf, dass Wechselstrom explizit ausgewählt werden muss.In diesem Beispiel wird der potenzielle Abfall über das Transwell-Filtersystem als etwa 25 Millivolt gemessen, während wir einen Strom von 37,1 Mikroamperen aufzeichnen. Nach Ohms Gesetz kann die elektrische Impedanz leicht mit 674 Ohm berechnet werden, was sehr nahe am Referenzwert von 680 liegt. Wir haben gezeigt, dass Messwerte über einen Bereich von null bis 1,8 Kiloohm zuverlässig sind.Somit kann das beschriebene Voltamperemeter sowohl für erste Experimente als auch für weitere Studien verwendet werden. Wenn Ihre Ergebnisse jedoch veröffentlicht werden sollen, sollten Sie Ihre Daten immer unterstützen, indem Sie den Molekülfluss über die jeweilige Zellschicht messen.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Electrical Engineering

Biology

Unit 1

Direct-Current Circuits

Basics of Electric Circuits

SCIENTISTS IN ACTION

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

Mikrofabrizierten Post-Array-Detektoren (mPADs): Ein Ansatz zur Mechanical Forces Isolate

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated ...

Forschung

Biologie

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

Machen Patch-Pipetten und Sharp Elektroden mit einem programmierbaren Puller

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades.  Today, such pipettes are made from glass capillaries ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

Immunzytochemische Analyse von menschlichen pluripotenten Stammzellen mit Hilfe eines Self-Made Cytospin Apparatus

Human pluripotent stem cells (hPSCs) that include human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are exciting cell ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Ein Reverse Genetic Ansatz zur funktionellen Redundanz während der Embryogenese-Test

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability

FSL Konstrukte: Eine einfache Methode für das Ändern von Cell / Virion Oberflächen mit einer Reihe von biologischen Markern, ohne die Durchführung

The ability to modify/visualize biological surfaces, and then study the modified cell/virion in a range of in vitro and in vivo environments is essential ...

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Ein semi-quantitativer Ansatz, um die Biofilmbildung Mit Wrinkled Colony Entwicklung zu bewerten

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

Transgenen Nager Assay zur Quantifizierung von männlichen Keimzellmutantenhäufigkeit

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module

Verwenden von Maus-Brusttumorzellen Kern Biology Concepts Lehren: A Simple Lab Module

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualizing Stromulus Frequenz mit Fluoreszenzmikroskopie

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...