Name: a simple approach to perform teer measurements using a self-made volt-amperemeter with programmable output frequency
Uploaded: 2019-10-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare Herman Liggesmeyer e Marvin Bende per la loro consulenza di esperti in elettrotecnica e informatica.

1. Assemblaggio di un terrore di base per la misurazione TEER
<ol><li>Preparare un caricabatterie USB standard come alimentatore 5 V D.C., un cavo di estensione USB, un microcontrollore che verrà utilizzato come un generatore di onde quadrate programmabile, due multimetri standard che sono in grado di misurare la corrente alternata e la tensione come radice media quadrata ( True-RMS), quattro cavi con spine di banana, un cavo di interno telefonico con un connettore femminile RJ14 tra cui sei pin con i quattro cavi int...

<ol>
	<li>Matter, K., Balda, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+tight+junctions.">Functional analysis of tight junctions.</a> Methods. 30, 228-234 (2003).</li><li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems.">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).</li><li>Daniels, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+human+cerebral+microvascular+endothelial+cells+maintain+the+properties+of+primary+cells+in+an+in+vitro+model+of+immune+migration+across+the+blood+brain+barrier.">Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier.</a> Journal of Neuroscience Methods. 212, 173-179 (2013).</li><li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 19, 1872-1874 (2005).</li><li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-enhanced,+multicellular+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+stem+cell+sources.">A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources.</a> Scientific Reports. 4, 4160 (2014).</li><li>Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+invasion+and+transcytosis+in+transfected+human+brain+microvascular+endothelial+cells.">Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells.</a> Microbial Pathogenesis. 30, 19-28 (2001).</li><li>Muruganandam, A., Herx, L. M., Monette, R., Durkin, J. P., Stanimirovic, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+immortalized+human+cerebromicrovascular+endothelial+cell+line+as+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier.">Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 11, 1187-1197 (1997).</li><li>Ishiwata, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+malignant+choroids+plexus+papilloma+cell+line+(HIBCPP).">Establishment and characterization of a human malignant choroids plexus papilloma cell line (HIBCPP).</a> Human Cell. 18, 67-72 (2005).</li><li>Dinner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Choroid+Plexus+Epithelial+Cell-based+Model+of+the+Human+Blood-Cerebrospinal+Fluid+Barrier+to+Study+Bacterial+Infection+from+the+Basolateral+Side.">A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li><li>Schwerk, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+invasion+and+translocation+of+Neisseria+meningitidis+and+Streptococcus+suis+in+a+novel+human+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier.">Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in a novel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> PLoS One. 7, e30069 (2012).</li><li>Tenenbaum, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+bacterial+invasion+and+translocation+of+Streptococcus+suis+across+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+vitro.">Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro.</a> Cellular Microbiology. 11, 323-336 (2009).</li><li>Gath, U., Hakvoort, A., Wegener, J., Decker, S., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+choroid+plexus+cells+in+culture:+expression+of+polarized+phenotype,+maintenance+of+barrier+properties+and+apical+secretion+of+CSF-components.">Porcine choroid plexus cells in culture: expression of polarized phenotype, maintenance of barrier properties and apical secretion of CSF-components.</a> European Journal of Cell Biology. 74, 68-78 (1997).</li><li>Haselbach, M., Wegener, J., Decker, S., Engelbertz, C., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+Choroid+plexus+epithelial+cells+in+culture:+regulation+of+barrier+properties+and+transport+processes.">Porcine Choroid plexus epithelial cells in culture: regulation of barrier properties and transport processes.</a> Microscopy Research and Technique. 52, 137-152 (2001).</li><li>Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+blood-brain+interfaces+in+relation+to+brain+disposition+of+small+compounds+and+macromolecules.">Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules.</a> Molecular Pharmaceutics. 10, 1473-1491 (2013).</li><li>Hilgendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caco-2+versus+Caco-2/HT29-MTX+co-cultured+cell+lines:+permeabilities+via+diffusion,+inside-+and+outside-directed+carrier-mediated+transport.">Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 89, 63-75 (2000).</li><li>Mathia, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+characteristics+of+calu-3+human+bronchial+epithelial+cells:+in+vitro-in+vivo+correlation+to+predict+lung+absorption+in+rats.">Permeability characteristics of calu-3 human bronchial epithelial cells: in vitro-in vivo correlation to predict lung absorption in rats.</a> Journal of Drug Targeting. 10, 31-40 (2002).</li><li>Fuchs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+alveolar+epithelial+cells+in+primary+culture:+morphological+characterization+and+synthesis+of+caveolin-1+and+surfactant+protein-C.">Differentiation of human alveolar epithelial cells in primary culture: morphological characterization and synthesis of caveolin-1 and surfactant protein-C.</a> Cell and Tissue Research. 311, 31-45 (2003).</li><li>Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+endothelial+cell+monolayers+that+restrict+the+transendothelial+passage+of+macromolecules+and+electrical+current.">Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1033-1041 (1984).</li><li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+(Caco-2)+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability.">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).</li><li>Yeste, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+correction+factor+for+transepithelial+electrical+resistance+measurements+in+Transwell+and+microfluidic+cell+cultures.">Geometric correction factor for transepithelial electrical resistance measurements in Transwell and microfluidic cell cultures.</a> Journal of Physics D Applied Physics. 49 (37), 3754 (2016).</li><li>Northrup, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VI:+The+Measurement+of+Low+Resistance.">VI: The Measurement of Low Resistance.</a> Methods of Measuring Electrical Resistance. , 100-131 (1912).</li><li>Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+electrical+measurements+with+the+Ussing+chamber.">Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 3 (Suppl 2), 123-126 (2004).</li><li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BBB+on+chip:+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function.">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15, 145-150 (2013).</li><li>Esch, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+chip+porous+polymer+membranes+for+integration+of+gastrointestinal+tract+epithelium+with+microfluidic+'body-on-a-chip'+devices.">On chip porous polymer membranes for integration of gastrointestinal tract epithelium with microfluidic 'body-on-a-chip' devices.</a> Biomedical Microdevices. 14, 895-906 (2012).</li><li>. Arduino Web Editor Available from: <a target="_blank" href="https://www.arduino.cc/en/Main/Software">https://www.arduino.cc/en/Main/Software</a> (2019)</li><li>Benson, K., Cramer, S., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance-based+cell+monitoring:+barrier+properties+and+beyond.">Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10, 5 (2013).</li><li>Hufnagl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Time Resolved Transepithelial Impedance Spectroscopy Of Caco 2 Monolayers Relying on Lithographically Patterned Basolateral Electrode Cell Arrays. , (2010).</li><li>Guimer&#224;, A., Gabriel, G., Parramon, D., Calder&#243;n, E., Villa, R., D&#246;ssel, O., Schlegel, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable+4+Wire+Bioimpedance+Meter+with+Bluetooth+Link.">Portable 4 Wire Bioimpedance Meter with Bluetooth Link.</a> World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. International Federation of Medical and Biological Engineering Proceedings. 25/7, (2009).</li></ol>

Prima che un voltametro autoprodotto possa essere utilizzato in una routine quotidiana, è essenziale controllare il dispositivo per il corretto funzionamento. Nel nostro caso, un mezzo tempo di oscillazione di 40 ms (12,5 Hz) è stato programmato, ma il tempo di oscillazione effettivo si è rivelato essere 60 ms (16,7 Hz). Questa imprecisione dell'emettitore di tempo del microcontrollore non ha avuto alcun impatto rilevabile sulle misurazioni TEER. Potrebbe essere meglio determinare la frequenza effettiva utilizzando l'...

Le cellule epiteliali ed endoteliali funzionano come confini cellulari, separando i lati apicali e basolaterali del corpo. Se sono collegati attraverso giunzioni strette, la diffusione passiva della sostanza attraverso gli spazi paracellulari è limitata1, con conseguente formazione di una barriera selettivamente permeabile. Diversi sistemi di barriera artificiale sono stati sviluppati2 utilizzando cellule endoteliali microvascolari (HBMEC, barriera emato-encefalica3,4,5,6,7), plexus coroide cellule epiteliali (HIBCPP/PCPEC, barriera del liquido emato-cerebrospinale8,9,10,11,12,13,14), cellule adenocarcinoma colorettali (Caco-2, modelli gastrointestinali15) o linee cellulari delle vie aeree/alveolari (modellipolmonari 16,17). Questi sistemi sono in genere costituiti da cellule coltivate in un monostrato su membrane permeabili (cioè sistemi di inserimento filtranti) per consentire l'accesso ai lati apicali e basolaterali. È importante che l'integrità del sistema modello corrisponda alle condizioni in vivo. Di conseguenza, sono state sviluppate diverse tecniche per analizzare la funzione della barriera misurando la diffusione paracellulare di composti tracciari in tutto lo strato cellulare. Queste sostanze includono saccarosio radioetichettato, albumina con etichettatura colorante, inulina etichettata FITC o dextrans2con etichettatura colorante. Tuttavia, i coloranti chimici possono rendere le cellule inutilizzabili per ulteriori esperimenti. Per monitorare in modo non invasivo i sistemi di barriera, è possibile utilizzare la misurazione della resistenza elettrica transepitelia/transendotiliale (TEER) su un mostrato cellulare2,18,19. Poiché i sistemi elettrodi bipolari sono influenzati dall'impedimento della polarizzazione degli elettrodi nell'interfaccia elettrodi-elettrolita, le misurazioni tetrapolari sono generalmente utilizzate per superare questa limitazione20. La tecnica di posa è un rilevamento a quattro terminali (4T) che è stato descritto per la prima volta nel 1861 da William Thomson (Lord Kelvin)21. In breve, la corrente viene iniettata da una coppia di elettrodi che trasportano corrente, mentre una seconda coppia di elettrodi di rilevamento della tensione viene utilizzata per misurare la caduta di tensione20. Al giorno d'oggi, i cosiddetti elettrodi di bacchetta consistono in un paio di doppi elettrodi, ciascuno contenente un pellet argento/argento-cloruro per misurare la tensione e un elettrodo d'argento per passare la corrente2. L'impementazione elettrica viene misurata tra il compartimento apicale e il compartimento basolaterale con lo strato di cella in mezzo (Figura 1). Un segnale d'onda quadra a una frequenza di typically 12,5 Hz viene applicato agli elettrodi esterni e la corrente alternata risultante (AC) misurata. Inoltre, la potenziale caduta nello strato cellulare viene misurata dalla seconda coppia di elettrodi (interni). L'impedimento elettrico viene quindi calcolato secondo la legge di Ohm. I valori di TEER sono normalizzati moltiplicando impedimento e superficie dello strato cellulare e sono in genere espressi come cm 2.
Ci sono sistemi in cui le cellule e gli elettrodi sono disposti in modo più sofisticato, ma sono anche basati sul principio di misurazione 4T e possono essere utilizzati con gli stessi dispositivi di misurazione. I sistemi EndOhm, ad esempio, in cui è inserito il filtro, contengono una camera e un cappuccio con un paio di elettrodi concentrici con la stessa struttura dell'elettrodo della bacchetta. La forma degli elettrodi consente un flusso di densità di corrente più uniforme attraverso la membrana, riducendo così la variazione tra le letture. Ancora più complessa (ma anche più precisa) è una camera Ussing, dove uno strato di cellule separa due camere piene di soluzione di Ringer22. La camera stessa può essere gassata con ossigeno, CO2o N2e mescolata o integrata con sostanze sperimentali. Quando si verifica il trasporto io-io attraverso lo strato cellulare, una differenza potenziale può essere misurata da due elettrodi di rilevamento della tensione vicino al tessuto. Questa tensione viene cancellata da due elettrodi che trasportano corrente posizionati accanto allo strato cellulare. La corrente misurata darà quindi il trasporto iollegrafico netto e la resistenza transeteliale, che riflette l'integrità della barriera, può essere determinata22. La misurazione TEER può essere applicata anche su sistemi body-on-a-chip che rappresentano modelli di tessuto di barriera23,24. Questi sistemi imitano le condizioni in vivo delle cellule e spesso consistono in diversi tipi di cellule, impilate l'una sull'altra in strati.
Il protocollo seguente spiega come impostare un misuratore di calcolo affidabile e conveniente con una frequenza di output programmabile che non produca differenze statisticamente significative nel TEER rispetto ai sistemi di misurazione disponibili in commercio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>120 kOhm resistor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Banana plug cables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chopstick electrode</td>
			<td>Merck Millicell</td>
			<td>MERSSTX01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chopstick electrode (alternative)</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>STX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crimping tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digispark / ATtiny85</td>
			<td>AZ-Delivery Vertriebs GmbH</td>
			<td>Digispark Rev.3 Kickstarter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco (Thermo Fisher)</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter inserts 3&#181;m translucent</td>
			<td>Greiner Bioone</td>
			<td>662631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIBCPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulation stripper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luster terminal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>HAMEG</td>
			<td>Digital Storage Scope HM 208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plotter</td>
			<td>PHILIPS</td>
			<td>PM 8143 X-Y recorder</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Arduino</td>
			<td>https://www.arduino.cc</td>
			<td>Arduino 1.8.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering lugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test resistor</td>
			<td>Merck Millicell</td>
			<td>MERSSTX04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True-RMS multimeters</td>
			<td>VOLTCRAFT</td>
			<td>VC185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB charger</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB extension cord</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltohmmeter for TEER measurement</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltohmmeter for TEER measurement (alternative)</td>
			<td>Merck Millicell</td>
			<td>ERS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire end ferrules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple approach to perform teer measurements using a self-made volt-amperemeter with programmable output frequency

La resistenza elettrica transeteliale/endoteliale (TEER) è stata utilizzata fin dagli anni '80 per determinare la confluenza e la permeabilità dei sistemi modello di barriera in vitro. Nella maggior parte dei casi, gli elettrodi delle bacchette vengono utilizzati per determinare l'impedimento elettrico tra il compartimento superiore e inferiore di un sistema di inserimento del filtro di coltura cellulare contenente monostrati cellulari. La membrana del filtro consente alle cellule di aderire, polarizzare e interagire costruendo giunzioni strette. Questa tecnica è stata descritta con una varietà di diverse linee cellulari (ad esempio, cellule della barriera emato-encefalica, barriera del liquido emato-cerebrospinale, o tratto gastrointestinale e polmonare). I dispositivi di misura TEER possono essere facilmente ottenuti da diversi fornitori di apparecchiature di laboratorio. Tuttavia, ci sono soluzioni più convenienti e personalizzabili immaginabili se un voltametro appropriato è auto-assemblato. L'obiettivo generale di questa pubblicazione è quello di creare un dispositivo affidabile con una frequenza di uscita programmabile che possa essere utilizzato con elettrodi di bacchetta disponibili in commercio per la misurazione TEER.

Per confrontare il funzionamento di un voltametro auto-assemblato con la sua controparte disponibile in commercio, è stato registrato un oscillogramma di tensione di entrambi i dispositivi.
Come mostrato nella Figura 2A, lo strumento di riferimento ha generato un segnale di onda quadra con un'ampiezza di 80 mV e un tempo di oscillazione di 80 ms, che corrisponde a una frequenza di 12,5 Hz, quan...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency at JoVE.com

A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency

Qui, dimostriamo come impostare un mitemetro a volt poco costoso con frequenza di uscita programmabile che può essere utilizzato con elettrodi bacchette disponibili in commercio per misurazioni transepiteliali/endoteliali di resistenza elettrica.

Un approccio semplice per eseguire misurazioni TEER utilizzando un Amperemetro Volt-Amperemeter self-made con frequenza di uscita programmabile

Transepithelial/endothelial electrical resistance (TEER) has been used since the 1980s to determine confluency and permeability of in vitro barrier model ...

La misurazione dell'impedenza elettrica transepiteliale è stata utilizzata dagli anni '80 per determinare la confluenza e la funzione barriera dei monostrati epiteliali nella coltura cellulare. La tecnica sottostante è un rilevamento a quattro terminali che utilizza diverse coppie di elettrodi che trasportano corrente e rilevamento della tensione per effettuare misurazioni più accurate. Esistono diversi dispositivi disponibili in commercio per misurare l'impedenza transepiteliale, ma nonostante la facilità d'uso e l'elevata affidabilità, ci sono anche alcuni svantaggi come la frequenza di uscita non traducibile e la loro costosità.Pertanto, rappresentiamo come costruire un volt-ametro economico e programmabile. All'inizio, vogliamo mostrare come funziona la misurazione TEER con dispositivi disponibili in commercio. Per fare ciò, avevamo coltivato uno strato cellulare di cellule del papilloma epiteliale del plesso coroideo sui filtri Transwell con una dimensione dei pori di tre micrometri.Questa impostazione è stata descritta da Schroten et al. Ora, un elettrodo a bacchetta è collegato a un volt-ammetro epiteliale.Il dispositivo è acceso e impostato per misurare la resistenza. L'elettrodo viene sterilizzato in 80% di etanolo e successivamente equilibrato in un mezzo appropriato. L'impedenza da misurare servirà come valore di riferimento al fine di valutare l'affidabilità del volt-amperometro che verrà assemblato in seguito.In questo esempio, registriamo un'impedenza di 680 ohm. Iniziamo con l'assemblaggio di un volt-ametro a basso budget con frequenza di uscita programmabile. Prima di tutto, avrai bisogno di un caricabatterie USB standard e di una prolunga USB come alimentatore a corrente diretta a cinque volt.Un microcontroller a 8 bit su una scheda di sviluppo USB verrà quindi utilizzato per generare una corrente ad onda quadra. Quattro cavi con tappi di banana sono collegati a due multimetri standard per misurare tensione e corrente. Assicurarsi che i multimetri siano in grado di misurare la corrente in una gamma di alcuni microampere con TrueRMS.Un connettore RJ14 femmina si trova sui cavi telefonici standard. Assicurati solo che il connettore abbia sei pin di cui almeno i quattro interni sono cablati. Infine, avrai bisogno di alcune attrezzature standard, come i nostri cavi, un terminale di lucentezza, un resistore da 120 kilohm e alcuni strumenti come spogliarelliste isolanti, uno strumento di crimpatura, ferrules a filo e ferro da saldare.Il dispositivo viene assemblato esattamente come illustrato nel diagramma di layout. All'inizio, l'estensione USB è collegata al microcontroller. Durante il normale funzionamento, è alimentato da un caricabatterie USB DC a cinque volt, che può essere facilmente collegato a un personal computer per la programmazione.Due cavi vengono spogliati e crimpati con ferrules di estremità del filo su un lato. L'altro lato viene saldato direttamente per fissare zero e due del microcontrollore o per saldare le anse, che a loro volta vengono ritagliate sui rispettivi perni. Successivamente, i cavi di erogazione dell'alimentazione sono collegati a un terminale di lucentezza.Il primo multimetro sarà utilizzato per misurare la corrente ed è collegato in serie con resistore da 120 kilohm e elettrodi a bacchetta che passano la corrente. Questa disposizione garantisce che la corrente di uscita sia limitata, quindi la misurazione non avrà alcun impatto sulla vitalità cellulare. I quattro conduttori della prolunga del telefono vengono smontati e crimpati alle ferrules come mostrato in precedenza.Una volta preparato il cavo, dovrai testare la continuità di conduttori e perni. Nel nostro esempio, il perno da tre a sei è collegato al conduttore bianco, marrone, verde e giallo. Ora i pin cinque e sei, che sono verdi e gialli, sono collegati al terminale della lucentezza per applicare tensione alla coppia di elettrodi esterni.Infine, dovrai collegare il secondo multimetro, che verrà utilizzato per misurare la caduta di tensione transepiteliale, ai pin tre e quattro, cioè, nel nostro esempio, al conduttore bianco e marrone. Abbiamo deciso di montare l'installazione in un telaio in plastica economico. Prima del primo utilizzo, il microcontrollore deve essere programmato.Il codice sorgente è scritto in C+e può essere caricato da un USB. In breve, aggiungi zero in una modalità di uscita centrale. Quando è acceso, il ciclo di funzione inizierà ad alternarsi come pin tra terra e più cinque volt con un ritardo variabile.Nel nostro esempio, abbiamo usato un tempo teorico di semi-oscillazione di 40 millisecondi. Vediamo come i risultati della misurazione si confrontano con i valori di riferimento che avevamo ottenuto in precedenza. L'elettrodo della bacchetta viene riposizionato nel volt-ametro recentemente assemblato.Il dispositivo viene acceso in tre passaggi. Cioè, collegando un caricabatterie USB, cambiando il multimetro sinistro alla misurazione della tensione CA e passando il secondo multimetro al microampere. Attenzione, che la corrente alternata deve essere selezionata esplicitamente.In questo esempio, la caduta potenziale attraverso il sistema di filtri Transwell viene misurata come circa 25 millivolt, mentre registriamo una corrente di 37,1 microampere. Secondo la legge di Ohm, l'impedenza elettrica può essere facilmente calcolata a 674 ohm, che è molto vicino al valore di riferimento di 680. Abbiamo dimostrato che i valori di misurazione sono affidabili su un intervallo da zero a 1,8 kiloohm.Pertanto, il volt-ametro descritto può essere utilizzato sia per esperimenti iniziali che per ulteriori studi. Tuttavia, se i risultati devono essere pubblicati, potresti sempre voler supportare i tuoi dati, misurando il flusso di molecole attraverso il rispettivo strato cellulare.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Electrical Engineering

Biology

Unit 1

Direct-Current Circuits

Basics of Electric Circuits

SCIENTISTS IN ACTION

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

Microfabbricazione post-Array-Detector (mPADs): un approccio per isolare le forze meccaniche

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated ...

Ricerca

Biologia

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

Rendendo Patch-pipette e Elettrodi Sharp con un estrattore programmabile

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades.  Today, such pipettes are made from glass capillaries ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

Analisi immunocitochimica di cellule staminali umane pluripotenti usando un Self-Made Apparato Cytospin

Human pluripotent stem cells (hPSCs) that include human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are exciting cell ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Un approccio inverso di test genetici per ridondanza funzionale durante l&#39;embriogenesi

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability

FSL Costruisce: un metodo semplice per la modifica di Cell / Virion Superfici con una gamma di marcatori biologici senza compromettere la loro vitalità

The ability to modify/visualize biological surfaces, and then study the modified cell/virion in a range of in vitro and in vivo environments is essential ...

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Un approccio semi-quantitativo per valutare la formazione di biofilm mediante lo sviluppo spiegazzato Colony

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

Transgenici Roditore Assay per quantificare Maschio cellule germinali Mutant Frequenza

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module

Utilizzando il mouse cellule tumorali mammarie per insegnare concetti di biologia di base: un modulo di laboratorio semplice

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualizzazione Frequenza Stromule con microscopia a fluorescenza

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...