Name: a simple approach to perform teer measurements using a self-made volt-amperemeter with programmable output frequency
Uploaded: 2019-10-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency at JoVE.com

Författarna vill tacka Herman Liggesmeyer och Marvin Bende för deras expertråd inom elektroteknik och informatik.

1. montering av en grundläggande volt-amperemeter för TEER mätning
<ol><li>Förbered en vanlig USB-laddare som 5 V DC strömförsörjning, en USB förlängningssladd, en mikrokontroller som kommer att användas som en programmerbar kvadrat våg generator, två standard multimetrar som kan mäta växelström och spänning som root mean Square ( True-RMS), fyra kablar med Banana pluggar, en telefon förlängningssladd med en RJ14 hona kontakt med sex stift med de fyra inre kabelanslutna (6P4C), två korta kablar, en L...

<ol>
	<li>Matter, K., Balda, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+tight+junctions.">Functional analysis of tight junctions.</a> Methods. 30, 228-234 (2003).</li><li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems.">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).</li><li>Daniels, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+human+cerebral+microvascular+endothelial+cells+maintain+the+properties+of+primary+cells+in+an+in+vitro+model+of+immune+migration+across+the+blood+brain+barrier.">Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier.</a> Journal of Neuroscience Methods. 212, 173-179 (2013).</li><li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 19, 1872-1874 (2005).</li><li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-enhanced,+multicellular+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+stem+cell+sources.">A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources.</a> Scientific Reports. 4, 4160 (2014).</li><li>Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+invasion+and+transcytosis+in+transfected+human+brain+microvascular+endothelial+cells.">Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells.</a> Microbial Pathogenesis. 30, 19-28 (2001).</li><li>Muruganandam, A., Herx, L. M., Monette, R., Durkin, J. P., Stanimirovic, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+immortalized+human+cerebromicrovascular+endothelial+cell+line+as+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier.">Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 11, 1187-1197 (1997).</li><li>Ishiwata, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+malignant+choroids+plexus+papilloma+cell+line+(HIBCPP).">Establishment and characterization of a human malignant choroids plexus papilloma cell line (HIBCPP).</a> Human Cell. 18, 67-72 (2005).</li><li>Dinner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Choroid+Plexus+Epithelial+Cell-based+Model+of+the+Human+Blood-Cerebrospinal+Fluid+Barrier+to+Study+Bacterial+Infection+from+the+Basolateral+Side.">A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li><li>Schwerk, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+invasion+and+translocation+of+Neisseria+meningitidis+and+Streptococcus+suis+in+a+novel+human+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier.">Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in a novel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> PLoS One. 7, e30069 (2012).</li><li>Tenenbaum, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+bacterial+invasion+and+translocation+of+Streptococcus+suis+across+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+vitro.">Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro.</a> Cellular Microbiology. 11, 323-336 (2009).</li><li>Gath, U., Hakvoort, A., Wegener, J., Decker, S., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+choroid+plexus+cells+in+culture:+expression+of+polarized+phenotype,+maintenance+of+barrier+properties+and+apical+secretion+of+CSF-components.">Porcine choroid plexus cells in culture: expression of polarized phenotype, maintenance of barrier properties and apical secretion of CSF-components.</a> European Journal of Cell Biology. 74, 68-78 (1997).</li><li>Haselbach, M., Wegener, J., Decker, S., Engelbertz, C., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+Choroid+plexus+epithelial+cells+in+culture:+regulation+of+barrier+properties+and+transport+processes.">Porcine Choroid plexus epithelial cells in culture: regulation of barrier properties and transport processes.</a> Microscopy Research and Technique. 52, 137-152 (2001).</li><li>Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+blood-brain+interfaces+in+relation+to+brain+disposition+of+small+compounds+and+macromolecules.">Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules.</a> Molecular Pharmaceutics. 10, 1473-1491 (2013).</li><li>Hilgendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caco-2+versus+Caco-2/HT29-MTX+co-cultured+cell+lines:+permeabilities+via+diffusion,+inside-+and+outside-directed+carrier-mediated+transport.">Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 89, 63-75 (2000).</li><li>Mathia, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+characteristics+of+calu-3+human+bronchial+epithelial+cells:+in+vitro-in+vivo+correlation+to+predict+lung+absorption+in+rats.">Permeability characteristics of calu-3 human bronchial epithelial cells: in vitro-in vivo correlation to predict lung absorption in rats.</a> Journal of Drug Targeting. 10, 31-40 (2002).</li><li>Fuchs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+alveolar+epithelial+cells+in+primary+culture:+morphological+characterization+and+synthesis+of+caveolin-1+and+surfactant+protein-C.">Differentiation of human alveolar epithelial cells in primary culture: morphological characterization and synthesis of caveolin-1 and surfactant protein-C.</a> Cell and Tissue Research. 311, 31-45 (2003).</li><li>Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+endothelial+cell+monolayers+that+restrict+the+transendothelial+passage+of+macromolecules+and+electrical+current.">Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1033-1041 (1984).</li><li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+(Caco-2)+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability.">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).</li><li>Yeste, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+correction+factor+for+transepithelial+electrical+resistance+measurements+in+Transwell+and+microfluidic+cell+cultures.">Geometric correction factor for transepithelial electrical resistance measurements in Transwell and microfluidic cell cultures.</a> Journal of Physics D Applied Physics. 49 (37), 3754 (2016).</li><li>Northrup, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VI:+The+Measurement+of+Low+Resistance.">VI: The Measurement of Low Resistance.</a> Methods of Measuring Electrical Resistance. , 100-131 (1912).</li><li>Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+electrical+measurements+with+the+Ussing+chamber.">Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 3 (Suppl 2), 123-126 (2004).</li><li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BBB+on+chip:+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function.">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15, 145-150 (2013).</li><li>Esch, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+chip+porous+polymer+membranes+for+integration+of+gastrointestinal+tract+epithelium+with+microfluidic+'body-on-a-chip'+devices.">On chip porous polymer membranes for integration of gastrointestinal tract epithelium with microfluidic 'body-on-a-chip' devices.</a> Biomedical Microdevices. 14, 895-906 (2012).</li><li>. Arduino Web Editor Available from: <a target="_blank" href="https://www.arduino.cc/en/Main/Software">https://www.arduino.cc/en/Main/Software</a> (2019)</li><li>Benson, K., Cramer, S., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance-based+cell+monitoring:+barrier+properties+and+beyond.">Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10, 5 (2013).</li><li>Hufnagl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Time Resolved Transepithelial Impedance Spectroscopy Of Caco 2 Monolayers Relying on Lithographically Patterned Basolateral Electrode Cell Arrays. , (2010).</li><li>Guimer&#224;, A., Gabriel, G., Parramon, D., Calder&#243;n, E., Villa, R., D&#246;ssel, O., Schlegel, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable+4+Wire+Bioimpedance+Meter+with+Bluetooth+Link.">Portable 4 Wire Bioimpedance Meter with Bluetooth Link.</a> World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. International Federation of Medical and Biological Engineering Proceedings. 25/7, (2009).</li></ol>

Innan en egentillverkad voltammeter kan användas i en daglig rutin, är det viktigt att kontrolleraenheten för korrekt funktion. I vårt fall, en halvtid av svängning av 40 MS (12,5 Hz) programmerades, men den effektiva svängning tiden visade sig vara 60 ms (16,7 Hz). Denna felaktigheter i MicroController ' s Time EMITTER hade ingen detekterbar inverkan på TEER mätningar. Det kan vara bäst att bestämma den faktiska frekvensen med hjälp av frekvensinställningen för en av multimetrarna. Om någon avvikelse hitta...

Epitelial och endotelceller fungerar som cellulära gränser, separera apikala och basolaterala sidor av kroppen. Om de är anslutna genom täta korsningar, passiv substans diffusion genom paracellulära utrymmen är begränsad1, vilket resulterar i bildandet av en selektivt permeabel barriär. Flera konstgjorda barriär system har utvecklats2 använda mikrovaskulära endotelceller (hbmec, blod-hjärnbarriären3,4,5,6,7), plexus koroidea epitelceller (hibcpp/pcpec, blod-cerebrospinalvätska barriär8,9,10,11,12,13,14), adenocarcinom i kolorektal (Caco-2, gastrointestinala modeller15), eller luftvägarna/alveolära cellinjer (pulmonella modeller16,17). Dessa system består vanligtvis av celler som odlas i en enskiktslager på permeabla membran (dvs., filter infoga system) för att ge tillgång till den apikala och basolaterala sidor. Det är viktigt att modell systemets integritet överensstämmer med in vivo-villkoren. Därför har flera tekniker utvecklats för att analysera barriärfunktion genom att mäta paracellulär diffusion av spårämnen över cell skiktet. Dessa ämnen inkluderar radiomärkt sackaros, Dye-märkt albumin, FITC-märkta inulin, eller Dye-märkt dextrans2. Men kemiska färgämnen kan göra celler oanvändbara för ytterligare experiment. För att övervaka barriär system noninvasively, mätning av transepitelial/transendothelial elektriskt motstånd (TEER) över en cellulär enskiktslager kan användas2,18,19. Eftersom bipolär elektrod system påverkas av elektroden polarisering impedansen vid elektrod-elektrolyt gränssnitt, tetrapolära mätningar används i allmänhet för att övervinna denna begränsning20. Den underutnings teknik är en fyra-terminal avkänning (4T) som först beskrevs i 1861 av William Thomson (Lord Kelvin)21. I korthet injiceras strömmen av ett par strömbärande elektroder medan ett andra par spännings Avkännings elektroder används för att mäta spänningsfallet20. Numera, så kallade chopstick elektroder består av ett par dubbla elektroder, vardera innehåller en Silver/Silver-klorid pellet för mätning av spänning och en silver elektrod för att passera nuvarande2. Den elektriska impedansen mäts mellan det apikala och det basolaterala facket med cell skiktet däremellan (figur 1). En fyrkantig vågsignal med en frekvens av typiskt 12,5 Hz appliceras på de yttre elektroderna och den resulterande växelströmmen (AC) mätt. Dessutom mäts potentiell droppe över cell skiktet med det andra (inre) elektrod paret. Elektrisk impedans beräknas sedan enligt Ohms lag. TEER värden normaliseras genom att multiplicera impedans och cell lager yta och uttrycks vanligen som Ω ∙ cm2.
Det finns system där celler och elektroder är ordnade på ett mer sofistikerat sätt, men är också baserade på 4T-mätprincipen och kan användas med samma mätutrustning. EndOhm system, till exempel, där filtret är insatt, innehåller en kammare och mössa med ett par koncentriska elektroder med samma struktur som chopstick elektroden. Elektrodernas form möjliggör en jämnare strömtäthet över membranet, vilket minskar variationen mellan avläsningarna. Ännu mer komplex (men också mer exakt) är en Ussing kammare, där ett cellskikt separerar två kammare fyllda med Ringers lösning22. Kammaren själv kan gasas med syre, CO2, eller N2, och rörs eller kompletteras med experimentella substanser. Eftersom jontransporten över cell skiktet sker kan en potentiell skillnad mätas med två spännings Avkännings elektroder nära vävnaden. Denna spänning avbryts av två strömbärande elektroder placerade bredvid cell skiktet. Den uppmätta strömmen kommer då att ge netto jontransporten och transepitelial resistens, som återspeglar barriär integritet, kan bestämmas22. TEER mätning kan också appliceras på Body-on-a-chip system som representerar barriär-vävnadsmodeller23,24. Dessa system efterliknar in vivo förhållanden i cellerna och består ofta av flera typer av celler, staplade ovanpå varandra i lager.
Följande protokoll förklarar hur man ställer in en kostnadseffektiv och tillförlitlig voltameter med programmerbar utgångsfrekvens som inte ger några statistiskt signifikanta skillnader i TEER jämfört med kommersiellt tillgängliga mätsystem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>120 kOhm resistor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Banana plug cables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chopstick electrode</td>
			<td>Merck Millicell</td>
			<td>MERSSTX01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chopstick electrode (alternative)</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>STX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crimping tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digispark / ATtiny85</td>
			<td>AZ-Delivery Vertriebs GmbH</td>
			<td>Digispark Rev.3 Kickstarter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco (Thermo Fisher)</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter inserts 3&#181;m translucent</td>
			<td>Greiner Bioone</td>
			<td>662631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIBCPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulation stripper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luster terminal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>HAMEG</td>
			<td>Digital Storage Scope HM 208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plotter</td>
			<td>PHILIPS</td>
			<td>PM 8143 X-Y recorder</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Arduino</td>
			<td>https://www.arduino.cc</td>
			<td>Arduino 1.8.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering lugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test resistor</td>
			<td>Merck Millicell</td>
			<td>MERSSTX04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True-RMS multimeters</td>
			<td>VOLTCRAFT</td>
			<td>VC185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB charger</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB extension cord</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltohmmeter for TEER measurement</td>
			<td>WPI World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltohmmeter for TEER measurement (alternative)</td>
			<td>Merck Millicell</td>
			<td>ERS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire end ferrules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>General (generic) equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple approach to perform teer measurements using a self-made volt-amperemeter with programmable output frequency

Transsepitelial/endothelial elektriskt motstånd (TEER) har använts sedan 1980-talet för att bestämma confluency och permeabilitet av in vitro-barriär modellsystem. I de flesta fall, chopstick elektroder används för att bestämma den elektriska impedansen mellan det övre och undre facket i en cellkultur filter infoga system som innehåller cellulära monolayers. Filtret membranet gör att cellerna att fästa, polarisera, och interagera genom att bygga snäva korsningar. Denna teknik har beskrivits med en mängd olika cellinjer (t. ex. celler i blod-hjärnbarriären, blod-cerebrospinalvätska barriär, eller gastrointestinala och pulmonell tarmkanalen). TEER mätanordningar kan lätt erhållas från olika leverantörer av laboratorieutrustning. Det finns dock mer kostnadseffektiva och anpassningsbara lösningar tänkbara om en lämplig voltammeter är självmonterad. Det övergripande syftet med denna publikation är att ställa in en tillförlitlig enhet med programmerbar utgångsfrekvens som kan användas med kommersiellt tillgängliga chopstick elektroder för TEER mätning.

För att jämföra driften av en självmonterad voltameter med dess kommersiellt tillgängliga motsvarighet, spelades en spänningsoscillogram av båda enheterna in.
Som visas i figur 2a, genererade referensinstrumentet en fyrkantig vågsignal med en amplitud på 80 MV och en svängning tid på 80 MS, vilket motsvarar en frekvens på 12,5 Hz, vid drift på belastning med en 1 kΩ test resistor.<...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency at JoVE.com

A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency

Här visar vi hur man ställer in en billig volt-amperemeter med programmerbara utdata frekvens som kan användas med kommersiellt tillgängliga chopstick elektroder för transepitelial/endoteliala mätningar elektriskt motstånd.

En enkel metod för att utföra TEER mätningar med hjälp av en egentillverkad volt-amperemeter med programmerbara utdata frekvens

Transepithelial/endothelial electrical resistance (TEER) has been used since the 1980s to determine confluency and permeability of in vitro barrier model ...

Mätning av transepitelial elektrisk impedans har använts sedan 1980-talet för att bestämma konfluency och barriärfunktion hos epitelial monolayers i cellodling. Den underliggande tekniken är en fyrterminal avkänning som använder olika par av strömbärande och spänningsavkännande elektroder för att göra mer exakta mätningar. Det finns flera kommersiellt tillgängliga enheter för att mäta transepithelial impedans, men trots användarvänligheten och den höga tillförlitligheten finns det också vissa nackdelar som den icke-översättningsbara utdatafrekvensen och deras dyrhet.Således representerar vi hur man bygger en kostnadseffektiv och programmerbar volt-ammeter. Till en början vill vi visa hur TEER-mätning med kommersiellt tillgängliga enheter fungerar. För att göra det hade vi odlade ett cellskikt av choroid plexus epitelial papilloma celler på Transwell filter med en porstorlek på tre mikrometer.Denna inställning har beskrivits av Schroten et al. som in vitro-modell av blod-ryggmärgsvätskan barriären. Nu är en chopstick elektrod ansluten till en epitelial volt-ammeter.Enheten är påslagen och inställd för att mäta motstånd. Elektroden steriliseras i 80%etanol och därefter ekvilovilrateras i ett lämpligt medium. Den impedans som ska mätas kommer att fungera som referensvärde för att utvärdera tillförlitligheten hos den voltamometer som kommer att monteras i efterhand.I det här exemplet spelar vi in en impedans på 680 ohm. Låt oss börja med monteringen av en låg budget volt-ammeter med programmerbara utdatafrekvens. Först och främst behöver du en vanlig USB-laddare, och en USB-förlängningssladd som fem-volts likströmsströmtillförsel.En 8-bitars mikrokontroller på en USB-utvecklingstavla kommer sedan att användas för att generera en fyrkantsvågsström. Fyra kablar med bananpluggar ansluts till två standard multimetrar för att mäta spänning och ström. Var god och se till att multimetrarna klarar att mäta ström i en rad av vissa mikroamperer med TrueRMS.En kvinnlig RJ14-kontakt finns på vanliga telefonkablar. Se bara till, att kontakten har sex stift av vilka minst de inre fyra är trådbundna. Slutligen behöver du några standardutrustning, som våra kablar, en lyster terminal, en 120 kiloohm motstånd, och några verktyg som isolering strippor, en crimping verktyg, tråd ferrules, och lödkolv.Enheten sätts ihop exakt så som illustreras i layoutdiagrammet. Till en början är USB-förlängningen ansluten till mikrokontrollern. Under normal drift, den drivs av en fem-volts DC USB-laddare, som lätt kan anslutas till en persondator för programmering.Två kablar är strippad och crimped med tråd ferrules på ena sidan. Den andra sidan är lödd antingen direkt till stift noll och två av mikrokontroller eller till lödning lugs, som i sin tur är klippt på respektive stift. Därefter är de krafttillverkande kablarna anslutna till en lysterterminal.Den första multimetern kommer att användas för att mäta ström och är seriekopplad med 120 kiloohm-motstånd och en strömföring av chopstickelektroder. Detta arrangemang säkerställer att utströmmen är begränsad, så mätningen kommer inte att ha någon inverkan på cellernas livskraft. Telefonförlängningssladdens fyra ledare demonteras och pressas till ferrules enligt bilden tidigare.När kabeln är förberedd, måste du testa kontinuitet av ledare och stift. I vårt exempel är stift tre till sex anslutna till den vita, bruna, gröna och gula ledaren. Nu stift fem och sex, som är grön och gul, är anslutna till lyster terminalen för att tillämpa spänning på den yttre elektrodparet.Slutligen måste du ansluta den andra multimetern, som kommer att användas för att mäta transepitelial spänningsfallet, till stift tre och fyra, det vill säga i vårt exempel till den vita och bruna ledaren. Vi bestämde oss för att montera installation i en billig plast chassi. Före den första användningen måste mikrokontrollern programmeras.Källkoden är skriven i C+och kan laddas upp av en USB. I korthet, stift noll i ett centerutmatningsläge. Vid påkopplad kommer funktionsslingan att börja alternera som stift mellan jord och plus fem volt med en variabel fördröjning.I vårt exempel använde vi en teoretisk halvsvängningstid på 40 millisekunder. Låt oss se hur mätresultaten jämför med de referensvärden vi hade fått tidigare. Chopstickelektroden flyttas till den nyligen monterade volt-ammetern.Enheten är påten på i tre steg. Det vill säga att koppla in en USB-laddare, byta vänster multimeter till AC-spänningsmätning, och byta den andra multimetern till microampere. Var uppmärksam, att växelström måste väljas uttryckligen.I det här exemplet mäts den potentiella nedgången över Transwell-filtersystemet som cirka 25 millivolt, medan vi spelar in en ström på 37,1 mikromperer. Enligt Ohms lag kan elektrisk impedans enkelt beräknas till 674 ohm, vilket är mycket nära referensvärdet 680. Vi har visat att mätvärden är tillförlitliga över ett intervall från noll till 1,8 kiloohms.Således kan den beskrivna volt-ammetern användas både för inledande experiment och för fortsatta studier. Men om dina resultat ska offentliggöras, kanske du alltid vill stödja dina data, genom att mäta molekylflöde över respektive celllager.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Electrical Engineering

Biology

Unit 1

Direct-Current Circuits

Basics of Electric Circuits

SCIENTISTS IN ACTION

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

Mikrofabricerade Post-Array-detektorer (mPADs): en metod att isolera mekaniska krafter

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated ...

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

Göra Patch-pipetter och Sharp Elektroder med en programmerbar Puller

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades.  Today, such pipettes are made from glass capillaries ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Använda Gene Pulser MXcell elektroporation System till transfektera primärceller med hög verkningsgrad

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

Immuncytokemiska Analys av mänskliga pluripotenta stamceller med hjälp av en self-made Cytospin Apparater

Human pluripotent stem cells (hPSCs) that include human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are exciting cell ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

En omvänd Genetisk strategi till Test Funktionell Redundans under fosterutvecklingen

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability

FSL Konstruerar: en enkel metod för att ändra Cell / Virion Ytor med en rad biologiska markörer utan att påverka deras livskraft

The ability to modify/visualize biological surfaces, and then study the modified cell/virion in a range of in vitro and in vivo environments is essential ...

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

En Semi-kvantitativ metod för att bedöma biofilmbildning Använda Skrynkliga Colony utveckling

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

Transgena Gnagare analys för att kvantifiera Man Germ Cell Mutant Frekvens

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module

Använda musbrösttumör celler att undervisa Kärn Biologi Concepts: En enkel Lab Modul

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualisering Stromule frekvens med fluorescensmikroskopi

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...