Name: light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins
Uploaded: 2019-10-11T13:00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins at JoVE.co

ويدعم هذا العمل من قبل BBSRC ، EPSRC ، مومباسا و Wellcome الثقة. مختبر C.B. هو جزء من مركز الثقة Wellcome للبحوث مصفوفة الخلية ، جامعه مانشستر ، والتي تدعمها التمويل الأساسي من الثقة Wellcome (منحه رقم 088785/Z/09/Z). ويود أصحاب البلاغ التنويه بالتمويل المقدم من مجلس بحوث التكنولوجيا الاحيائيه والعلوم البيولوجية (BBSRC) إلى سي ام ، K.J. (BB/M020630/1) والدراسة السنوية (BB/P000681/1) ومجلس بحوث الهندسة والعلوم الفيزيائية (EPSRC) والطبي مركز مجلس البحوث لتدريب الدكتوراه في الطب التجديدي لA.K. (EP/L014904/1). ويشكر المؤلفون Alvéole علي مراسلاتهم وفريق دعم ما بعد البيع. ويشكر المؤلفان بيتر مارس وروجر ميدوز من مرفق التصوير الحيوي بجامعه مانشستر لمساعدتهما في المجهر. تم شراء المجاهر مرفق التصوير الحيوي المستخدمة في هذه الدراسة مع منح من BBSRC ، ويلكوم ترست والصندوق الاستراتيجي لجامعه مانشستر.

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

LIMAP (بريمو) الزخرفة الصغرى المزايا والمقارنة مع الطباعة ميكرواتصال في حين الطباعة microcontact هو ربما الأكثر شيوعا تقنيه زخرفه الصغرى في المجال البيولوجي39، يبدو ان هناك عددا متزايدا من الباحثين باستخدام التكنولوجيا limap40،41،42 ,43,44. هنا ، قدمنا بروتوكولا باستخدام بريمو ، وهو نظام متاح تجاريا ل LIMAP. أدناه ونحن نناقش بإيجاز المزايا المحتملة والقيود من الطباعة microcontact و LIMAP الصورة-زخرفه.
تتطلب الطباعة بالاتصال المجهري الرئيسية التي تم إنتاجها بواسطة الطلاء الدوار قناع الصور (SU-8 عموما) علي الزجاج أو رقاقه السيليكون ، والذي هو بعد ذلك محفورة بالليزر مع الميزات الدقيقة المطلوبة. يتم استخدام هذه الأساسيات كقوالب لإنشاء ختم PDMS45. يتم احتضان الطوابع مع البروتين المختار الذي يمتص اليها ، ثم يتم نقله (مختومه) علي طبق ثقافة الخلية. عمليه الامتزاز من البروتين إلى ختم PDMS يعتمد علي تركيز البروتين, العازلة ووقت الحضانة. هذه المعلمات تحتاج إلى اختبارها مسبقا للحصول علي أفضل النتائج46.
يمكن استخدام الماجستير في عدد كبير من التجارب ، التي تدوم لأشهر أو حتى سنوات ، إذا تم الحفاظ عليها بشكل صحيح. ومع ذلك ، فان العامل المقيد لهذه التكنولوجيا هو ضرورة أعاده تصميم الأساسيات الحجرية الجديدة لكل تعديل مطلوب. وقد تؤدي التغييرات في التصاميم التجريبية إلى الإنتاج المستهلك للوقت لأسياد جدد (حتى عده أسابيع) مما يؤخر التجارب. في المقارنة ، لا يتطلب فوتوباتيرنينج LIMAP سيد المادية; فانه يستخدم قوالب النماذج التي تم إنشاؤها من قبل البرمجيات التي يمكن استخدامها للتكيف بمرونة الهندسي المطلوب من الأنماط الصغرى إلى الاسئله البحثية المتغيرة. ويمكن أيضا ان تستخدم LIMAP لتوليد التدرجات البروتين داخل نفس النمط الصغير (الشكل 8) ، والتي هي أصعب للحصول علي بطريقه استنساخه باستخدام الاتصال المصغر الطباعة47.
وعلاوة علي ذلك ، فان القرار الخاص بالنمط الجزئي الذي تم التوصل اليه مع LIMAP ، في حالتنا ، هو 2 μm (الشكل 6ب).
وقد زاد الاقتراب من هذا القرار من التباين داخل الأنماط وفيما بينها. وكان توليد أنماط حول أو فوق 10 μm عرض استنساخه للغاية (الشكل 6G ، H). علي العكس من ذلك ، مع الطباعة ميكرواتصال من الصعب الحصول باستمرار علي قرارات اقل من 10 μm وانه من الشائع ان تجد التحف عند ختم الميزات الصغيرة (البيانات لم تظهر).
وقد أظهرنا ان LIMAP يمكن استخدامها لبروتينات متعددة النمط الجزئي (الشكل 9) داخل نفس الصغيرة البئر ، مما يسمح باضافه مستويات اضافيه من التعقيد إلى التجارب. علي الرغم من ان هذا يمكن ان يتحقق مع الطباعة microcontact ، محاذاة البروتينات المختلفة مع مستوي عال من الدقة يمكن ان تكون من الناحية الفنية تتطلب بدلا من ذلك. بينما زخرفه بروتينات متعددة باستخدام LIMAP يبدو علي التوالي إلى الامام ، فمن المهم ان نذكر ان الربط بين البروتينات من خلال إجراءات طلاء متسلسلة يمكن خفضها من خلال حجب الكواشف ولكن لم يتم القضاء كليا (الشكل 9).
وفيما يتعلق بتكلفه واحده أو تقنيه أخرى ، LIMAP كما هو موضح هنا يتطلب شراء معدات الزخرفة الصغيرة (بريمو) التي يمكن تركيبها علي المجاهر المختلفة فلوري ويتطلب مرحله الميكانيكية. علي الرغم من ان هذا الاستثمار هو في البداية التكلفة المكثفة ، لا توجد مشتريات اضافيه غير المواد الاستهلاكية (الاستنسل ، PEG و PLPP) علي المدى الطويل المرتبطة LIMAP. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا ان تنتج الاستنسل pdms في المختبر من قبل مجرب الخاصة التالية البروتوكولات المنشورة18،32. ويمكن ان تكون أكبر التكاليف المتعلقة بالطباعة بالاتصال المجهري مرتبطة بإنتاج أسياد جدد ، وهو ما يمكن ان يصبح كبيرا إذا كانت التجارب تتطلب أنماطا جديده.
عيب واحد من LIMAP هو نهج الانتاجيه منخفضه نسبيا من هذه التقنية. يمكن الطباعة microcontact إنتاج عدد كبير من النماذج الصغيرة بسرعة وكفاءه في خطوه ختم في وقت واحد ، بالمقارنة مع المطلوبة الليزر الصغيرة متسلسلة زخرفه مع LIMAP. علي سبيل المثال ، فمن الممكن لإنتاج 6 الزجاج مختومه الشفتين في حوالي 2 ح مع الطباعة microcontact باستخدام الطوابع PDMS (باستثناء اعداد الطوابع) ؛ زخرفه منطقه مماثله (6-حسنا طبق) مع LIMAP سوف يستغرق حوالي 4 ساعة ، باستثناء اجراء التخميل السطحية (بالنظر إلى تكوين قالب نمط الموصوفة في الخطوة 5.12 وانظر الشكل 5ب).
ومن العوامل الأخرى التي تحد من عامل التكنولوجيا LIMAP هو وقت الاضاءه الطويل اللازم لزخرفه المساحات الكبيرة (30 ثانيه لكل وحده تصميم بالليزر 7.5 ميغاواط/مم2 ). في هذه الحالات ، قد تكون طباعه الاتصال المصغر خيارا مفضلا. وهناك الجديدة المتاحة الصورة البادئ (PLPP هلام ، جدول المواد) ينبغي ان تقلل إلى حد كبير من الوقت الذي اتخذ لزخرفه ، والسماح للجيل من مئات من الأنماط الصغرى في مناطق واسعه (تصل إلى 8 مم2) في بضع دقائق فقط.
ومن العوامل الهامه الأخرى التي يجب مراعاتها عند الأسطح زخرفه الصغرى لثقافة الخلايا هو استنساخ الأنماط الصغرى بين التكرارات التجريبية المختلفة ، بالمقارنة مع التغيرات التي تم الحصول عليها مع الطباعة بالاتصال المجهري. علي سبيل المثال ، الرسوم البيانية المبينة في الشكل 7B ، D هي بيانات تمثيليه لثلاثه تكرارات تجريبية مستقله مع نتائج مشابهه جدا (البيانات غير معروضه). استنادا إلى تجربتنا والمنشورات السابقة ، وهذا المستوي من استنساخ من الصعب تحقيق مع الطباعة microcontact48،49،50،51،52.
علي النقيض من غيرها من التقنيات زخرفه الصور التي تتطلب اما الكيمياء مخصصه لهندسه المواد الحساسة أو استخدام الصور المحسسات ، والتي هي عموما ليست حيوية جدا3، والعنصر الحساس للضوء LIMAP (plpp ) متوافقة بيولوجيا وجيده التحمل من قبل الخلايا21؛ في ايدينا لم تشهد اي السمية الخلوية عبر مجموعه متنوعة من الخلايا ، بما في ذلك CAD ، DRG الخلية العصبية (الشكل 10) ، الخلايا الليفية ، الظهاريه ، وخلايا سرطان الجلد (البيانات لم تظهر). ميزه أخرى من limap باستخدام بريمو مقارنه مع غيرها من التقنيات زخرفه الصورة هو انه لا يتطلب ضوئي. علي غرار الطباعة microcontact ، ستحتاج نباتات جديده ليتم تصميمها وتوليدها لكل نمط المرجوة.
جميع القيود المذكورة أعلاه للطباعة ميكرواتصال ، والرجوع إلى النهج اليدوي لهذه التقنية. ومع ذلك ، فمن الممكن لتعزيز الانتاجيه واستنساخ الطباعة microcontact باستخدام جهاز مؤتمت مع تحميل الطوابع والتحكم في الضغط53.
الخطوات الرئيسية للبروتوكول وحل المشاكل ل LIMAP باستخدام بريمو واحده من المشاكل الأكثر شيوعا وجدت خلال هذا البروتوكول هو وجود مستويات عاليه من الخلفية الفلورية داخل الأنماط الصغرى. وهذا يمكن ان يكون نتيجة لتجفيف الآبار الصغيرة التي غالبا ما يحدث بسبب حجمها الصغير. وعند حدوث ذلك ، غالبا ما تظهر بلورات الاذاعه التلفزيونية المحيطة بأنماط ECM (الشكل 11ا).
خطوات الغسيل غير كافيه أو غير فعاله بعد حضانة البروتين يمكن ان يؤدي أيضا إلى مستويات عاليه من مضان الخلفية. ويمكن ملاحظه ذلك علي وجه الخصوص عند استخدام تركيزات البروتين من 10 ميكروغرام/مل (الشكل 11ب) أو اعلي. ويمكن تخفيض الفائض من البروتين في الخلفية بما في ذلك خطوات الغسيل اضافيه مع تلفزيوني.
وجود خلفيه البروتين يحتاج إلى ان تقاس وتتميز في كل تجربه ، وحساب كثافة الخلفية الفلورية (الشكل 6ه) وطرحها من كثافة الأنماط الصغرى (الشكل 6F-H والشكل 7باء ، دال). قد يكون للخلفية عاليه البروتين تاثير في المرفق والتوجيه من خلايا CAD, المساومة علي تفسير النتائج.
وجود ثغرات بين وحدات التصميم مشكله شائعه عندما يكون لدي المستخدمين خبره محدوده (الشكل 11ب) ، والتي تحدث نتيجة لعدم كفاية التداخل بين الأنماط. يمكن تعديل معلمتين في برنامج ليوناردو للتغلب علي هذا: 1) قد تكون هناك حاجه إلى تباعد سالب بين الاعمده ، اعتمادا علي تصميم النمط (الخطوة 5.7 وانظر الشكل 5ب ، ج). بدلا من ذلك ، 2) استخدم خيار التدرج في قائمه الخبراء لغرزه الاعمده. يمكن اجراء اختبار سريع لتحديد معلمات التباعد الأمثل باستخدام لاصق الاشعه فوق البنفسجية (جدول المواد). يتم تطبيق قطره صغيره من هذه اللاصقة علي شريحة زجاجيه ، والتي يتم تغطيتها بعد ذلك مع الزجاج coverslip ، مما يجعل الفيلم. يتم فوتوباتيرنيد لاصقه الاشعه فوق البنفسجية المضمنة مع قالب النمط من الفائدة باستخدام جرعه ليزر منخفضه (30 مللي جول/مم2). سيتم الشفاء من المناطق المعرضة للاشعه فوق البنفسجية من ماده لاصقه مضمنه ، لتصبح مرئية تحت المجهر الميداني الساطع. يتم تصور نتائج الاختبار لتقييم التباعد الذي تم الحصول عليه ضمن النقش. في تجاربنا العصبية ، قد الفجوة بين المشارب تؤثر سلبا علي سلوك الخلية ، وإنتاج الاختلافات في ديناميات النمو (اما انخفاض السرعة أو التخلي عن المسار).
في آخر تحديث لبرنامج ليوناردو (في وقت النشر ، ليوناردو 4.11) ، من الممكن تحميل قوالب النقش الأكبر المصممة سابقا والتي تغطي مساحة أكبر بكثير (حتى 8 مم2 باستخدام الهدف 20x) لسطح البئر الصغيرة بالمقارنة مع الحالي 0.1 مم2 لكل وحده التصميم ، والقضاء علي الحاجة إلى غرزه معا وحدات تصميم أصغر. يمكن ان تنتج الحواف غير المعرفة عن عدم وجود تعديل للتركيز بالليزر اثناء إنشاء النمط (الشكل 11ج). ولذلك فمن الضروري معايره الليزر وتنفيذ خطوات النمط المرجعي (انظر الخطوة 4) قبل زخرفه. المشارب المحددة بشكل سيئ ينتج عنها اختلافات في عرض الشريط ، مما يجعل الارتباط بين ديناميات نمو المحور وعرض الشريط صعبا. Axons تميل أيضا إلى التخلي عن المشارب التي لها حواف منتشرة. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن أيضا العثور علي تباين في الحواف عند طباعه المشارب من 10-20 μm عرض أو اعلي ، مما ادي إلى ارتفاع محتوي البروتين علي حواف مقارنه بالمناطق الوسطي من النمط (الشكل 6ب ، د). أنتجت هذا حافه تاثير بانتشار [نون-لهوموكل] من ال [فوتو-بادئ] اثناء ال [فوتوباتيرنينج عمليه. رد فعل التصوير الضوئي هو الأكسجين المعتمدة ، والتي ينتشر أكثر علي الحواف. هذا تاثير حافه يستطيع كنت قللت مجانسه الصورة-بادئ مع ماصه في ال [ميكرو-ول] اثناء العملية فوتوباتيرنينج. وعلاوة علي ذلك ، يمكن للمبتكر الصور الجديدة (PLPP هلام) أيضا تقليل تاثير الحافة (بريمو فريق دعم النظام ، والاتصالات الشخصية).
يمكن ان يؤدي الطباعة الدقيقة لأكثر من بروتين واحد إلى الربط التبادلي (الشكل 9ا-د). ويمكن التقليل من ذلك عن طريق زيادة كفاءه الحجب المستخدمة لاحتلال مواقع ربط غير محدده بين خطوات الحضانة للبروتينين المختلفين. ويمكن للربط بين البروتينات ان يزعج استنساخ النتائج التجريبية وقد يؤدي إلى سوء تفسير البيانات ، لأنه من الصعب تحديد مساهمه كل بروتين في ديناميات نمو الخلايا العصبية وسلوكيات الخلية الأخرى.
الختام نامل ان البروتوكول المقدم باستخدام LIMAP يسهل توليد أنماط البروتين الصغرى من خلال استخدام نظام بريمو. بينما يركز بروتوكولنا علي كيفيه إنتاج النماذج الصغيرة بشكل موثوق في الأسطح الزجاجية ثنائيه الابعاد ، اظهر البعض الآخر انه من الممكن استخدام LIMAP لزخرفه الصغيرة من الركائز اللينة54، والأسطح المجهرية للثقافات ثلاثية الابعاد42. هذه الأنماط الصغيرة يمكن ان تكون أداه متعددة الاستعمالات لدراسة الاستجابات الخلوية للتغيرات في بيئتها الصغرى.

وفي السنوات الاخيره ، استخدمت العلوم البيولوجية بشكل متزايد التطورات التي توفرها العلوم المادية. واحده مثال بارزه ال [ميكرو-زخرفه] من ركائز, اي يستطيع كنت استعملت ان يدرس استجابه خلوية مثل خليه انتشار1,2التمايز3,4,5,6، ترحيل الخلايا7,8,9والتقصي10,11. وهناك عدد من التقنيات المتاحة التي تمكن زخرفه الصغرى من ركائز ، مثل الكيمياء الضوئية متحمس متعدد الفوتونات12، فؤاد تراجع-القلم نانوليثوغرافي13، دبوس والنافثة للحبر الطباعة المباشرة14، والطباعة الحجرية شعاع الكترون15أو ميكروفلويديكس16. ومع ذلك ، فان اثنين من التقنيات التي تستخدم علي نطاق واسع في المجال البيولوجي هي الطباعة ميكرواتصال17,18,19أو زخرفه بمساعده الليزر3(الشكل 1). ويعتبر زخرفه بمساعده الليزر لتقديم نتائج أكثر موثوقيه من حيث البروتين والاستقرار PEG والحبس الخلوي علي الأنماط ، بالمقارنة مع الطباعة ميكرواتصال20. وهناك نهج أكثر رواية لزخرفه الصغرى الموصوفة هنا هو استخدام الضوء المستحث الامتزاز الجزيئي للبروتينات21(LIMAP,الشكل 1 د) باستخدام نظام متاح تجاريا (بريمو ،جدول المواد). ولكل من هذه الأساليب مزايا وقيود يرد وصفها بإيجاز أدناه. تستخدم الطباعة بالاتصال المجهري قوالب PDMS (طوابع) مع الميزات الدقيقة المطلوبة التي يتم إنشاؤها من السادة الحجرية. حضنت الدمغ مع بروتين مختاره اي يكون بعد ذلك [ترنسفرد] (يختم) فوق الخلية ثقافة ركيزة18(الشكل 1 علي). يستخدم الليزر بمساعده زخرفه ضوء الاشعه فوق البنفسجية ليلتصق فيلم المضادة للحشف22,23,24,25، وتعريض المناطق التي يمكن ان تكون في وقت لاحق المغلفة مع البروتين من الفائدة (الشكل 1 ب). بينما القرار يحقق مع [فوتو-زخرفه] مقاربه في ال [ميكرون رنج]25,26، ومعظم هذه التقنيات تتطلب قناع الصورة ، اما في اتصال مع العينة ، أو تقع في الطائرة كائن من هدف المجهر23,27,28. ويمكن ان تكون متطلبات الاقنعه في كل من الطباعة المجهرية والصور الزخرفته قيدا ؛ أقنعه محدده مطلوبه لكل نمط هندسي وحجم ، والتي يمكن ان تكون مكلفه وتستغرق وقتا طويلا لتوليد. علي النقيض من هذه التقنيات ، LIMAP لا يتطلب قناع (الشكل 1 د). استخدام نظام بريمو ل LIMAP يمكن ان تكون باهظه التكلفة في البداية لأنه يتطلب شراء المعدات. ومع ذلك ، يتم استخدام البرمجيات مفتوحة المصدر لتصميم أنماط من اي الهندسة المطلوبة ، وإعطاء المزيد من الحرية والسماح للتجارب أكثر تعقيدا بما في ذلك استخدام التدرجات تركيز البروتين. يتم التحكم في الليزر بريمو وإخراجه بواسطة جهاز ميكرو أو DMD المتحكم به رقميا لخلق أنماط في اي عدد من الهندسي المعرفة من قبل المستخدم. يتطلب LIMAP سطح الثقافة لتكون مغلفه مع الجزيئات التي تمنع المرفقات الخلية. البولي إيثيلين غليكول (PEG) هو الأكثر شيوعا كمثل هذا الكاشف "انتيقاذورات"; فانه يشكل فيلم كثيفه المضادة للاصقه علي سطح الزجاج أو البلاستيك29. وفي وقت لاحق ، يتم أضافه البادئ الصورة التي تسمح للفيلم PEG لأزالها بدقه عاليه من خلال اليه التصوير الضوئي30بواسطة التعرض المحلي للاشعه فوق البنفسجية تحت سيطرة DMD. هذه المناطق الخالية من الوتد يمكن ان تكون مغلفه مع البروتينات التي كثف إلى سطح محفورة بالليزر ، وتوليد نمط الصغرى. من خلال تغيير قوه الليزر ، يمكن أزاله كميات مختلفه من PEG من السطح مما يسمح للمستخدم لتوليد التدرجات البروتين. ويمكن تكرار أزاله الوتد واجراء الطلاء لخلق أنماط مع اثنين أو أكثر من البروتينات المتميزة في نفس الصغرى جيدا21. توفر الأنماط الصغيرة التي تم إنشاؤها أسطح لاصقه للخلايا ، مما يسمح بدراسة سلوك الخلايا. في الدراسات لدينا ، ونحن نستخدم الزخرفة الصغرى لدراسة العصب أو المسار العصبي من خط الخلايا العصبية (CAD (كاثيكهولامينجيك-المتمايزة) الخلايا31) أو الرئيسية الفئران الظهرية الجذر العقدة (DRG) الخلايا العصبية ، علي التوالي. هنا ، نحن الخطوط العريضة لبروتوكول خطوه بخطوه ل LIMAP (الشكل 2) باستخدام نظام بريمو المتاح تجاريا وبرنامج ليوناردو المصاحب. ونحن نظهر كيف يمكن استخدامه لتوليد أنماط مع الهندسي المحددة والبروتينات المتعددة ، والتي نستخدمها لدراسة الاكتشاف المرضي محواري. نحن نناقش القضايا المشتركة التي يمكن ان تنشا وكيف يمكن تجنبها.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 488 protein labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10235</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647 protein labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20173</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD cells</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>8100805</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conjugated fibrinogen-488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>F13191</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence Microscope**</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti inverted</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4759</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml 
			(after labelling with Alexa 488 protein labeling kit, see above) 
			(diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji-Image J</td>
			<td><a href="http://www.imagej.nih.gov" target="_blank">www.imagej.nih.gov</a></td>
			<td>Version 2.0.0-rc-54/1.51f</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent highlighter</td>
			<td>Stabilo</td>
			<td>Stabilo Boss Original</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Working concentration: 1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkscape software</td>
			<td>Inkscape</td>
			<td>Check last update</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin-red fluorescent rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td>LMN01</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml 
			(diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo software</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>version 4.11</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-manager software</td>
			<td>Open imaging</td>
			<td>Check last update</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized x/y stage</td>
			<td>PRIOR Scientific</td>
			<td>Proscan II</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements AR 4.60.00 64-bit (With Nikon jobs)</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Working concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Stencils</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>visit <a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-SVA</td>
			<td>Laysan bio, Inc.</td>
			<td>MPEG-SVA-5000-1g</td>
			<td>Working concentration: 50 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176752</td>
			<td>Working concentration: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-initiator (PLPP)</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>Classic PLPP</td>
			<td>Working concentration: 14.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-initiator (PLPP gel)</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>Working concentration: 4.76% diluted in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V)</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL-PEG</td>
			<td>SuSoS (also distributed by Alv&#233;ole)</td>
			<td><a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: 0.1 mg/ml (diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/ProductLookup.html?ProdNo=P4707&amp;Brand=SIGMA">P4707</a></td>
			<td>Working concentration: 0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo equipment</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td><a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122">15140122</a></td>
			<td>Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin anti-alpha antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>DM1A</td>
			<td>Working concentration: 1:1000 
			CAD cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin anti-beta 3 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td>Working concentration: 1:500 
			DRG neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV adhesive</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 well glass bottom dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well glass bottom dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-20-1.5-N</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective**</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>no phase ring (check updated catalogue)</td>
			<td>Working concentration: N.A. 
			**Epifluorescence microscope: images were acquired and patterns were generated on an Eclipse Ti inverted microscope (Nikon), coupled to PRIMO micro-patterning equipment (Alv&#233;ole), using a 20x objective (0.75 S Plan Fluor (nophasering, Nikon). Nikon specific filter sets for GFP, mCherry and Cy5 were used and fluorescent light source was LED (Lumencor) although other fluorescence sources and filter sets can be used. The microscope has an automated x/y stage (PRIOR Scientific) for the printing of multi-field patterning and Nikon Perfect Focus to prevent focus drift. The images were collected using a Retiga R6 (Q-Imaging) camera.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins

الخلايا تستشعر مجموعه متنوعة من العظة خارج الخلية ، بما في ذلك تكوين وهندسه مصفوفة خارج الخلية ، والتي يتم توليفها وتشكيلها من قبل الخلايا نفسها. هنا ، نقدم طريقه الامتصاص الجزيئي الناجم عن الضوء من البروتينات (LIMAP) باستخدام نظام بريمو كتقنية زخرفه لإنتاج ركائز المصفوفة خارج الخلية الصغيرة المنقوشة (ECM) باستخدام واحد أو مزيج من البروتينات. الأسلوب يتيح طباعه أنماط ECM في قرار ميكرون مع استنساخ ممتازة. نحن نقدم بروتوكول خطوه بخطوه وشرح كيف يمكن تطبيق هذا لدراسة عمليات النتائج المرضية العصبية. لدي LIMAP مزايا كبيره علي طرق الطباعة الدقيقة الموجودة من حيث سهوله زخرفه أكثر من مكون واحد والقدرة علي توليد نمط مع اي الهندسة أو التدرج. ويمكن بسهوله تكييف البروتوكول لدراسة مساهمه اي عنصر كيميائي تقريبا نحو مصير الخلية وسلوك الخلية. وأخيرا ، نناقش القضايا المشتركة التي يمكن ان تنشا وكيف يمكن تجنبها.

Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins at JoVE.co

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

هدفنا العام هو فهم كيف الخلايا حاسة الإشارات خارج الخلية التي تؤدي إلى النمو محواري الموجهة. هنا ، ونحن وصف منهجيه الضوء المستحث الجزيئية الامتزاز من البروتينات ، وتستخدم لإنتاج النماذج الدقيقة المحددة من مكونات مصفوفة خارج الخلية من أجل دراسة احداث محدده التي تحكم النمو العصبي والباثيه.

الامتزاز الجزيئي المستحث بالضوء من البروتينات باستخدام نظام بريمو لزخرفه الصغرى لدراسة استجابات الخلايا للبروتينات المصفوفة خارج الخلية

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...

النقش الدقيق هو أداة قوية جدا لأنه يسمح لدراسة الاستجابات الخلوية لتحديد الإشارات الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية التي تواجهها الخلايا في الكائنات الحية. على النقيض من الأساليب الأخرى، يتم وصف أكثر مرونة لإنشاء نمط. على سبيل المثال، فإنه يسمح بإنتاج التدرجات وأنماط صغيرة من البروتينات المتعددة مع قابلية التكاثر العالية.تستخدم مجموعتنا ليماب ليس فقط لدراسة المسارات العصبية، ولكن أيضا كيف تستجيب الخلايا الأخرى للإشارات التي لها تأثير على انتشار الخلايا، والتمايز، والهجرة. يستخدم النقش الصغير للإجابة على الأسئلة الأساسية في بيولوجيا الخلايا. ويمكن استخدام المعرفة المكتسبة لتعديل الأجهزة الموجودة في الطب التجديدي، على سبيل المثال، إصلاح الأعصاب بعد إصابة الأعصاب الطرفية.تبدأ من خلال تصميم قوالب للنقش على برنامج الرسم الرقمي. حدد حجم صورة 1، 824 بكسل في الطول و 1، 140 بكسل في العرض. تصميم القالب، وحفظ القالب كملف TIFF 8 بت.قبل النقش، وتنظيف وتنشيط السطح مع نظافة البلازما باستخدام ضغط عملية من 1، 000 إلى 1، 300 ملليتور وقوة 29.6 واط لمدة دقيقة إلى خمس دقائق. استخدم طبقًا زجاجي القاع بحجم بئر داخلي 20 ملليمترًا وسمك الزجاج من 0.16 إلى 0.19 ملليمتر. حدد إما طبقًا من ستة بئرين أو طبقًا واحدًا ، اعتمادًا على عدد الحالات التي يتم اختبارها.قص الإستنسل PDMS تحت ظروف معقمة لضمان أنها تناسب في قاع الزجاج الداخلي جيدا. إزالة حشوات microwell الداخلية مع ملقط العقيمة، والتمسك الاستنسل على الزجاج جيدا. إعداد 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر PLL-PEG حل في برنامج تلفزيوني، وإضافة 20 ميكرولترات لكل ميكروويل.ثم، احتضان الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة، وإزالة 15 ميكرولترات من PLL-PEG من كل بئر، وغسلها خمس مرات مع 20 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني دون السماح لها الجافة. إعداد microwell واحد لخلق نمط مرجعي عن طريق إزالة 18 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني من بئر واحد وإضافة خمسة microliters من الضوئيات، وترك برنامج تلفزيوني في microwells المتبقية.ثم، استخدم أداة تمييز الفلورسنت لوضع علامة على بئر زجاجي داخلي فارغ. وضع جيدا فوق الهدف، وضبط التركيز الهدف حتى شعار PRIMO وشعار شعار رعاية الخلايا الخاصة بك"هي في التركيز. ثم، تسجيل موقف Z من المستوى البؤري.لإنشاء نمط مرجعي، تصور حافة microwell مع ضوئي باستخدام الضوء المنقولة من خلال الكاميرا، واختيار رمز العائد على الاستثمار من القائمة اليمنى. حدد PRIMO لتحميل قالب النمط المطلوب، والذي سيتم إسقاطه على عائد الاستثمار كوحدة تصميم. انتقل إلى منطقة محيطية من microwell، حدد قفل، وضبط التركيز إلى موضع Z للمعايرة.ثم حدد تشغيل لبدء تشغيل النقش المرجعي. غسل نموذج صغير المرجع ثلاث مرات مع 20 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني لإزالة الضوئيات. ثم، إضافة 20 ميكرولترات من المصفوفة الفلورية المسمى خارج الخلية، أو ECM، حل البروتين.احتضان الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 20 دقيقة، مع التأكد من حماية المرجع جيدا من الضوء. بعد الحضانة، وإزالة 18 ميكرولترات من محلول البروتين، وغسل البئر ثلاث مرات مع 20 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. استخدام مجهر epifluorescence لتصور نمط المرجعية.ضبط التركيز على حواف النقش من خلال مسار الكاميرا، وسجل موضع Z وفقًا لأفضل تركيز. هذا الموقف سيكون التركيز الأمثل ليزر المستخدمة في النقش اللاحقة. في ظل ظروف معقمة، وإزالة 18 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني من جميع microwells.إضافة خمسة ميكروليترس من الضوئيات إلى كل بئر، والتجانس عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. إذا كان نقش بروتينات متعددة في نفس microwell، تحميل جميع مجموعات من قوالب نمط المطلوب في وقت واحد. ثم حدد عدد الصفوف والأعمدة والجرعة.حفظ تكوين القالب كملف في البرنامج. انتقل إلى المنطقة التي تم إنتاج نمط المرجع فيها، وضبط التركيز على الموضع المثالي Z. ثم، حدد تشغيل لبدء تشغيل ضوئي.وحدات التصميم تتحول من الأحمر إلى الأزرق كما يتم الانتهاء من photopatterning. إزالة الضوئي من microwells عن طريق غسلها ثلاث مرات مع 20 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. بعد الغسيل الأخير، وإزالة 18 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني من كل microwell، وإضافة 20 ميكرولترات من محلول بروتين ECM.احتضان الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 إلى 30 دقيقة، مع التأكد من حمايته من الضوء. بعد ذلك، قم بإزالة 15 ميكرولترات من محلول بروتين ECM، وغسل الويلات الدقيقة ثلاث مرات باستخدام 20 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. لمنع الربط المتبادل ، أضف 20 ميكرولترات من PLL -PEG ، أو BSA ، إلى microwells ، واحتضان الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، في الظلام.ثم، إزالة 15 ميكرولترات من وكيل حجب، وغسل جميع microwells ثلاث مرات مع 20 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. إزالة 18 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني، وإضافة 5 ميكرولترات من الضوئيات إلى كل microwell، وضمان أن الضوئيينيتات هو متجانس على سطح كامل من microwells. انتقل إلى أول ميكروويل، ثم قم بتحميل تكوين القالب المحفوظة مسبقاً.ثم، حدد الإجراءات التي سيتم منقوشة للجولة الثانية من photopatterning، مع التأكد من إلغاء تحديد الإجراءات من الجولة الأولى. بعد photopatterning، وإزالة PLPP عن طريق الغسيل مع برنامج تلفزيوني. ثم، احتضان لمدة 20 دقيقة مع محلول بروتين ECM الثاني، وغسل microwells ثلاث مرات مع 20 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.استخدام مجهر epifluorescence لتصور وصورة الأنماط المطبوعة. عندما تكون جاهزة لطبقة الخلايا، إضافة ملليلتر واحد من المتوسطة مع الخلايا إلى الزجاج الداخلي جيدا، مع التأكد من تغطية جميع microwells. ووضع طبق الثقافة في 37 درجة مئوية، وحاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪.لضمان أن الأنماط المتولدة هي تمثيل دقيق للقالب، يتم الحصول على قياسات كثافة الفلوريسنس على طول المشارب، ومن منطقة خلفية مقابلة فوق كل شريط. يتم تحقيق أنماط صغيرة محددة قابلة للاستنساخ تتراوح بين 20 إلى 2 ميكرومتر في العرض ، ولكن يمكن ملاحظة تأثير الحافة عند طباعة ميزات 20 ميكرومتر أو أوسع. يتم الحصول على تركيزات البروتين المحددة إما عن طريق احتضان مع تركيزات متفاوتة من البروتين، أو اختلاف جرعة الليزر التي تستخدم لشق الفيلم antiadhesive.كثافة الليزر يتناسب مع مستوى الرمادي القالب، وتوليد التدرجات من الإضاءة الأشعة فوق البنفسجية. قياس ملف تعريف شدة الفلوريسين على طول شريط التدرج، هو خطي في قالب النمط، وفي نمط التدرج المولد. يمكن استخدام هذا البروتوكول لإنشاء أنماط صغيرة مع بروتينات متعددة في نفس الميكويل ، مثل الأنماط المتقاطعة مع خطوط أفقية من الليفية ، وخطوط عمودية من اللامينين.ولكن خطوة عرقلة ضرورية لمنع ربط عبر البروتينات. ويمكن بعد ذلك أنماط عبر ولدت تستخدم لمقايس الخلوية مع خطوط الخلايا العصبية، أو خلايا CAD، أو الخلايا العصبية الأولية، DRGs الفئران. عند تنفيذ هذا البروتوكول، فإن أهم الجوانب التي يجب تذكرها هي القيام بمعايرة النظام المناسبة، وعدم السماح للميكرويات بالجفاف أثناء خطوات الغسيل المتعددة، واستخدام المعايير الصحيحة لاحتضان البروتين والحجب.عادة ما ينطوي تحليل سلوك الخلية على المجهر ، مثل الفلوريسنس ، الفاصل الزمني ، AFM. ويمكن أن يشمل التوصيف الآخر أساليب كيميائية حيوية أخرى، مثل تحديد سمات التعبير الجيني.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

باستخدام المنهج المقارن الأنواع المعنية بالتحقيق في البيولوجيا العصبية للردود الأبوية

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors.  Using animal models to accomplish ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

بعد تضمين التعريف Immunogold من البروتينات متشابك في الثقافات شريحة الحصين

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; النظام النموذجي للدراسات Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

وصفها الفرق من سطح الخلية والمنضوية البروتينات الأجسام المضادة بعد تغذية الخلايا العصبية مثقف لايف

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

عزل CA1 النووي المخصب الكسور من شرائح الحصين لدراسة تعتمد على نشاط استيراد النووية من رسول البروتينات Synapto النووية

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

النظام الشمي كنموذج لدراسة أنماط نمو محور عصبي ومورفولوجيا<em&gt; في فيفو</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

عن طريق القنوات الخطي الاغاروز لدراسة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات الزحف السلوك

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

في الرحم النهج Electroporation لللدراسة استثارة الخلايا العصبية القطعان والربط وحيدة الخلية

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

زيادة تعتمد على الوقت في استجابة الشبكة لتحفيز الثقافات خلية الخلايا العصبية على صفائف الدقيقة الكهربائي

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

في فيفو يسبر ميكرودياليسيس طريقة لتجميع البروتينات خارج الخلية كبيرة من الدماغ السائل الخلالي مع الوزن الجزيئي عالية وقف إنتاج المواد الانشطارية

In vivo microdialysis is a powerful technique to collect ISF from awake, freely-behaving animals based on a dialysis principle. While microdialysis is an ...